微波消融聯合載阿霉素微泡靶向擊破在小鼠H22 肝癌治療中的效果觀察

范 蕊，李田寬，王 超，董 瑞，陳 琪，郭金和

肝細胞癌（HCC）是占全球發病率第6 位惡性腫瘤［1］。對于巴塞羅那臨床肝癌（Barcelona Clinic Liver Cancer，BCLC）分期0～A 期肝癌，消融治療是最常用策略［2］。 單發肝癌病灶＜2 cm 患者消融后總生存率與手術切除術相比無顯著差異，但消融總體獲益優于外科切除，因此推薦為一線治療［3］。諸多臨床研究顯示微波消融（MWA）治療小肝癌（＜3 cm）與射頻消融（RFA）相比具有相同效果和安全性［4］。 由于肝臟是富血供臟器，MWA 與RFA 相比，可在更短時間內形成更大消融區，并在肝組織內形成長徑達10 cm 消融范圍［5］。 目前在布針策略上尚無統一標準，在消融大肝癌（＞5 cm）或外形極不規則病灶后殘留活性腫瘤組織是MWA 術后復發的主要原因，因此迫切需要有效的輔助治療［6］。 低頻超聲靶向擊破載藥微泡是一種新興的腫瘤靶向給藥技術［7］。 本研究旨在觀察超聲靶向擊破載阿霉素微泡能否彌補MWA 適形性不足，嘗試新的肝癌聯合治療方案并評估其抗腫瘤效果。

1 材料與方法

1.1 實驗器材

無特定病原體（SPF）級5 周齡雄性BALB/c 小鼠（上海西普爾-必凱實驗動物公司），小鼠H22 肝癌細胞株（中科院上海生命科學研究院細胞資源中心），二棕櫚酰磷脂酰膽堿（DPPC）、二棕櫚酰基磷脂酰乙醇胺（DPPE）（日本精化株式會社），鹽酸阿霉素（大連美侖生物技術有限公司），六氟化硫（SF6）（安徽強源氣體公司），磷酸緩沖液（PBS）、1640 培養基（RPMI）（美國HyClone 公司），胎牛血清（FBS）（美國Gibco 公司），兔抗鼠CD31、Ki-67 抗體（美國CST 公司），旋轉蒸發儀（杭州大衛科教儀器公司），超聲細胞破碎儀（美國Spring 科學公司），Zeta 電位及粒度分析儀（美國Brookhaven 儀器公司），UV-3600 紫外分光光度計（日本島津公司），BX53 光學顯微鏡（日本Olympus 公司），高速離心機、KY-2000 MWA 儀（南京康友醫療科技公司），WED-100 超聲治療儀（深圳市威爾德醫療電子公司）。

1.2 微泡制備與檢測

取DPPC 25 mg 和DPPE 10 mg 溶解于10 mL甲醇與三氯甲烷（2∶3）混合液，取10 mg 阿霉素溶解于3 mL 雙蒸水，磷脂類混合液與阿霉素溶液經聲振儀混勻后倒入圓底燒瓶，負壓蒸發后形成脂質膜；向燒瓶中加入PBS 2 mL，聲振儀震蕩后附壁脂質膜洗脫于PBS 中形成混懸液，吸取混懸液至5 mL U 型管，置于充滿SF6的超聲細胞破碎儀內，經高頻振蕩形成微泡；300 r/s 離心10 min 后收集表層微泡溶解于PBS，所得即為載阿霉素微泡，同法制備空白無載藥微泡。 光學顯微鏡下觀察微泡形態，Zeta 分析儀檢測載阿霉素微泡粒徑分布和平均電位。 配制阿霉素標品梯度濃度溶液，紫外分光光度計建立標準曲線，通過檢測載藥微泡制備過程收集的游離液中藥物含量，計算載藥微泡包封率（EE）、載藥量（DL）。EE＝（質量總阿霉素-質量游離阿霉素）/質量總阿霉素×100%；DL＝（質量總阿霉素-質量游離阿霉素）/質量磷脂×100%。

1.3 體外細胞流式實驗

取對數期生長H22 肝癌細胞培養于6 孔板內（每孔細胞5×106個，完全培養液2.5 mL），用移液槍向4 個孔內添加阿霉素溶液（250 μg/mL）各100 μL、8 個孔內添加載阿霉素微泡（1.8×108/mL）各100 μL；用低頻超聲探頭（1.0 MHz，2 W/cm2）向其中4 個載藥微泡孔輻照3 min，處理后6 孔板置于細胞培養箱中孵育4 h； 分開收集經上述不同處理的3 組細胞，PBS 液清洗3 遍，調整細胞濃度至5×106/mL 后取500 μL，流式細胞儀檢測細胞內阿霉素自發紅色熒光強度。

1.4 動物模型建立和實驗分組

H22 肝癌細胞置于含10%FBS 的1640 培養基，在37℃5%CO2培養箱中培養。 取對數期生長細胞并調整其濃度為5×106/mL，于每只實驗鼠右腋皮下注射0.2 mL 細胞懸浮液，等待成瘤。取荷直徑0.8～1.0 cm 皮下瘤且瘤體形狀規則的實驗鼠（體重18～22 g）72 只，4%水合氯醛腹腔注射麻醉后行MWA 術（功率為50 W，消融時長20 s，術后腫瘤周邊殘留活性區），構建不完全消融模型；經荷瘤鼠尾靜脈注射超聲對比劑SF6微泡（聲諾維）0.2 mL，計算仍有強化的殘余活性區體積（V）：V（mm3）=V總-V消。 將荷瘤鼠隨機分為4 組（每組18 只），均在不完全MWA 術后24 h（0 d）、4 d、8 d、12 d 接受后續治療——①單純MWA 組（A 組）作為空白對照，②尾靜脈注射阿霉素溶液（2 mg/kg）0.2 mL（B 組），③注射空白微泡（1.8×108/mL）0.2 mL（C 組），④注射載阿霉素微泡（1.8×108/mL）0.2 mL（D 組），其中C、D組在注射后立即于皮下瘤處放置低頻超聲探頭（1.0 MHz，2 W/cm2）行靶向輻照（占空比50%）3 min擊破微泡。 對比給藥治療前各組殘余腫瘤體積基線水平。

1.5 描繪腫瘤生長曲線與生存曲線

記錄每組隨機抽取的10 只鼠生存時間，Kaplan-Meier 法繪制生存曲線。 采用統計學方法比較各組平均生存期和最大生存期并分析結果。 每組中再隨機抽取4 只鼠，實驗24 h 起每3 天用游標卡尺測量腫瘤長短徑，計算腫瘤體積（TV）：TV（mm3）＝（長×寬2）/2，描繪腫瘤生長曲線，比較各組治療方案抑制腫瘤生長效果。

1.6 組織內藥物濃度檢測

每組余下4 只小鼠于末次給藥治療后24 h 處死，剝取心臟和腎臟；0.9%氯化鈉溶液擦凈組織表面后稱重、剪碎，研磨均勻后用0.9%氯化鈉溶液定容，配制10%均漿；超聲破碎儀處理30 min 后，離心取上清液，紫外分光光度計檢測阿霉素含量。

1.7 免疫組化染色

處死B 組、D 組鼠，立即剝離腫瘤大體標本，4%多聚甲醛溶液固定24 h；組織切片，行蘇木精-伊紅（HE）染色，CD31、Ki-67 免疫組化染色。 CD31 將血管內皮細胞染成棕黃色，20 倍鏡下分別由5 人各計數5 個視野，取平均值作為該標本微血管密度（MVD）值。 Ki-67 染色后細胞核出現棕黃色顆粒記為陽性細胞，低倍鏡下選擇每張切片中“高熱點”靶區，從中隨機選擇5 個高倍鏡視野，計數1 000 個腫瘤細胞內陽性細胞數并算出百分數，取平均值（%）作為Ki-67 增殖指數。

1.8 統計學分析

采用SPSS 22.0 軟件進行統計學分析。 連續數據以均數±標準差（±s）表示，不同組間比較用單因素方差分析和多重比較，兩組均數間比較用t 檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

制備的微泡觀察顯示，光鏡下可見分散、粒徑大小較均勻的球形微泡（圖1①），Zeta 粒徑儀檢測顯示微泡平均粒徑（2.93±0.012） μm（圖1②），平均電位（-2.72±0.26） eV。 紫外分光光度計法計算顯示，載阿霉素微泡包封率為（88.65±5.60）%，載藥量為（25.33±4.20）%。

圖1 球形微泡觀察和粒徑檢測情況

流式細胞儀檢測腫瘤細胞紅色熒光強度顯示，阿霉素溶液處理、經低頻超聲輻照的載阿霉素微泡處理的腫瘤細胞相對熒光強度分別為6.92±1.42、13.66±3.44，差異有顯著統計學意義（P=0.011）；載阿霉素微泡處理的腫瘤細胞相對熒光強度僅為4.73±2.68，明顯低于經輻照的載阿霉素微泡處理的細胞（P=0.006），見圖2。

不完全消融鼠模型構建后，A、B、C、D 組皮下瘤殘余活性區平均體積分別為（54.31±14.70） mm3、（63.91±17.30） mm3、（57.82±21.60） mm3、（66.27±15.40）mm3，4 組間差異均無統計學意義，見圖3。

荷瘤小鼠腫瘤體積測量顯示，實驗第15 天A、B、C、D 組分別為 （1 562.3±176.9） mm3、（1 374.5±133.5）mm3、（1 511.3±231.4）mm3、（1 070.8±138.7）mm；D 組與A 組相比差異有顯著統計學意義（P=0.0085），B 組、C 組與A 組相比差異均無統計學意義（P=0.456，P=0.975）；可見D 組與其他3 組相比，在抑制腫瘤生長方面有優勢（圖4①②）。 A、B、C、D 組生存時間分別為（28.40±2.02） d、（39.10±3.19） d、（31.50±2.06）d、（42.10±3.67） d，B 組、D 組與A 組相比差異均有顯著統計學意義（P=0.009，P=0.003），但B、D組間差異無統計學意義（P=0.324），C 組與A 組間差異無統計學意義（P=0.292）（圖4③）。 t 檢驗分析B、D 組心、腎組織內阿霉素濃度顯示，兩組間心、腎組織內藥物濃度差異均有顯著統計學意義（P心=0.001，P腎=0.014）（表1）；結 果 顯 示D 組 與B 組相比，可明顯降低心、 腎組織內藥物濃度（圖4④）。

圖2 不同處理后腫瘤細胞相對熒光強度值不同表示細胞內藥物濃度存在差異

圖3 不完全消融鼠模型構建后皮下瘤殘余活性區體積計算結果

圖4 消融后荷瘤小鼠腫瘤體積、生存時間和和末次治療后藥物濃度

表1 D 組、B 組心、腎組織藥物濃度對比

腫瘤標本常規HE 染色切片光鏡觀察發現，A、B、C 組腫瘤細胞排列較D 組紊亂，A 組內可見多個癌巢，且細胞核大深染、異型性明顯；B、C、D 組未消融區邊緣腫瘤組織內可見壞死區域，其中D 組壞死區域面積較大，且微血管擴張、血管壁不完整、管腔內可見血栓形成，而微血管內血栓形成現象在C 組中較少見到，A、B 組中均未見（圖5①）。 A、B、C、D組殘存活性腫瘤組織區內平均MVD 分別為（36.6±7.16）個、（28.0±4.36）個、（19.2±4.82）個、（13.8±4.97）個，D 組與A 組、B 組差異均有顯著統計學意義（P＜0.000 1，P=0.004），C 組與A 組差異有顯著統計學意義（P＜0.000 1），C 組與D 組差異無統計學意義（P=0.420）（圖5①②）。 200 倍光鏡下分別統計4 組小鼠Ki-67 增殖指數，A、B、C、D 組分別為6.10±1.55、2.76±0.69、5.12±0.89、2.40±0.72，B、D 組與A 組差異均有顯著統計學意義（P＜0.001），表明抑制腫瘤細胞增殖效果明顯；C 組與A 組差異無統計學意義（P＞0.05）（圖5①③）。

圖5 免疫組化染色結果

3 討論

諸多臨床研究表明，MWA 治療巨塊型（＞10 cm）肝癌與RFA 相比雖具有升溫快速、受熱沉淀效應影響小的優勢，但仍有一定的術后腫瘤復發率和轉移率［8］。為進一步降低消融術后腫瘤復發和轉移率，提高姑息性治療中減瘤效果，國內外學者近年嘗試應用各種消融聯合其他治療新策略。 Zhu 等［9］研究報道MWA 聯合免疫抑制劑治療小鼠乳腺癌。 Li 等［10］報道在兔VX2 肝腫瘤中觀察RFA 聯合SF6微泡的治療效果。

阿霉素是臨床常用抗腫瘤藥物，廣泛應用于實體瘤治療。 作為廣譜抗腫瘤藥物，阿霉素經靜脈注射后半衰期較短，腫瘤局部藥物濃度較低，抗腫瘤療效受限，且其特異性差，心臟、腎臟不良反應不可忽視，故在實際應用中不推薦全身給藥［11-12］。近年化療藥物靶向轉運載體系統研制應用，使阿霉素靶向治療肝癌效果進一步提高、藥物不良反應減少成為可能。 低頻超聲靶向擊破載藥微泡，彌補了微泡作為轉運載體時缺乏特異性的缺點［13-15］，而根據載藥微泡所載藥物理化性質和微泡脂質外殼構成不同，載藥微泡載藥率、包封率、粒徑及穩定性等均會發生變化。 本實驗在參考其他文獻報道的載藥微泡和載阿霉素脂質體制備基礎上，根據阿霉素具有脂溶性、帶負電荷等特性，采用創新的實驗方法制備出具有合適粒徑、較其他文獻中載藥量和包封率高的載阿霉素微泡，且在體內外實驗中進一步驗證了其抗腫瘤效果。

前期大量實驗研究結果提示，載藥微泡靶向擊破技術具抗腫瘤原理，可從幾方面解釋。 一是通過微泡“空化效應”增加腫瘤細胞膜通透性，促進抗腫瘤藥物局部釋放或吸收；二是利用微泡瞬時破裂釋放的機械能，破壞腫瘤內新生微血管管壁，形成血栓，減少腫瘤血供；三是利用超聲波熱能或機械能，誘導免疫相關生物效應［16-18］。 本研究中體外細胞實驗證實，經低頻超聲輻照的載阿霉素微泡顯著提高腫瘤細胞內化療藥物濃度，無輻照載阿霉素微泡組胞內藥物濃度并無增加，間接表明低頻超聲擊破微泡具有產生空化效應、 提高細胞膜通透性的作用；動物體內實驗顯示，傳統靜脈給藥（B 組）與靶向擊破載藥微泡（D 組）兩種給藥方式與單純微泡消融（C 組）相比，均顯示出抑制腫瘤生長、延長生存期的效果，D 組與B 組間抑制腫瘤生長、 延長生存期結果雖無差異，但D 組在保證抑瘤效果的同時可有效減少心、腎等非靶向器官組織內藥物濃度，降低化療藥物不良反應；C 組與D 組病理切片均顯示MWA 不完全的腫瘤邊緣區域微血管內可見血栓形成，D 組為甚；MVD 檢測差異證實低頻超聲靶向擊破微泡技術能影響腫瘤微血管生成。 B、D 兩組與C組在抑制腫瘤生長、 延長生存期上均存在差異，可解釋為空白微泡破裂時產生的效應雖能減少腫瘤微血管形成，但在無化療藥物作用于局部情況下，單純靠微泡破裂釋放能量并不能達到明顯的抑制腫瘤細胞增殖的效果。 然而微泡轉運阿霉素并經低頻超聲靶向擊破提高腫瘤細胞內藥物濃度后，則表現出較好的抑制腫瘤增殖效果。 Ki-67 增殖指數與肝癌預后相關，A 組和C 組Ki-67 表達差異無統計學意義，也進一步證實了此推斷。

綜上所述，本實驗為臨床上降低MWA 治療肝癌后腫瘤復發率提供了新的聯合治療思路。 MWA聯合載藥微泡治療新方案有待臨床試驗進一步驗證，其更深層機制尚需進一步研究。