microRNAs影響急性髓系白血病細(xì)胞分化的研究進(jìn)展

王洪濤，陳萬靈,2*

（1.廈門醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系，福建 廈門 361023；2.廈門醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院，福建 廈門 361021）

microRNAs（miRNAs）是約22個(gè)核苷酸的小RNA分子，與靶mRNA的3’-非反式區(qū)（3’-UTR）結(jié)合，誘導(dǎo)mRNA降解或抑制翻譯，并在轉(zhuǎn)錄水平上負(fù)調(diào)控靶基因的表達(dá)[1]，參與細(xì)胞分化、增殖、凋亡和遷移等一系列生物學(xué)過程，miRNAs的異常調(diào)節(jié)已被證實(shí)與諸多疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[2]。目前已知的miRNAs 包括：miR223、miR-29、miR-142-3p、miR-9、miR-181a、miR-150、miR-22、miR-34a、miR-342、miR-128a/b、miR-146、miR-10a/b、miR-451、miR-17-92等。

急性白血?。╝cute leukemia，AL）是一類造血干祖細(xì)胞的惡性克隆性疾病，與白血病細(xì)胞自我更新增強(qiáng)、增殖失控、分化障礙、凋亡受阻有關(guān)，分為急性髓系白血病（acute myelocytic leukemia，AML）和急性淋巴細(xì)胞白血病。已發(fā)現(xiàn)多種miRNA與AML細(xì)胞分化相關(guān)。本文將對(duì)影響AML細(xì)胞分化的microRNAs進(jìn)行綜述。

1 miRNA家族

1.1 miR-223 MiR-223在X染色體q12上。在髓系細(xì)胞生成過程中miR-223 表達(dá)穩(wěn)步增加，抑制miR-223 表達(dá)會(huì)阻礙粒細(xì)胞成熟和白血病的發(fā)生[3-4]。在臍帶血CD34+細(xì)胞中敲除或過表達(dá)miR-223的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明[5]，在體外敲除miR-223延遲了紅系祖細(xì)胞分化，而在體內(nèi)過表達(dá)miR-223可增加紅細(xì)胞、T 淋巴細(xì)胞、早期B 淋巴細(xì)胞的生成。上述研究結(jié)果提示miR-223在造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞分化、粒細(xì)胞生成過程中具有重要作用。

miR-223表達(dá)受多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。有研究[4-6]表明，轉(zhuǎn)錄因子NFI-A和C/EBPα可與miR-223前體啟動(dòng)子競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合而調(diào)節(jié)miR-223的表達(dá)水平。NFI-A使miR-223維持在較低水平，而全反式維甲酸（all-trans retinoic acid，ATRA）誘導(dǎo)的C/EBPα 表達(dá)則導(dǎo)致miR-223 表達(dá)上調(diào)，并促進(jìn)白血病細(xì)胞向粒細(xì)胞分化。miR-223抑制NFI-A翻譯，產(chǎn)生有利于粒細(xì)胞分化的負(fù)反饋環(huán)。另外，白血病中的部分融合蛋白可抑制 miR-223 的表達(dá)。Fazi 等[7]研究表明，miR-223 在含AML1/ETO（AE）融合蛋白的AML細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，并確定了miR-223是AE融合蛋白的直接靶點(diǎn)，AE可通過募集染色質(zhì)重構(gòu)酶而誘導(dǎo)miR-223沉默。AE蛋白水平的下調(diào)能上調(diào)miR-223 的表達(dá)水平，從而促進(jìn)白血病細(xì)胞分化。另外，過表達(dá)miR-223 也可使含PML/RARα 融合蛋白的NB4 細(xì)胞向粒細(xì)胞分化[6]。miR-223 的異常表達(dá)可誘導(dǎo)HL60 細(xì)胞向粒細(xì)胞分化，但該細(xì)胞株并無表達(dá)融合蛋白[7]。說明融合蛋白不是miR-223調(diào)節(jié)造血細(xì)胞分化過程中的關(guān)鍵蛋白。

Pulikkan 等[8]發(fā)現(xiàn)miR-223 可靶向作用于轉(zhuǎn)錄因子E2F1，從而抑制髓系祖細(xì)胞增殖，并促進(jìn)細(xì)胞分化。另外，Johnnidis 等[9]在小鼠中敲除 miR-223 基因 ，這些 miR-223 缺陷的小鼠粒細(xì)胞增多，并處于高炎癥狀態(tài)。研究還發(fā)現(xiàn)，促進(jìn)髓系祖細(xì)胞增殖的轉(zhuǎn)錄因子MEF2C 是miR-223 的靶基因。缺失MEF2C 基因可抑制miR-223 缺失的小鼠的祖細(xì)胞增殖，并減少中性粒細(xì)胞數(shù)量。因此，miR-223 可能是祖細(xì)胞增殖、粒細(xì)胞分化和活化的負(fù)調(diào)控因子。有研究[6-8]顯示，miR-223 是粒細(xì)胞分化的正向調(diào)節(jié)因子，這可能因?yàn)樵谒柘导?xì)胞發(fā)育的不同階段，miR-223 表達(dá)的濃度不同，導(dǎo)致其功能不同[9]。

1.2 miR-29、miR-142-3p 人類miR-29 家族分布于1 號(hào)染色體和7號(hào)染色體，主要有3個(gè)成員，包括miR-29a、miR-29b和miR-29c。人的miR-142 基因定位17 號(hào)染色體上。premiR-142 長度為87 個(gè)核苷酸，能編碼兩種成熟的miRNA（miR-142-3p和miR-142-5p）。Wang等[10]在白血病細(xì)胞株和CD34+造血干/祖細(xì)胞的分化過程中檢測(cè)到miR-29a 和miR-142-3p表達(dá)上調(diào)。通過功能獲得和功能喪失的實(shí)驗(yàn)，表明在佛波醇酯（phorbol-12-myristate-13-acetate，PMA）或ATRA誘導(dǎo)下，上述兩種miRNAs能促進(jìn)HL-60、THP-1或NB4細(xì)胞分化，并可直接抑制cyclin T2（CCNT2）基因，誘導(dǎo)單核細(xì)胞分化。此外，miR-29a 靶基因細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶6（CDK6）、miR142-3p 的靶基因 TGF-β 激活激酶 1/MAP3K7結(jié)合蛋白 2（TGF-βactivated kinase 1/MAP3K7 binding protein 2）均參與調(diào)節(jié)粒細(xì)胞和單核細(xì)胞分化[10]。

另外 ，在 AML 細(xì)胞中 miR-29a 和 miR-142-3p 表達(dá)顯著降低，靶基因的蛋白表達(dá)水平明顯升高[10]。在正常人與AML 患者的造血干/祖細(xì)胞中過表達(dá)miR-29a 或miR-142-3p，他們的靶基因表達(dá)下調(diào)，同時(shí)可促進(jìn)髓系細(xì)胞分化[10]。上述發(fā)現(xiàn)證實(shí)miR-29a 和miR-142-3p 是正常髓系細(xì)胞分化的關(guān)鍵調(diào)控因子，低表達(dá)參與AML的發(fā)生發(fā)展過程。

1.3 miR-9 在PMA誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞的單核細(xì)胞分化模型中，Chen 等[11]發(fā)現(xiàn)miR-9 的表達(dá)在細(xì)胞分化過程中顯著下調(diào)。在t（8；21）的AML 中，過表達(dá)miR-9 可抑制人類AML細(xì)胞和異種移植小鼠模型的白血病細(xì)胞生長，誘導(dǎo)向單核細(xì)胞分化，并抑制細(xì)胞增殖[12-13]。在體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，miR-9可通過結(jié)合let-7 靶向LIN28B/let-7/HMGA2 軸抑制AML t（8；21）陽性細(xì)胞株kasumi-1細(xì)胞的生長，誘導(dǎo)KASUMI-1細(xì)胞分化[12]。另外，加入miR-9-1 也可誘導(dǎo)SKNO-1 細(xì)胞分化并抑制其增殖[13]。另一方面，沉默miR-9-1 可促進(jìn)靶基因（RUNX1、RUNX1T1 和RUNX1-RUNX1T1）的表達(dá)，抑制t（8；21）AML 細(xì)胞株的分化和增殖[13]。在EVI1 誘導(dǎo)的AML中，沉默miR-9 表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和髓系細(xì)胞生成減少[14]。提示miR-9在AML中發(fā)揮促進(jìn)造血細(xì)胞分化的作用。

1.4 miR-181 miR-181家族包括4個(gè)高度保守的成熟miRNA成員，即miR-181a、miR-181b、miR-181c和miR-181d。目前較多報(bào)道集中在miR-181a，關(guān)于miR-181c 和miR-181d 的研究報(bào)道較少。在正常骨髓中，miR-181a主要存在于B淋巴細(xì)胞、T 淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和粒細(xì)胞中[15]。Chen 等[16]研究表明，過表達(dá)miR-181 能增加體內(nèi)外B 淋巴系細(xì)胞的比例，表明miR-181 是B 淋巴細(xì)胞分化的正調(diào)控因子。研究還發(fā)現(xiàn)當(dāng)B淋巴細(xì)胞增多時(shí)，髓系細(xì)胞和其他類型淋巴細(xì)胞的分化并未完全被阻斷，表明miR-181 可能是功能的調(diào)節(jié)者。Debernardi 等[17]報(bào)道 miR-181a 在 AML FAB M1/M2 患者中的表達(dá)水平較M4/M5 高，間接說明miR-181a 與髓系細(xì)胞分化相關(guān)。此外，在紅系分化過程中miR-181a 和miR-181b 的表達(dá)水平升高[18]。

1.5 miR-24 miR-24在不同分化程度的造血細(xì)胞中的表達(dá)不同。如miR-24 富集于正常人CD34+造血干/祖細(xì)胞中[19]。Lal 等[20]報(bào)道m(xù)iR-24 在造血細(xì)胞分化過程中表達(dá)上調(diào)。Sharbati等[21]研究表明，在單核系分化過程中miR-24表達(dá)上調(diào)。miR-24可通過多個(gè)靶基因參與造血細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等過程。如Zaidi 等[22]報(bào)道上調(diào)miR-24 可抑制MAPK磷酸化而激活下游信號(hào)通路，從而促進(jìn)髓系細(xì)胞增殖，阻滯粒系細(xì)胞分化。miR-24 可與ALK4 的3’-UTR 結(jié)合而下調(diào)ALK4 的表達(dá)，從而抑制紅系細(xì)胞分化、CD34+造血祖細(xì)胞成熟[23]。

1.6 miR-22 在 HL-60、THP1 和CD34+造血干/祖細(xì)胞向單核/巨噬細(xì)胞分化過程中，Shen等[24]檢測(cè)到miR-22表達(dá)增加，證實(shí)單核/巨噬細(xì)胞分化過程中關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子PU.1，在分化過程中促使miR-22 的激活。通過過表達(dá)和沉默實(shí)驗(yàn)，Shen 等[24]證明 miR-22 促進(jìn)單核/巨噬細(xì)胞分化，MECOM（EVI1）mRNA 是 miR-22 的直接作用的靶基因，MECOM（EVI1）在分化過程中起負(fù)調(diào)節(jié)作用。miR-22介導(dǎo)MECOM降解，提高c-Jun 表達(dá)水平，并減少M(fèi)ECOM-和GATA2 介導(dǎo)的干擾作用，最終增加c-Jun 和PU.1 的相互作用，從而促進(jìn)單核/巨噬細(xì)胞的分化。Shen等[24]還觀察到在AML患者中，PU.1和miR-22顯著下調(diào)，MECOM顯著上調(diào)，miR-22的再導(dǎo)入緩解AML患者的分化障礙，并抑制骨髓原始細(xì)胞的生長。提示miR-22 在正常造血和AML 發(fā)展中的新功能和作用機(jī)制，并體現(xiàn)其在AML診斷和治療中的潛在價(jià)值。

1.7 miR-34a miR-34是一個(gè)進(jìn)化保守的miRNA家族，共3個(gè)成員：miR-34a、miR-34b、miR-34c。可檢索到 miR-34a 與AML 細(xì)胞分化的報(bào)道。Navarro 等[25]報(bào)道 miR-34a 在 PMA誘導(dǎo)的巨核細(xì)胞分化過程中表達(dá)上調(diào)，而在氯化高鐵血紅素誘導(dǎo)的紅細(xì)胞分化過程中表達(dá)并未上調(diào)。在K562細(xì)胞中過表達(dá)miR-34a可抑制細(xì)胞增殖，導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯在G1期，促進(jìn)巨核細(xì)胞分化。miR-34a在血小板生成素誘導(dǎo)的CD34+造血干細(xì)胞的分化過程中表達(dá)上調(diào)，且過表達(dá)miR-34a可顯著增加巨核細(xì)胞的數(shù)量。miR-34a 直接調(diào)節(jié)MYB 的表達(dá)，MYB 可促進(jìn)巨核細(xì)胞分化，并可調(diào)節(jié)CDK4 和CDK6 的表達(dá)，以抑制 G（1）/S 轉(zhuǎn)換。然而，miR-34a 靶基因在未加入miR-34a的情況下可誘導(dǎo)巨核細(xì)胞分化，并迅速下調(diào)。表明miR-34a并不參與最初的下調(diào)，但可能在此后的維持抑制作用方面發(fā)揮作用。

1.8 miR-342 De 等[26]確定 miR-342 是 ATRA 在誘導(dǎo) APL分化過程中上調(diào)的一種miRNAs。miR-342是造血關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子PU.1、干擾素調(diào)節(jié)因子（IRF）-1 和IRF-9 的直接轉(zhuǎn)錄靶點(diǎn)。IRF-1維持miR-342在低水平；PU.1和IRF-9在ATRA介導(dǎo)的細(xì)胞分化的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，從而上調(diào)miR-342 的表達(dá)。此外，De 等[26]還發(fā)現(xiàn)在 APL 細(xì)胞中過表達(dá) miR-342 可促進(jìn)ATRA誘導(dǎo)的細(xì)胞分化。表明miR-342是ATRA誘導(dǎo)的APL向粒細(xì)胞分化的新參與者。

1.9 miR-150 AML細(xì)胞株HL60、PL21和THP-1的高通量基因表達(dá)譜研究[27]表明，與正常細(xì)胞相比，在表達(dá)miR-150的細(xì)胞中，CEPBA、CEBPE和與髓系分化相關(guān)的細(xì)胞因子的激活有助于髓系細(xì)胞分化。Morris 等[28]研究顯示，miR-150在AML 中低表達(dá)，再引入miR-150 表達(dá)可誘導(dǎo)髓系細(xì)胞分化并抑制AML細(xì)胞增殖。表明miR-150可促進(jìn)髓系細(xì)胞分化，而miR-150 的缺失或低表達(dá)將導(dǎo)致AML 細(xì)胞停滯向髓系細(xì)胞分化。

1.10 miR-128 miR-128 包括 miR-128-1 和 miR-128-2，分別定位于人染色體2q21.3和3p22.3上，兩者均可生成相同的miR-128。De 等[29]發(fā)現(xiàn)與正常人CD34+祖細(xì)胞相比，Lin28A在AML 患者白血病細(xì)胞和AML 細(xì)胞株中低表達(dá)。在體外將Lin28A 轉(zhuǎn)染到NPM1 突變的OCI-AML3 細(xì)胞株中，Lin28A 可促使細(xì)胞周期停滯和髓系細(xì)胞分化，并增加EGR2、ZFP36 和 ANXA1 的表達(dá)。感染 miR-128 慢病毒的OCI-AML3 可下調(diào)Lin28 表達(dá)，抑制向巨噬細(xì)胞分化。在OCI-AML3 和APL/AML 白血病細(xì)胞中沉默miR-128a 可誘導(dǎo)髓系細(xì)胞分化，增加 Lin28A、EGR2、ZFP36 和 ANXA1 的表達(dá)，逆轉(zhuǎn)髓系細(xì)胞分化阻滯。提示miR-128a/Lin28A軸在AML細(xì)胞分化受阻中的作用。

1.11 miR-146 人類miR-146 位于5 號(hào)染色體上。Yuan等[30]發(fā)現(xiàn)對(duì)苯二酚誘導(dǎo)CD34+細(xì)胞（暴露5d）和HL-60 細(xì)胞（暴露3 h）分化為髓系細(xì)胞和免疫細(xì)胞的數(shù)量明顯減少，同時(shí) miR-146a 表達(dá)上調(diào) ，TRAF6 和 NF-κB 表達(dá)下調(diào)。使用miR-146a-5p抑制劑抑制miR-146a的表達(dá)，可在一定程度上減輕對(duì)苯二酚對(duì)髓系細(xì)胞分化的抑制作用，TRAF6 蛋白和磷酸化IκBα蛋白的水平也恢復(fù)到與對(duì)照組相同的水平。表明miR146與AML的細(xì)胞分化相關(guān)。

1.12 miR-10 miR-10a/b 是miR-10 家族的成員，定位于17號(hào)染色體。miR-10a/b 在t（8；21）、t（9；11）、NPM1 突變的AML 患者中顯著升高，尤其是 M1、M2 和 M3 亞型[31]?；颊弋惓８弑磉_(dá)miR-10a/b 導(dǎo)致異常造血祖細(xì)胞無限增殖，并抑制造血細(xì)胞分化成熟。miR-10a過表達(dá)與FAB-M3/t（15；17）亞型、NPM1 突變相關(guān)，可促使骨髓中的幼稚細(xì)胞百分比降低；而 miR-10b 的過表達(dá)與 NPM1、DNMT3A 突變相關(guān)，則骨髓中的幼稚細(xì)胞百分比升高[32]，且單核細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)因子KLF4 與細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)因子RB1CC1 是miR10a 的靶基因[33]。

1.13 miR-451 miR451 是近年新發(fā)現(xiàn)的miRNA，位于17號(hào)染色體q11.2。Bruchova-Votavova 等[34]研究結(jié)果表明，miR-451參與紅系分化的調(diào)節(jié)，并具有促進(jìn)分化的作用。另外，通過功能喪失和獲得實(shí)驗(yàn)，Song等[35]證明人異質(zhì)性胞核核糖核蛋白A1（hnRNP A1）在粒細(xì)胞分化過程中表達(dá)下調(diào)，降低對(duì)C/EBPα 表達(dá)的抑制，增加的C/EBPα 表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞分化，miR-451 可通過靶向下調(diào)hnRNP A1 而促進(jìn)粒細(xì)胞分化。

1.14 miR-17-92 簇 miR-17-92 簇是報(bào)道最多的 miRNA 簇之一。miR-17-92基因簇位于人類基因組染色體13q31.3上，編碼 6 個(gè)成熟的 miRNAs，包括 miR-17、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b-1和miR-92a-1。有研究[36]表明，與正常人相比，miR-17-92 在 APL 中表達(dá)上調(diào)。在 ATRA 誘導(dǎo) NB4 細(xì)胞分化過程中，c-Myc 和miR-17-92 的表達(dá)顯著受到抑制。在這一過程中，c-Myc直接調(diào)控miR-17-92。過表達(dá)miR-17-5p 可阻礙ATRA 誘導(dǎo)的細(xì)胞分化。另外，miR-17-92 的異常表達(dá)抑制DMSO誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞向粒細(xì)胞分化[37]。

1.15 miR-16 miR-16 由22 個(gè)核苷酸組成，定位于13q14。Sueur等[38]研究表明，下調(diào)miR-16的表達(dá)可部分修復(fù)經(jīng)FLT3抑制劑AC220 處理的細(xì)胞的增殖作用，而miR-16 過表達(dá)則阻止細(xì)胞增殖并引起AML細(xì)胞向單核細(xì)胞分化。MiR-15a/16-1在經(jīng)ATRA處理的NB4、HL-60和U937細(xì)胞株和原代白血病細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)。過表達(dá)miR-15a/16-1不能直接促使細(xì)胞發(fā)生分化，但可促進(jìn)ATRA誘導(dǎo)的NB4和U937細(xì)胞分化[39]。

1.16 miR-125 miR-125 家族包括 miR-125a、miR-125b-1、miR-125b-2。miR-125a 定位于 19 號(hào)染色體 q13，miR-125a-3p 和 miR-125a-5p 為 miR-125a 的兩條成熟的 miRNA。而miR-125b-l 和 miR-125b-2 分別定位于 11 號(hào)染色體 q23 上和2l號(hào)染色體q21上。Dakir等[37]研究表明過表達(dá)miR-125a-5p可促進(jìn)HL-60/NB4 細(xì)胞及CD34+造血干/祖細(xì)胞向粒細(xì)胞分化。Bousquet 等[40]報(bào)道，體外轉(zhuǎn)染miR-125b 可阻止CD34+細(xì)胞分化，也可阻斷經(jīng)化學(xué)處理的HL60 和NB4 向單核細(xì)胞分化。因此，miR-125b 上調(diào)可能導(dǎo)致體內(nèi)白血病細(xì)胞分化阻滯。

1.17 miR-126 miR-126 位于人類9 號(hào)染色體q34.3。Li等[41]研究表明，過表達(dá)miR-126可激活在LSCs/LICs和/或原始HSPCs中高表達(dá)的基因，而敲除miR-126則激活在分化較為成熟的造血細(xì)胞中高表達(dá)的基因。因此，miR-126過表達(dá)可能主要作用于原始HSPCs，而miR-126敲除可能主要作用于分化程度較高的祖細(xì)胞。

1.18 其他miRNAs 除上述外，還有其他的miRNA 與AML細(xì)胞分化相關(guān)。如Riccioni等[42]分析miR-21及其靶基因PDCD4（Programmed Cell Death 4，程序性細(xì)胞死亡4）在正常造血分化和AML 中的表達(dá)。結(jié)果表明，在正常的粒細(xì)胞/單核細(xì)胞分化過程中，miR-21 表達(dá)明顯上調(diào)，與此同時(shí)PDCD4 蛋白水平下調(diào)。Popovic 等[43]研究表明，在正常骨髓造血祖細(xì)胞中過表達(dá)miR-196b可促進(jìn)細(xì)胞增殖和提高細(xì)胞存活能力，并阻滯部分髓系細(xì)胞分化。對(duì)CD34+人造血干細(xì)胞的獲得性和缺失性實(shí)驗(yàn)證實(shí)，miR-130a 通過干擾關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)抑制單核細(xì)胞分化[44]。在體內(nèi)miR-20a 抑制HIF-1a誘導(dǎo)的U937細(xì)胞分化，促進(jìn)U937細(xì)胞增殖[45]。

2 小結(jié)

研究發(fā)現(xiàn)，越來越多的miRNA 通過影響造血細(xì)胞分化而參與AML發(fā)生發(fā)展過程，有的阻滯造血細(xì)胞分化，有的促進(jìn)造血細(xì)胞分化，可作用于不同時(shí)期的造血細(xì)胞、不同系別的造血細(xì)胞。另外，miRNA不僅影響造血細(xì)胞分化，也可影響細(xì)胞增殖、凋亡等生物學(xué)過程，其中影響造血細(xì)胞分化的miRNA有望作為治療AML的新靶點(diǎn)。