酶標儀比色法檢測濁米酒中高級醇含量

袁國億，王春曉，何宇淋，邱樹毅

(貴州大學 釀酒與食品工程學院，貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州 貴陽,550025)

濁米酒是一種以糯米、大米、紅米或黑米等稻米為主要原料，配合酒曲和水釀造而成的傳統(tǒng)低度發(fā)酵型酒精飲料[1]。濁米酒因在發(fā)酵結(jié)束后不采用過濾工藝而呈現(xiàn)渾濁的外觀[2]，具有獨特的風味和較高的營養(yǎng)價值而深受大眾喜愛[3]。濁米酒發(fā)酵過程中微生物代謝產(chǎn)生的高級醇與米酒風味及其安全性息息相關(guān)，高級醇通常是指碳原子數(shù)超過2的一元醇類物質(zhì)[4]，主要有異丁醇、異戊醇[5]、苯乙醇[6]、正丙醇[7-8]等，高級醇是酒體中重要的呈香呈味物質(zhì)，但含量過高會使酒體呈現(xiàn)苦味等不良風味[9]，且具有較強的致醉性[10]，飲用后會出現(xiàn)“上頭”和嘔吐等不適癥狀[11-12]，對人體健康有毒害威脅[13]。據(jù)報道稱，以糧谷類原料釀制而成的酒，其高級醇質(zhì)量濃度須控制在0.2 g/100mL以下(以異丁醇、異戊醇計)[9]，而米酒中高級醇含量相對高于其他酒種[5,13]，因此，米酒中高級醇含量的快速精準檢測對控制米酒風味品質(zhì)意義重大。

高級醇的測定方法主要為氣相色譜法和分光光度法[14-15]：氣相色譜法可準確分析米酒中單一高級醇的含量[12]，并以各高級醇含量之和作為高級醇總量，但該方法需依賴昂貴的檢測耗材，如色譜柱等，且后期維護費用較高；分光光度法通常采用2種或2種以上高級醇的混合標準溶液來代表被測樣品中高級醇總含量，它不能準確檢測樣品中單個高級醇含量，檢測相對耗時且所需樣品量多(1 mL以上)。酶標儀比色法是基于朗伯-比爾定律實現(xiàn)對目標化合物的定量分析的一種檢測方法[16]，近年來廣泛應(yīng)用于食品安全檢測研究中[17-18]。與以往研究對酶標儀比色法的評價一致[19]，本研究在檢測中發(fā)現(xiàn)酶標儀比色法的主要優(yōu)點為樣品少(200 μL)、通量高(可同時掃描檢測96個樣品)、檢測速度快(1 s內(nèi)可出掃描結(jié)果)、準確度高等。本研究采用酶標儀比色法建立6種高級醇(異丁醇、異戊醇、β-苯乙醇、正丙醇、正丁醇、己醇)定量分析的標準曲線，在單一標曲分析和濁米酒氣相檢測結(jié)果的基礎(chǔ)上，建立6種高級醇不同配比的標準曲線，以期為濁米酒中高級醇含量的檢測提供快速準確的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

有機糯米，北京和雅堂食品有限公司；α-淀粉酶、糖化酶，北京索萊寶Solarbio公司；血球計數(shù)板，上海求精生化試劑儀器有限公司；異丁醇，天津瑞金特化學品有限公司；異戊醇，成都市科龍化工試劑廠；苯乙醇，上海麥克林生化有限公司；正丙醇，天津市致遠化學試劑有限公司；正丁醇，天津市富宇精細化工有限公司；己醇，阿拉丁；無水乙醇，天津市科密歐化學試劑有限公司；硫酸，重慶萬盛川東化工有限公司；對二甲氨基苯甲醛，天津市光復(fù)精細化工研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

顯微鏡Ti-s，日本尼康；YXQ-30SⅡ型立式壓力蒸汽滅菌鍋、SW-CT-IFD型潔凈工作臺、SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；DK-98-IIA型電熱恒溫水浴鍋，天津市泰斯特儀器有限公司；IMS-20制冰機，常熟市雪科電器有限公司；7890A氣相色譜儀，美國安捷倫；VARIOSKAN FLASH酶標儀，美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 試劑配制

對二甲胺基苯甲醛-硫酸溶液(質(zhì)量濃度5 g/L)：取0.25 g對二甲胺基苯甲醛，用95%～98%的硫酸定容至50 mL。

1 mg/mL單一高級醇標準溶液(以異丁醇為例)：稱取0.1 g異丁醇，加入50 mL色譜級無水乙醇，用蒸餾水定容至100 mL。

0.1 mg/mL單一高級醇標準溶液(以異丁醇為例)：吸取5 mL上述1 mg/mL異丁醇標準溶液，用蒸餾水定容至50 mL。

2種高級醇在不同體積配比下的組合溶液(質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL)：組合1，V(正丙醇)∶V(異丁醇)=1∶1；組合2，V(正丙醇)∶V(異戊醇)=1∶1；組合3，V(異丁醇)∶V(異戊醇)=1∶1；組合4，V(異丁醇)∶V(異戊醇)=1∶4；組合5，V(異丁醇)∶V(異戊醇)=2∶1；組合6，V(異丁醇)∶V(異戊醇)=1∶2。

6種高級醇(配比順序為異戊醇∶苯乙醇∶異丁醇∶正丙醇∶己醇∶丁醇)在不同體積配比下的混合標準溶液(質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL)：配比1為1∶1∶1∶0.6∶0.02∶0.02，配比2為2∶1∶1∶0.6∶0.02∶0.02，配比3為2∶1∶1.5∶0.6∶0.02∶0.02；配比4為1∶1∶0.6∶0.6∶0.02∶0.02；配比5為2∶1∶0.6∶0.6∶0.02∶0.02；配比6為1.5∶1∶0.6∶0.6∶0.02∶0.02。

1.4 實驗方法

1.4.1 米酒發(fā)酵實驗

準確稱取100 g糯米，加蒸餾水浸泡過夜，將浸泡米用4層紗布過濾，瀝干后放入500 mL三角瓶中，121 ℃滅菌20 min。冷卻后加入150 mL無菌水、1.89 g α-淀粉酶和0.56 g糖化酶，攪拌均勻，在 60 ℃水浴中酶解30 min制成糯米發(fā)酵培養(yǎng)基。將活化后的FBKL2.8022和FBKL2.8023酵母培養(yǎng)于10 mL的麥芽汁培養(yǎng)基中，在30 ℃條件下靜置培養(yǎng)過夜，通過血球計數(shù)板計數(shù)，按照1×106個/mL接種至糯米發(fā)酵培養(yǎng)基中進行米酒發(fā)酵，每個發(fā)酵建立2個平行。發(fā)酵溫度為30 ℃，每24 h記錄發(fā)酵液重量損失，當失重<0.2 g/d即認為發(fā)酵結(jié)束。將發(fā)酵液經(jīng)紗布過濾后取100 mL轉(zhuǎn)移至500 mL蒸餾瓶中，加入100 mL蒸餾水和5顆玻璃珠進行蒸餾并收集餾出液，當餾出液達100 mL時停止蒸餾，將餾出液保藏于4 ℃冰箱中用于后續(xù)高級醇含量的檢測[20]。

1.4.2 氣相色譜法檢測高級醇含量

氣相色譜條件：色譜柱DB-FFAP (30 m×0.25 mm，0.25 μm)，進樣口溫度260 ℃，程序升溫到45 ℃保持3 min，以16 ℃/min速率升溫到120 ℃并保持3 min，再以50 ℃/min的速率升溫至220 ℃并保持5 min，F(xiàn)ID檢測器的檢測溫度為260 ℃。氫氣流速30 mL/min，空氣流速300 mL/min。進樣方式為分流進樣，進樣量1 μL，分流比為40∶1[12]。標準曲線建立：配制8個梯度濃度的正丙醇、異丁醇、異戊醇、己醇、苯乙醇和正丁醇的混合標準溶液，以各組分標樣梯度濃度為橫坐標，測定峰面積為縱坐標，建立標準曲線，得到6種高級醇的定量線性關(guān)系[12]。樣品檢測：吸取2 mL蒸餾后的米酒樣品，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后進行氣相色譜分析，每個樣品檢測3次，用變異系數(shù)(標準偏差/平均值)評估該方法的檢測精密度。

1.4.3 酶標儀比色法檢測高級醇含量

1.4.3.1 酶標儀比色法檢測波長和時間研究

目前已有的研究報道采用比色法檢測高級醇時所用波長不盡相同，有495[11,21-22]、500[23]、520[24]和425 nm[15]等。本研究按照GB/T 5009.48—2003《蒸餾酒與配制酒衛(wèi)生標準分析方法》中4.4雜醇油檢測步驟建立標準曲線[14]。利用酶標儀測定了408、450、500和520 nm下1 h內(nèi)的吸光度值，分析所建立標準曲線R2受檢測波長和檢測時間的影響。

1.4.3.2 標準曲線的構(gòu)建

單一標準曲線(0～0.05 mg)的建立：分別吸取0.1 mg/mL的高級醇標準溶液0、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 mL置于10 mL比色管中；各比色管中加蒸餾水至1 mL，搖勻并放入冷水中冷卻，沿管壁緩慢加入2 mL對二甲胺基苯甲醛-硫酸溶液，搖勻放入沸水浴中加熱15 min后取出，立即放入冰浴中冷卻并加入2 mL蒸餾水混勻[14]。使用酶標儀于特定波長下檢測吸光度值，建立高級醇質(zhì)量與吸光度值之間的標準曲線。單一標準曲線(0～1 mg)的建立：分別吸取質(zhì)量濃度為1 mg/mL的高級醇標準溶液0、0.02、0.05、0.2、0.5、0.75、1 mL置于10 mL比色管中，后續(xù)步驟與上述一致。混合標準曲線(0～0.05 mg)的建立操作步驟與同質(zhì)量范圍內(nèi)單一標準曲線的操作步驟一致，區(qū)別在于吸取的高級醇標準溶液組成不同。根據(jù)2.2中氣相色譜法對濁米酒中高級醇含量的檢測結(jié)果，設(shè)置了6種配比關(guān)系(如1.2中所述)，建立每一種配比條件下的標準曲線，為酶標儀比色法檢測米酒中高級醇含量提供線性依據(jù)。在標準曲線構(gòu)建的線性方程中，擬合度R2是反應(yīng)變量之間相關(guān)系數(shù)密切程度的指標，通常認為擬合度>0.99時所構(gòu)建的線性方程線性較好。

1.4.3.3 樣品檢測

吸取1.0 mL蒸餾后的米酒樣品加蒸餾水定容至10 mL，混勻后吸取0.30 mL置于10 mL比色管中，后續(xù)操作與2.2中標準曲線構(gòu)建時所用步驟一致。米酒樣品中雜醇油的含量按公式(1)計算：

(1)

式中：X，試樣中雜醇油質(zhì)量濃度，g/100mL；m，測定試樣稀釋液中雜醇油的質(zhì)量，mg；V2，試樣體積，mL；V1,測定用試樣稀釋體積，mL；

2 結(jié)果與分析

2.1 氣相色譜法檢測濁米酒中高級醇含量

采用氣相色譜外標法建立的標準曲線除苯乙醇的R2為0.99以上外，其他高級醇的R2均達到0.999以上，線性可靠(表1)。定量檢測FBKL2.8022發(fā)酵的米酒樣品中6種高級醇質(zhì)量濃度為277.75 mg/L(表2)，其中，異戊醇、苯乙醇、異丁醇和正丙醇為發(fā)酵米酒中主要的4種高級醇，異戊醇、苯乙醇、異丁醇、正丙醇、己醇、丁醇之間的比例接近配比2。定量檢測FBKL2.8023發(fā)酵的米酒樣品中6種高級醇質(zhì)量濃度為169.66 mg/L(表2)，異戊醇、苯乙醇、異丁醇和正丙醇為發(fā)酵米酒中主要的4種高級醇，異戊醇、苯乙醇、異丁醇、正丙醇、己醇、丁醇之間的比例接近配比4或配比6。除FBKL2.8023發(fā)酵米酒樣品中的苯乙醇外，檢測其他高級醇的變異系數(shù)均<10%，說明該方法精密度較高，重現(xiàn)性較好[24]。

表1 高級醇標準曲線(氣相色譜法)Table 1 Standard curves of higher alcohols established by gas chromatography method

表2 濁米酒中高級醇含量(氣相色譜法)Table 2 Higher alcohols content in turbid rice wine detected by gas chromatography method

2.2 酶標儀比色法檢測濁米酒中高級醇含量

2.2.1 檢測波長和時間確定

如圖1-a所示，4種檢測波長下1 h內(nèi)所建立標準曲線的R2受檢測時間的影響較小，受檢測波長影響較大，其中520 nm時繪制的1 h內(nèi)標準曲線的R2均>0.99，明顯高于其他檢測波長獲得的R2，因此本研究選定520 nm為酶標儀比色法檢測高級醇含量的檢測波長。如圖1-b所示，在520 nm處，吸光度受檢測時間的影響較小，0～15 min內(nèi)吸光度輕微下降，15 min之后趨于穩(wěn)定，因此本研究選定15 min為酶標儀比色法檢測高級醇含量的檢測時間。

a-不同波長和時間獲取的R2值變化曲線;b-520 nm檢測吸光度隨檢測時間變化曲線圖1 酶標儀比色法檢測波長及時間的確定Fig.1 The determination of measurement wavelength and time in the colorimetric method of microplate reader

2.2.2 高級醇標準曲線的建立

在0～0.05 mg的低質(zhì)量范圍內(nèi)(表3，圖2-a)，異丁醇、異戊醇、己醇的線性較好，線性擬合度均>0.99；苯乙醇、正丁醇線性較差，但在此范圍內(nèi)其吸光度呈現(xiàn)上升趨勢，即測定酒體中高級醇總含量時，苯乙醇和正丁醇的存在可能會影響其他高級醇含量的最終測定；正丙醇標準曲線幾乎完全重合于X軸，與空白對照數(shù)據(jù)相差不大，即在此質(zhì)量范圍內(nèi)正丙醇的存在可能不會影響到其他高級醇含量的測定。但在0～1 mg的高質(zhì)量范圍內(nèi)(表3，圖2-b)，正丙醇和苯乙醇擬合度明顯提高，異丁醇、異戊醇和苯乙醇的線性擬合度均達到0.99以上。通過對比發(fā)現(xiàn)(表3)，單一高級醇在不同質(zhì)量范圍內(nèi)呈現(xiàn)的標準曲線線性方程斜率差異較大，因此建立標曲前需根據(jù)具體樣品中高級醇的濃度范圍建立對應(yīng)質(zhì)量范圍的標準曲線，樣品中高級醇的濃度范圍可通過氣相色譜外標法或酶標儀比色法來確定。

為進一步分析正丙醇對濁米酒中主要高級醇含量檢測的影響，本研究分別建立了正丙醇與異丁醇或異戊醇在1∶1的配比條件下0～0.05 mg的標準曲線(表3，圖2-c)。結(jié)果表明正丙醇與異丁醇1∶1的混合標曲線性較好(R2=0.995 4)，而正丙醇與異戊醇1∶1的混合標曲線性較差(R2=0.862 1)，此外，2組混合標曲的線性方程的斜率均明顯不同于異丁醇和異戊醇在相同質(zhì)量范圍內(nèi)的單一標準曲線。因此，單一正丙醇在0～0.05 mg雖然沒有呈現(xiàn)明顯吸光度值，但與異丁醇或異戊醇1∶1混合后會影響對2種高級醇質(zhì)量的檢測。

采用分光光度法測定酒體中高級醇通常是以異丁醇和異戊醇體積之和表示，V(異丁醇)∶V(異戊醇)=1∶4[18]、V(異丁醇)∶V(異戊醇)=2∶5[23]等，因此，本研究建立了異丁醇與異戊醇在4種不同配比下的標準曲線(表3，圖2-c)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)異丁醇和異戊醇配比為1∶1和2∶1時所建標準曲線斜率接近于異丁醇在同質(zhì)量范圍內(nèi)的單一標曲，而當異丁醇和異戊醇配比為1∶2和1∶4時所建標準曲線斜率接近于異戊醇在同質(zhì)量范圍內(nèi)的單一標曲，并且線性擬合度隨異丁醇占比的增加而提高，隨異戊醇占比的增加而下降。因此，建立混合標曲前需根據(jù)具體樣品中不同高級醇的濃度范圍建立對應(yīng)配比的標準曲線，樣品中不同高級醇的質(zhì)量濃度范圍可通過氣相色譜外標法或酶標儀比色法來確定。

根據(jù)氣相色譜法對FBKL2.8022和FBKL2.8023發(fā)酵濁米酒中高級醇含量的檢測結(jié)果，本研究共建立了6條不同高級醇配比的混合標準曲線(表3，圖2-d)，每一條標準曲線擬合度均達到0.99以上，其中配比2達到0.999以上，說明線性關(guān)系較好。平均值標準曲線(表3，圖2-d)根據(jù)配比1到配比6的平均吸光度值建立，其斜率接近配比1和配比5。此外，F(xiàn)BKL2.8022發(fā)酵濁米酒中6種高級醇的比例接近于本研究設(shè)定的標曲2，而FBKL2.8023發(fā)酵濁米酒中6種高級醇的比例接近于本研究設(shè)定的標曲4和標曲6。6條不同高級醇配比的混合標準曲線斜率的差異進一步說明了所需檢測樣品中不同高級醇含量配比對酶標儀比色法檢測結(jié)果的影響，因此，需要根據(jù)預(yù)實驗檢測樣品中不同高級醇的質(zhì)量濃度范圍來選擇準確的混合標曲進行樣品檢測分析。

2.2.3 濁米酒中高級醇含量檢測

本研究采用酶標儀比色法根據(jù)3.2.1建立的檢測條件分析FBKL2.8022和FBKL2.8023發(fā)酵濁米酒中高級醇的含量，檢測到FBKL2.8022吸光度為0.042 233 667，F(xiàn)BKL2.8023吸光度為0.018 592 8，標準偏差均<0.001 5，變異系數(shù)均<3.1%，說明酶標儀比色法檢測精密度高，重現(xiàn)性好。根據(jù)6條不同配比標準曲線和平均值標準曲線計算所得發(fā)酵濁米酒中高級醇總量如表4所示，本研究采用配比接近樣品的混合標曲進行6種高級醇含量的計算，因此配比2標準曲線用于計算FBKL2.8022發(fā)酵濁米酒，各組分高級醇標準偏差在0.06%～3.94%，而配比4用于計算FBKL2.8023發(fā)酵濁米酒，各組分高級醇標準偏差在0.72%～1.58%。酶標儀比色法和氣相色譜法檢測同一米酒樣品時，酶標儀比色法對各組分高級醇的檢測結(jié)果略高于氣相色譜法(圖3)，采用軟件SPSS 21.0中單因素方差分析進行2種檢測方法的差異顯著性統(tǒng)計時發(fā)現(xiàn)，樣品為FBKL2.8022發(fā)酵濁米酒時單一高級醇和高級醇總量的P值均<0.05，說明差異顯著，而樣品為FBKL2.8023發(fā)酵濁米酒時單一高級醇和高級醇總量的P值均>0.05，說明差異不顯著，由表4可知導(dǎo)致FBKL2.8023發(fā)酵濁米酒檢測方法差異不顯著的主要原因可能是發(fā)酵平行樣品的酶標儀比色法的標準偏差較大。

a-6種高級醇0～0.05 mg單一標準曲線；b-4種高級醇0～0.1 mg單一標準曲線；c-2種高級醇不同配比0～0.05 mg混合標準曲線；d-6種高級醇不同配比0～0.05 mg混合標準曲線圖2 酶標儀比色法建立的單一和混合高級醇標準曲線圖Fig.2 Standard curves of single and mixed higher alcohols established by the colorimetric method of microplate reader

表3 高級醇標準曲線(酶標儀比色法)Table 3 Standard curves of higher alcohols established by colorimetric method of microplate reader

表4 濁米酒中高級醇含量(酶標儀比色法)Table 4 Higher alcohols content in turbid rice wine detected by the colorimetric method of microplate reader

圖3 酶標儀比色法和氣相色譜法對濁米酒中高級醇含量檢測對比Fig.3 Comparison of the higher alcohols content in turbid rice wine examined by the colorimetric method of microplate reader and gas chromatography

3 結(jié)論與展望

采用酶標儀比色法測定濁米酒中高級醇含量的最佳檢測條件為520 nm、15 min，此條件下建立的混合標準曲線線性關(guān)系良好，而在單一標曲中正丙醇、苯乙醇、正丁醇標準曲線線性稍差，但擬合度會隨質(zhì)量范圍增加而得到改善。通過配比2和配比4對應(yīng)混合標曲所檢測的濁米酒中高級醇質(zhì)量濃度高于氣相色譜法的檢測結(jié)果，這可能與酒樣中除異丁醇、異戊醇、苯乙醇、正丙醇、正丁醇、己醇外還存在其他高級醇而引起顯色效果加深有關(guān)，這一推論還需進一步的檢測來證實。

分光光度法測高級醇通常以V(異丁醇)∶V(異戊醇)=1∶4 來表示[14]，但在實際情況中，由于酒體中不僅只含有異丁醇和異戊醇，其他高級醇的存在也會影響檢測吸光度值，因此此法不能準確分析濁米酒中高級醇總含量。針對不同濁米酒樣品，可以通過氣相色譜法摸索樣品中主要高級醇的比例，建立該比例下酶標儀比色法檢測的混合標準曲線，以此檢測高級醇含量。根據(jù)本研究結(jié)果，酶標儀比色法檢測結(jié)果受不同高級醇含量的影響較大，且無法直接檢測濁米酒中單一高級醇含量。進一步的研究需要解決酶標儀比色法對不同高級醇的定性分析，這對于采用酶標儀比色法快速檢測濁米酒品質(zhì)具有重要意義。