酶解結合高剪切破壁技術對蜂花粉酚類物質及抗氧化活性的影響

王 悅，徐元元，楊二林，程 妮,3※

（1. 西北大學化工學院，西安 710069；2. 西北大學食品科學與工程學院，西安 710069；3. 陜西省蜂產品工程技術研究中心， 西安 710065）

0 引言

蜂花粉是由蜜蜂采集被子植物雄蕊花藥或裸子植物小孢子囊內的花粉細胞，并混入花蜜及自身分泌物而形成團粒狀物[1]。蜂花粉作為一種保健食品，具有治療特性，蜂花粉中約70%的物質具有生物活性，具有抗氧化、保護肝臟、抗炎、抗菌和抗癌作用[2-4]。其中多酚類物質表現出強抗氧化活性[5]，可以有效清除自由基，保護機體免受活性氧的損傷，同時增強血管活性，從而改善血液循環和心臟功能。酚類物質可促進改變膜的通透性，破壞細菌的遺傳物質達到抑菌效果，特別是對病原菌化膿性鏈球菌有顯著的抗菌效果[6]，酚類物質是蜂花粉主要的抑菌劑，總酚含量同革蘭氏細菌生長數量呈負相關[7]。酚類物質還有抑制腫瘤細胞的作用，阻斷腫瘤細胞特定基因的表達，同時增強免疫系統[8]。但蜂花粉外壁主要由纖維素和孢粉素構成，具有抗酸、耐堿、抗微生物分解的特性，不經破壁，酚類物質很難溶出，只能從萌發孔中緩慢釋放，體外抗氧化活性很低，不利于開發用于外用的護膚品及藥品。此外堅硬的花粉壁使得蜂花粉在生物體內消化率不高，吳偉[9]通過小鼠體內消化試驗表明破壁蜂花粉在小鼠胃部更容易排空，熒光顯微鏡觀察消化2 h和12 h后的蜂花粉形態，發現破壁蜂花粉碎片并無變化，未破壁蜂花粉粉粒依舊完整，表明蜂花粉外殼并不受消化酶影響，意味著大部分營養物質不能夠被胃腸消化。未破壁蜂花粉在生物體內消化率只有52%～59%，導致營養成分浪費，因此蜂花粉破壁有助于對提高蜂花粉活性物質溶出，提高體內外利用度[10-12]。

花粉破壁是指在外力作用下破壞花粉壁結構，破壁后內容物溶出，有助于提高生物活性。吳偉[9]研究表明，破壁后蜂花粉總黃酮、總酚溶出率顯著增加（P＜0.001）。趙萌萌等[13]對青稞麩皮超微破壁后，抗氧化活性均有顯著提高（P＜0.05）。目前主要采用機械破壁、溫差破壁、酶解以及微生物發酵等破壁方法。機械破壁法時間作用長可能導致原料溫度過高，破壞營養成分；溫差破壁法成本過高，時間過長；酶解破壁與微生物發酵法等生物破壁法，成本較高、時間過長，大量使用使樣品污染的可能性增大[14]。由于蜂花粉外壁主要由纖維素和孢粉素構成，且為了克服單一破壁方法的弊端，故本研究采用纖維素酶酶解結合高剪切方法進行復合法破壁，提高生物利用度，降低成本的同時不破壞營養成分。且目前對于蜂花粉破壁研究多集中于破壁后形態表征以及對總酚、總黃酮含量影響，而破壁對蜂花粉酚類物質的溶出情況、抗氧化活性及對·OH介導的質粒DNA氧化損傷的保護作用的影響研究甚少。

本文以荷花、棗花、茶花、油菜、玫瑰和五味子6種蜂花粉等為研究對象，采用酶解聯合高剪切破壁技術，研究破壁對蜂花粉酚類物質和抗氧化活性的影響。同時探討破壁前后蜂花粉對·OH介導的質粒DNA鏈氧化損傷的保護作用，以期為蜂花粉資源的開發和利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

荷花、棗花、茶花、油菜、玫瑰、五味子6種蜂花粉均直接從蜂農處采購，且植物源經過孢粉學鑒定[15]，確認每種蜂花粉的種類。

菲洛嗪（Ferrozine）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-trinitrophenylhydrazine，DPPH）、水溶性維生素E（Trolox）、2,4,6-三（2-吡啶基）三嗪（tripyridyltriazine，TPTZ）和酚類標準品（沒食子酸、對羥基苯甲酸、2,4-二羥基苯甲酸、咖啡酸、丁香酸、p-香豆酸、阿魏酸、蘆丁、鞣花酸、肉桂酸、槲皮素、柚皮素、山奈酚、異甘草素）購自美國Sigma公司；色譜級甲醇購自上海安譜實驗科技股份有限公司；過氧化氫（H2O2）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）購自科昊生物工程有限公司；纖維素酶（酶活力為400 U/mg）購自上海源葉生物科技有限公司。

1.2 蜂花粉破壁工藝

1.2.1 纖維素酶酶解破壁

參考并優化孟良玉等[16]的方法，分別稱取0.5 g蜂花粉，置于15 mL離心管中，添加質量分數為1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%纖維素酶，料液比為1∶10 g/mL，50 ℃恒溫水浴搖床酶解5 h。酶解結束后，80 ℃水浴滅酶10 min。吸取破壁蜂花粉懸濁液1 mL，蒸餾水定容到10 mL，取1～2滴稀釋液于載玻片上，置于20×20目（放大倍數：400×）熒光顯微鏡下觀察，取九宮格視野，計算破壁率。

1.2.2 纖維素酶酶解-高剪切聯用破壁

參考王凱[17]的方法，采用D-500均質機（德國Wiggens公司）將酶解過的蜂花粉懸濁液高剪切30 s，轉速10000～15000 r/min，根據1.2.1節方法計算破壁率。

1.3 蜂花粉酚類物質富集

為了保證試驗統一性，6種花粉均稱取20 g，用體積分數為75%的乙醇、料液比1∶20 g/mL（破壁蜂花粉酚類物質富集：稱取20 g蜂花粉，按照料液比1∶10 g/mL酶解后，將酶解液低溫旋轉蒸發至一定量，加入無水乙醇配制成體積分數為75%的乙醇溶液，按照1∶20 g/mL料液比添加到破壁蜂花粉渣中）熱回流2 h，三次回流，濃縮，采用體積分數為75%的乙醇定容至15 mL，備用。

1.4 HPLC分析6種蜂花粉破壁前后乙醇提取物酚類化合物

采用高效液相色譜-二極管列陣檢測（High Performance Liquid Chromatography-Diode Array Detection，HPLC-DAD）法測定蜂花粉酚類化合物含量[18]。HPLC-DAD（U3000 HPLC， G1315A DAD，美國Thermo公司），色譜柱 Zorbax SB-C18（250 mm× 4.6 mm，5.0μm）；流動相：甲醇（A）、體積分數為0.1%的甲酸（B）；梯度洗脫程序為：0～5 min，15%A+85%B；5～10 min，17%A+83%B；10～25 min，30%A+70%B；25～35 min，40%A+60%B；35～40 min，50%A+50%B；40～55 min，55%A+45%B；55～65 min，60%A+40%B；65～70 min，65%A+35%B；70～75 min，70%A+30%B。流速為1.0 mL/min，進樣量是10μL蜂花粉乙醇提取物，二極管陣列檢測器（DAD）檢測波長：254、280、290、324 nm；柱溫是30 ℃。

1.5 總酚含量測定

參照Sfifzadeh等[19]方法，采用Folin-Ciocalteu法測定6種蜂花粉破壁前后的總酚含量，以表示酚類物質的溶出量。吸取0.3 mL方法1.3節中蜂花粉乙醇提取液定容到200 mL。準確吸取1 mL蜂花粉乙醇提取稀釋液，加入1 mL福林酚試劑、5 mL 1 mol/L Na2CO3溶液，用蒸餾水定容到10 mL，振蕩混勻后，避光反應1 h。760 nm處，以蒸餾水為參比，測吸光度值，總酚含量以沒食子酸當量（Gallic Acid Equivalents，GAE）mg/g表示。

1.6 總黃酮含量測定

參照張翠香等[20]方法，采用Al(NO3)3比色法測定6種蜂花粉破壁前后的總黃酮含量，以表示黃酮類物質的溶出量。吸取0.3 mL蜂花粉乙醇提取液定容到10 mL。吸取1 mL蜂花粉乙醇提取稀釋液，加0.4 mL 5 g/mL的NaNO2，反應6 min后，加入0.4 mL 10%的Al(NO3)3，反應6 min后，加入4 mL 4%的NaOH溶液，用80%的甲醇溶液定容到10 mL，靜置15 min。于510 nm處測定其吸光度值，總黃酮含量以蘆丁當量（Rutin Equivalents，RE）mg /g表示。

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1.7 DPPH自由基清除能力測定

參照Hara等[21]的研究方法，并進行調整后測定6種蜂花粉破壁前后對DPPH的清除能力，分別吸取0.6 mL 不同濃度破壁前后的蜂花粉乙醇提取液，加入0.04 mg/mL的DPPH甲醇溶液5 mL，混勻后在暗處靜置1 h，于517 nm處測其吸光度。結果以IC50值（抑制50% DPPH自由基時所需蜂花粉的濃度）表示，DPPH自由基清除率計算公式如下：

式中A0為參比溶液的吸光值；A1為樣品溶液吸光值。

1.8 Fe2+絡合力測定

參照何亮亮等[22]方法，吸取200μL蜂花粉乙醇提取液，加入100μL濃度為1 mmol/L的FeSO4溶液，300μL 1 mmol/L的Ferrozine溶液，用甲醇定容至3 mL，混勻，10 min后于562 nm處測定吸光度。蜂花粉Fe2+絡合力測定以mg/g表示（以Na2EDTA計）。

1.9 Fe3+還原力測定

參照Rao等[23]方法，取0.4 mL蜂花粉乙醇提取液，加入3.6 mL的TPTZ（10 mmol/L TPTZ溶液、20 mmol/L FeCl3溶液、300 mmol/L pH值為3.6醋酸緩沖液，1∶1∶10體積比配制)溶液，37 ℃反應10 min，于593 nm處測定吸光度。蜂花粉鐵還原抗氧化力以mg/g表示（以Trolox計）。

1.10 對·OH誘導的pBR322質粒DNA氧化損傷保護作用的測定

使用瓊脂糖凝膠電泳法分別測定蜂花粉破壁前后對·OH誘導的pBR322質粒DNA氧化損傷保護作用。參照陳思南等[24]方法進行測定。未破壁組：試驗組加入1μL DNA、1μL 1.0 mmol/L FeSO4、1μL H2O2和3μL 0.3 mL/mL蜂花粉提取物，用50 mmol/L PBS磷酸鹽緩沖液（pH值為7.0）定容到15μL，模型組用50 mmol/LPBS磷酸鹽緩沖液代替樣品，正常組添加1μLDNA和14μL磷酸鹽緩沖液；破壁組：試驗組加入1μL DNA、1μL 1.0 mmol/L FeSO4、1μL H2O2和3μL 0.3mL/mL破壁蜂花粉提取物，用50 mmol/L PBS磷酸鹽緩沖液（pH值為7.0）定容到15μL，模型組用50 mmol/L PBS磷酸鹽緩沖液代替樣品，正常組添加1μLDNA和14μL磷酸鹽緩沖液。于37 ℃下避光水浴30 min后，加入1μL上樣緩沖液混合均勻，0.8%的瓊脂糖凝膠中電泳50 min（電壓為50 V）。使用凝膠成像儀（德國耶拿分析儀器股份公司）對電泳條帶進行拍照，使用Quantity One軟件進行數據分析，破壁前后的蜂花粉保護率用以下公式計算進行對比

1.11 數據處理

所有試驗均測定3次，結果以平均值±標準偏差表示，使用SPSS 19.0軟件進行方差分析和顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著，采用Origin 9.0軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 纖維素酶-高剪切聯用對蜂花粉破壁率的影響

由于蜂花粉復雜的細胞壁，具有生物活性的化合物難以被充分釋放，導致蜂花粉營養成分利用率低[25]，破壁可以使蜂花粉細胞壁破碎，內容物充分溶出，營養物質釋放，提高蜂花粉營養物質利用率。本文首先研究了纖維素酶酶解對不同品種蜂花粉破壁率的影響，結果見圖1和圖2。不同種類的蜂花粉經破壁后，花粉孢子均呈現出不同程度的破裂現象，且隨纖維素酶濃度的增加，蜂花粉的破壁率均增加。不同蜂花粉的細胞壁結構不同，因此對纖維素酶的耐受能力不同，本研究中玫瑰蜂花粉耐受力最強，纖維素酶添加量增加到8%時破壁率只有74%，荷花蜂花粉最弱，1%的纖維素酶就可使其破壁率達到87%。

基于以上研究結果，下述研究的破壁蜂花粉均采用破壁率達到90%以上的蜂花粉，具體破壁采用不同濃度的纖維素酶酶解與高剪切聯用的方法（纖維素酶添加量：荷花1%；棗花4%；茶花2%；油菜1%；玫瑰4%；五味子3%），在此基礎上探究破壁對蜂花粉酚類物質及抗氧化活性的影響。

2.2 纖維素酶-高剪切聯用破壁對蜂花粉酚類化合物的影響

酚類化合物對癌癥、動脈粥樣硬化，免疫系統衰弱以及帕金森等疾病均有預防和治療作用[27]，可用于防止氧化損傷，清除自由基，螯合金屬離子的活性物質[28]。近年來，蜂花粉酚類化合物因其保健作用備受關注[29]。本文測定了6種蜂花粉破壁前后總黃酮、總酚含量見表1，6種蜂花粉破壁后總黃酮、總酚含量均有不同程度的增加。破壁后，油菜蜂花粉酚類物質的釋放作用最為顯著（P＜0.05），總酚含量由8.6 mg/g提高至21.6 mg/g，提高1.5倍，總黃酮含量提高6.4倍，阮征等[30]用纖維素酶-果膠酶-蛋白酶復合酶液酶解油菜蜂花粉，總黃酮含量由2.2447 mg/g提高到2.4312 mg/g，提高8.3%，相比而言本研究方法能夠釋放更多活性物質；經破壁后茶花蜂花粉總酚含量為15.7 mg/g，提高11.3%。油菜蜂花粉總黃酮含量最高，五味子蜂花粉破壁后總酚含量最高，荷花蜂花粉總黃酮、總酚含量較低。本文采用HPLC-DAD對6種蜂花粉中的酚類物質進行分析，結果見表2。茶花蜂花粉破壁后共檢測出10種物質，較未破壁多檢測出2種物質；肉桂酸和山奈酚在破壁后被釋放，含量分別為0.72 mg/g和4.38 mg/g，沒食子酸含量由0.39 mg/g增加到2.53 mg/g，柚皮素含量為6.50 mg/g，是破壁前4倍，且高于其他蜂花粉。油菜蜂花粉經破壁后，山奈酚和異甘草素溶出，異甘草素含量達到0.97 mg/g，系6種蜂花粉中含量最高，山奈酚含量達到2.32 mg/g，較Lv等[31]微波破壁檢測得到的山奈酚含量少（23.44 mg/g），可能由于油菜蜂花粉破壁方式、產地影響，以及酚類富集方式不同，導致差異；油菜蜂花粉破壁后沒食子酸含量為11.59 mg/g，較未破壁前提高59%，為所檢測到的酚類物質中含量最高。棗花蜂花粉經破壁后檢測出山奈酚，含量為10.31 mg/g，高于其他蜂花粉。破壁使玫瑰蜂花粉多檢測出兩種酚類物質，五味子蜂花粉多檢測出三種酚類物質，荷花蜂花粉雖沒有其他酚類物質溶出，但沒食子酸含量有大幅度增加，由0.72 mg/g增加到4.43 mg/g，較破壁前提高5倍。破壁后，茶花蜂花粉檢測出的酚類物質種類最多、含量最高，荷花蜂花粉酚類物質種類及含量均為最少。

表1 破壁前后蜂花粉的總黃酮、總酚含量 Table1 The content of total flavonoids and phenols in bee pollen before and after cell wall disruption

2.3 纖維素酶-高剪切聯用破壁對蜂花粉體外抗氧化活性的影響

由表3可知，6種蜂花粉破壁后體外抗氧化能力均增強。DPPH自由基（1,1-二苯基-2-三硝基苯肼）中氮原子的奇數電子通過從抗氧化劑接受一個氫原子到相應的肼而被還原[32]。酚類物質這類抗氧化劑可以有效減少DPPH自由基，對氧化應激損傷有保護作用[33]。測定IC50值越小，則自由基清除能力越強。經破壁后，同等質量下棗花蜂花粉清除50%DPPH自由基所需濃度降低約95%，油菜蜂花粉降低約92%，延莎等[34]采用氣流超微粉碎破壁處理油菜蜂花粉后清除50%DPPH自由基所需蜂花粉濃度由0.338 mg/mL降低到0.315 mg/mL，僅降低6.8%，且破壁后檢測到總黃酮含量由25.462 mg/g減少到23.611 mg/g，可見氣流超微粉碎破壁方法效率不高且對蜂花粉營養物質有所損傷，相比而言酶解與高剪切聯用的破壁方法使DPPH自由基清除能力更大，且溶出的總黃酮含量增加6.4倍，在不破壞其營養成分的同時釋放更多的抗氧化物質。破壁對玫瑰蜂花粉和五味子蜂花粉DPPH自由基清除能力也有明顯的增強趨勢（P＜0.05）。Fe2+等過渡態離子能夠催化Fenton反應產生·OH[35]，加速氧化反應，酚類化合物與Fe2+絡合，中斷氧化反應。破壁后6種蜂花粉Fe2+絡合能力均有提高作用（P＜0.05），棗花蜂花粉Fe2+絡合能力由0.36 mg/g提高至1.16 mg/g，提高約2.2倍；茶花、玫瑰蜂花粉提高約1倍，荷花、油菜、五味子蜂花粉較其他3種蜂花粉提升幅度較小。Fe3+還原力是指樣品提供電子，將Fe3+還原為Fe2+，生成有色物質引起吸光度值增加[36]。破壁后6種蜂花粉的Fe3+還原力均提高（P＜0.05），其中對油菜蜂花粉影響作用最大，從6.20 mg/g提高至55.80 mg/g，提高8倍；其次為棗花蜂花粉，提高1.5倍；茶花蜂花粉破壁后Fe3+還原力由15.30 mg/g提高至24.20 mg/g。破壁對荷花蜂花粉和玫瑰蜂花粉Fe3+還原力影響較弱，但也有提高。

表3 破壁前后蜂花粉的抗氧化活性 Table 3 Antioxidant activity of bee pollen before and after cell wall disruption

基于以上數據，證實破壁能夠增強蜂花粉體外抗氧化活性。破壁后，棗花蜂花粉DPPH自由基清除能力最強，主要基于其高含量的酚類化合物，五味子、油菜蜂花粉較其稍弱；茶花蜂花粉Fe2+絡合力強于其余5種蜂花粉，可能源于茶花蜂花粉破壁后檢測出的酚類物質種類和含量最多；五味子、油菜蜂花粉均有強Fe3+還原力，高含量的黃酮、酚酸能夠將Fe3+還原為Fe2+。棗花、茶花、五味子、油菜蜂花粉含有豐富的酚類物質，表現出強抗氧化活性，可為蜂花粉抗氧化食品的開發利用提供理論依據。

2.4 纖維素酶-高剪切聯用破壁蜂花粉對·OH誘導的pBR322質粒DNA氧化損傷保護作用的影響

H2O2是機體氧化代謝的副產物，是一種非自由基物質，很容易擴散到活細胞當中，過渡態金屬離子條件下，Fenton反應中H2O2生成·OH，從而破壞DNA雙螺旋結構。酚類化合物通過絡合過渡態金屬離子或者清除H2O2使得反應中斷，從而保護DNA雙螺旋結構[37]，通過計算DNA雙螺旋結構占比來測定蜂花粉對·OH誘導的pBR322質粒DNA氧化損傷的保護作用。凝膠電泳成相后得到圖4，6種蜂花粉破壁后，DNA雙螺旋條帶均更明亮清晰。由表4可知，破壁后，油菜蜂花粉對DNA氧化損傷的保護能力提高442.7%，茶花蜂花粉提高287.7%，荷花、棗花、玫瑰、五味子這4種蜂花粉分別提高了60.5%、12.4%、82.5%和4.8%，表明破壁使得蜂花粉中酚類物質得到充分的釋放，可以有效提高對·OH誘導的pBR322質粒DNA氧化損傷的保護能力。

表4 破壁前后蜂花粉對DNA氧化損傷的保護率 Table 4 Protection rate of bee pollen against DNA oxidative damage before and after cell wall disruption %

3 結論

1）少量纖維素酶（荷花1%；棗花4%；茶花2%；油菜1%；玫瑰4%；五味子3%）結合高剪切技術使得6種蜂花粉達到90%以上破壁率。

2）6種蜂花粉經破壁作用后酚類物質種類及含量均增加，總黃酮、總酚含量顯著增加（P＜0.05）。荷花蜂花粉沒食子酸含量較破壁前提高5倍，油菜蜂花粉總黃酮含量提高6.4倍，總酚含量由8.6 mg/g提高至21.6 mg /g，茶花蜂花粉共檢測到10種酚類物質，較未破壁前多2種。

3）體外抗氧化試驗表明，破壁能夠將棗花、油菜蜂花粉清除50%DPPH自由基所需濃度降低95%和92%，棗花蜂花粉Fe2+絡合力提高2.2倍，油菜蜂花粉Fe3+還原力提高8倍。破壁后荷花、棗花、茶花、油菜、玫瑰、五味子6種蜂花粉對pBR322質粒DNA氧化損傷的保護作用分別提高了60.5%、12.4%、287.7%、442.7%、82.5%、4.8%。