云南邊貿進口即食食品中金黃色葡萄球菌的分離與鑒定

晏明興，陳蕓，呂廷保，關鼎儒，李杜慧，何俊蓉，梁微，楊玲春*，胡永金*，朱仁俊*

1(云南農業大學 食品科學技術學院，云南 昆明，650000)2(昆明海關技術中心，云南 昆明，650000) 3(昆明海關，云南 昆明，650000)

邊貿食品是指相連兩國在一定的邊界范圍和一定金額范圍內免稅銷售的食品，云南邊貿進口食品是云南邊境貿易經濟中的重要組成部分，它具有食品來源廣，銷售和從業人員復雜等特點[1-3]。根據昆明海關調查表明，目前云南進口的邊貿食品涵蓋20余類300多個品種，以糖果和巧克力、糕點、果蔬干、飲料、果脯5大類加工食品和大米、玉米、冷凍動物產品等動植物源性食品為主[4]。同時云南擁有4 061公里邊界線，100多個邊民互市點，是我國與東南亞4國的重要交通要道。利用云南邊境地區特殊的地理位置，大力發展云南邊境特色經濟“邊貿食品”貿易，對促進我國云南邊境地區城鎮化發展、穩邊、固邊和富邊有著重要的作用[5-6]。隨著近年來云南邊境貿易經濟和邊境游的快速發展，邊貿進口食品安全的防控變得越來越重要，其中食源性致病菌尤為重要。

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)屬于葡萄球菌屬(Staphylococcus)，是一種廣泛存在于自然界中的常見食源性致病菌[7-8]。金黃色葡萄球菌引起食物中毒的原因是其會產生多種毒素和侵襲性酶，其中金黃色葡萄球菌分泌的毒力因子主要為溶血毒素、殺白細胞素、毒性休克綜合癥毒素-1、腸毒素、表皮剝脫毒素、耐熱核酸酶、血漿凝固酶等[9-10]。由于金黃色葡萄球菌毒性強、分布廣和耐高溫等特性，近年來世界各國都加強了對金黃色葡萄球菌的研究，從它的檢測方法、耐藥性、產毒性、分布狀況以及基因層面等進行了全面研究[11-13]。

本研究從云南邊貿進口即食食品出發，通過對樣品中金黃色葡萄球菌進行檢測和鑒定，了解云南邊貿進口食品中金黃色葡萄球菌的污染狀況。并通過16S rDNA分析其遺傳進化，了解9株金黃色葡萄球菌之間的同源性和遺傳進化差異。為全面了解云南邊貿進口食品食源性致病菌污染狀況和制定云南邊貿食品安全防控措施提供理論技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗樣品來源于云南河口、瑞麗、金水河、畹町以及天保5個邊境口岸城市的農貿市場、街邊小販和進口食品特色店的云南邊貿進口即食食品。

金黃色葡萄球菌來源于云南邊貿進口即食食品的篩選和分離。

Baird-Parker瓊脂、BHI肉湯、血瓊脂平板、凍干血漿、TSA瓊脂，廣東環凱微生物科技有限公司；GP鑒定卡、無菌鹽水(質量分數為0.45%～0.50%NaCl,pH 4.5～7.0),梅里埃診斷產品(上海)有限公司。

1.2 儀器與設備

AC2-5S1生物安全柜,ESCO Airstream公司；LTI-700W恒溫培養箱,東京理化器械株式會社；Vortex 2渦旋混勻儀,艾卡(廣州)儀器設備有限公司；濁度計、全自動微生物鑒定系統VITEK2-compact、PREVI Color Gram全自動革蘭氏染片儀,生物梅里埃；Bagmixer 400cc均質器,法國INTERSCIENCE公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗樣品的采集

樣品的采集方案參考GB 4789.1—2016設計[14]，隨機采樣于云南邊境口岸城市河口、瑞麗、金水河、天保和畹町，采樣地點為當地的農貿市場、街邊小販和邊貿食品專賣店。采好的樣品經無菌自封袋密封后，由昆明海關技術中心微生物實驗室進行檢驗和鑒定。

1.3.2 金黃色葡萄球菌檢測與分離

參照GB 4789.10—2016[15]對樣品進行金黃色葡萄球菌的檢驗和分離鑒定。通過金黃色葡萄球菌的選擇性和鑒別培養基，挑選出符合金黃色葡萄球菌典型菌落特征和顯微形態的可疑菌株。

1.3.3 金黃色葡萄球菌鑒定

對篩選出的可疑菌株進行溶血試驗、血漿凝固酶試驗、全自動微生物生化鑒定系統和革蘭氏染色試驗。

1.3.4 金黃色葡萄球菌VITEK2鑒定

將可疑金黃色葡萄球菌接種于TSA瓊脂培養24 h 后，通過GP鑒定卡進行全自動微生物鑒定系統VITEK2-compact的鑒定。

1.3.5 金黃色葡萄球菌16S rDNA測序鑒定

將確證過的菌株送到北京擎科生物科技有限公司昆明分公司進行16S rDNA測序。16S rDNA擴增引物為1492R和27F，引物序列分別為27F：(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)；1492R：(5′-GGC TACCTTGTTACGACTT-3′)[16]。根據劉康軍等[17]、李英軍等[18]、郝悅等[19]的PCR實驗參數，本次研究PCR反應體系25 μL：MIX 12.5 μL，dd H2O 9.5 μL，上下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，PCR反應條件為：95 ℃ 預變性5 min，(95 ℃，30 s，55 ℃，30 s，72 ℃，1 min 40 s)×34，72 ℃，5 min。對擴增產物進行測序，測序結果與NCBL數據庫進行對比，進一步確證菌株。

1.3.6 構建金黃色葡萄球菌系統發育樹

由1492R和27F引物擴增出的16S rDNA測序，用ContigExpress拼接測序結果。將整理好的序列用BioEdit進行格式轉換，用Clustalx的Alignment對測序結果進行分析，并利用MEGA的Neighbor Joining模式構建系統發育樹。

1.3.7 金黃色葡萄球菌16S rDNA序列同源性分析

分別將9株金黃色葡萄球菌的16S rDNA測序結果導入NCBI的GenBank數據庫中進行比對，并從NCBI的GenBank數據庫中挑選同源性高和出現頻率相同的10株金黃色葡萄球菌16S rDNA和本次實驗的序列進行對比，結果用MEGA的Distnce模式構建細菌之間的遺傳差異性和同源性。

1.4 數據分析

通過ContigExpress、Excel、MEGA、NCBI等軟件對結果進行分析。

2 結果與分析

2.1 云南邊貿進口食品樣品采集

本次實驗采集的樣品主要來源于東南亞的越南、緬甸、老撾和泰國4國，共采集進口邊貿食品樣品459份。其中越南食品257份，緬甸食品84份，老撾食品44份，泰國食品64份，其他來源食品10份。并根據采集樣品所具有的共同特性，將采集好的459份邊貿進口即食食品樣品分為糕點及餅干、調味品、糖果與巧克力、果蔬干制品、糧食制品、堅果、飲料、水產品制品、膨化食品以及罐頭制品，采樣結果見表1。

表1 樣品采集 單位：份

2.2 云南邊貿進口即食食品中金黃色葡萄球菌的分離與鑒定結果

對459份云南邊貿進口即食食品進行金黃色葡萄球菌的檢測，其中2份樣品檢出金黃色葡萄球菌可疑菌株，并從2份陽性樣品中分離出可疑黃色葡萄球菌9株，其中從泰國巧克力食品上挑選出4株并命名為SA-1、SA-2、SA-3、SA-4，從越南椰子糖上挑選出5株，并命名為SA-5、SA-6、SA-7、SA-8、SA-9。對9株可疑金黃色葡萄球菌進行鑒定，結果發現，9株可疑金黃色葡萄球菌都發生溶血性反應、血漿凝固酶反應為陽性、全自動微生物生化鑒定系統43種生化試劑生化分型鑒定結果符合金黃色葡萄球菌、VITEK2-compact鑒定陽性，同時9株金黃色葡萄球菌DNA擴增產物的分子質量在1 500 bp左右，16S rDNA鑒定為金黃色葡萄球菌，鑒定結果的置信度都在90%～100%，詳細信息見表2和圖1。

表2 云南邊貿進口即食食品中金黃色葡萄球菌分離及鑒定Table 2 identification and isolation of Staphylococcus aureus in ready-to-eat food imported from Yunnan border trade

a-革蘭氏染色;b-溶血性;c-16S rDNA電泳圖圖1 鑒定結果Fig.1 Identification result注：M為marker；1～9為9株金黃色葡萄球菌SA-1～SA-9

2.3 云南邊貿進口即食食品中金黃色葡萄球菌污染狀況

從459份云南邊貿進口即食食品中的2份樣品中檢出金黃色葡萄球菌，總檢出率為0.43%(2/459)。2份陽性樣品均為糖果和巧克力，均采集于云南天保口岸，在糖果和巧克力中的檢出率為3.8%。其中一份巧克力來源于泰國，其檢出率為本次實驗泰國食品總數的1.5%，一份越南椰子糖來源于越南，其檢出率為本次實驗越南食品總數的0.38%，詳細信息見表3。與楊菁等[20]對2016—2018年云南省食品中金黃色葡萄球菌污染狀況研究中金黃色葡萄球菌總檢出率為2.60%相比，本次云南邊貿進口食品中金黃色葡萄球菌的總檢出率較低，但因越南和泰國進口邊貿食品的樣品采集總數有差異，不能進一步分析兩國進口食品的污染狀況。從樣品種類來分析云南邊貿進口食品中金黃色葡萄球菌的污染狀況，本次金黃色葡萄球菌都來源于邊貿進口糖類食品。同時通過本次研究，說明云南邊貿進口食品中存在一定的金黃色葡萄球菌污染風險。

表3 云南邊貿進口即食食品中金黃色葡萄球菌Table 3 Staphylococcus aureus in ready-to-eat food imported from Yunnan border trade

2.4 16S rDNA測序結果分析

2.4.1 系統發育樹

為了解云南邊貿進口食品中金黃色葡萄球菌的污染來源，通過16S rDNA序列來分析菌株之間的遺傳進化差異，來判斷菌株之間來源差異。用從云南邊貿進口食品中分離的9株金黃色葡萄球菌的16S rDNA序列構建系統發育樹(圖2)。結果發現，9株從云南邊貿進口食品中檢出的金黃色葡萄球菌可分為3簇，其中SA-2、SA-7為一簇，SA-5、SA-3、SA-4為一簇，SA-6、SA-9、SA-1、SA-8為一簇。并對其遺傳進化關系分析，發現9株金黃色葡萄球菌與所檢出樣品來源國籍無明顯的遺傳進化差異關系，說明9株菌株可能來源于境內食品在運輸和銷售過程中的二次污染。

為泰國巧克力食品上分離出的菌株；為越南椰子糖上分離出的菌株圖2 九株金黃色葡萄球菌遺傳進化關系Fig.2 Genetic evolution of 9 strains of Staphylococcus aureus

2.4.2 同源性分析

為了進一步了解云南邊貿進口食品中金黃色葡萄球菌的污染來源，將拼接好的9株金黃色葡萄球菌

16S rDNA序列分別與NCBI進行比對，挑選出10株相似性最高且出現頻率相同的金黃色葡萄球菌菌株(NR115606.1、NR113956.1、NR036828.1、NR037007.1、NR043146.1、NR036904.1、NR027519.1、NR024665.1、NR113957.1、NR118450.1)進行同源性和遺傳差異性的分析,如表5所示，結果表明，19株金黃色葡萄球菌的遺傳差異為0～0.79，同源性>93%，說明9株從越南和泰國邊貿進口食品中檢出的金黃色葡萄球菌之間遺傳差異小、同源性高，進一步說明9株菌株可能來源于境內食品在運輸和銷售過程中的二次污染。

表5 同源性分析Table 5 Homology analysis

3 討論與結論

隨著我國“一帶一路”、西部大開發和開放力度的加大，地處我國西南邊陲與東南亞3國相連的云南近年來邊境貿易經濟發展快速，其中具有異國特色的進口邊貿食品貿易就是重要的組成部分。隨著我國對進口即食食品需求的增加，人們對進口食品安全越來越關注[21]。例如，董國富等[22]在1993年就開始針對廣西提出中越邊境貿易中食品衛生安全狀況的研究，劉本軍[23]提出了“堵疏結合, 疏導為主, 嚴格把關, 重點幫扶”的邊境食品安全監管新途徑等管理政策。同時近年科研工作者已開始進行針對邊貿進口食品中食源性致病菌污染狀況的研究，王夢琦等[24]和何成偉等[25]均對進口食品中細菌污染狀況進行了研究。

本文對云南邊貿進口食品中金黃色葡萄球菌的研究，從對樣品的采集、檢驗、分離、鑒定，到進化同源性分析的一系列研究，保證了云南邊貿進口食品中金黃色葡萄球菌的具體來源和可溯源性。同時本次實驗經過GB 4789.10—2016、全自動微生物生化鑒定系統、微生物全自動鑒定儀VITEK 2-compact、16S rDNA測序多種鑒定方法同時鑒定，保障了檢驗結果的可靠性。

本文對云南4個邊境口岸的459份進口邊貿食品進行金黃色葡萄球菌檢測，其中陽性食品2份，檢出率占本次總樣品數的0.43%、糖類食品的3.84%。經過多元識別和遺傳進化關系分析，發現菌株之間不存在明顯的樣品來源進化差異，由此推測這些菌株的來源可能存在食品運輸、貯存和銷售過程中境內的二次污染。本研究為今后云南邊貿進口食品多種食源性致病菌檢測研究、構建云南邊貿進口食品食源性致病菌溯源技術、云南邊貿進口食品食源性致病菌安全預警平臺和制定邊貿食品食源性致病菌相關政策提供了一定的理論和技術支持。