糞菌移植對內(nèi)毒素誘導(dǎo)的急性肺損傷大鼠Keap1?Nrf2/ARE信號通路的影響

譚乂珉，汪玉磊，李波，尹國芳，范賢明△

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是多種因素引起的肺部過度炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激。當肺部受到刺激時，會引起炎性細胞浸潤，氧自由基、蛋白水解酶等釋放，損傷肺泡上皮細胞及毛細血管內(nèi)皮細胞，導(dǎo)致血管通透性增加,引起肺水腫，肺泡間隔增厚甚至斷裂，造成肺內(nèi)氧彌散障礙、通氣/血流比例失調(diào)，形成頑固性低氧性呼吸功能不全［1?2］。目前臨床上常用的治療手段效果較差。

正常的腸道菌群會形成微生物屏障，幫助宿主獲取能量、調(diào)節(jié)免疫、抗炎、合成維生素等［3］。一旦腸道菌群平衡被打破會引發(fā)諸多疾病，而糞菌移植（fecal microbiota transplantation，F(xiàn)MT）可幫助受體重建正常腸道微生態(tài)環(huán)境。近年來許多研究將FMT應(yīng)用于各種腸內(nèi)外疾病，如難辨梭狀芽孢桿菌感染、炎癥性腸病、腸易激綜合征、自身免疫性疾病、神經(jīng)精神疾病等［4］，均取得了重要進展。炎癥、氧化應(yīng)激在ALI的發(fā)生發(fā)展中至關(guān)重要，F(xiàn)MT干預(yù)脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的ALI中，抗炎、抗氧化機制可能發(fā)揮了重要作用。筆者前期的研究證實ALI模型大鼠腸道菌群豐度、結(jié)構(gòu)、多樣性等方面均發(fā)生明顯變化，通過FMT干預(yù)后腸道菌群改變得以糾正，同時肺損傷得到了改善，這與抑制磷脂酰肌醇3?激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）/核因子（NF）?κB信號通路、轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）?β1/Smad3信號通路及細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）信號通路的活化，減少炎性因子表達有關(guān)［5?6］，但未闡明抗氧化應(yīng)激機制是否在其中發(fā)揮作用。Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1（Keap1）?核因子E2相關(guān)因子（Nrf2）/抗氧化反應(yīng)元件（ARE）信號通路作為氧化應(yīng)激系統(tǒng)中一條重要的抗氧化通路，可以通過激活下游的抗氧化酶基因轉(zhuǎn)錄、表達，增強清除自由基能力，抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，進而減輕肺損傷［7］。本研究通過檢測Nrf2及Keap1?Nrf2/ARE信號通路下游相關(guān)產(chǎn)物在各組大鼠中的表達情況，探究Keap1?Nrf2/ARE信號通路在此過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑成年雄性SPF級SD大鼠15只，6～8周齡，體質(zhì)量（200±20）g，購自西南醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，動物合格證號：SYSK（川）2018?065。實驗前將大鼠于實驗室喂養(yǎng)1周。LPS（Sigma，美國），Nrf2、血紅素氧合酶?1（HO?1）抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，中國），免疫組化Nrf2抗體（北京孚博生物科技有限公司），甘油醛?3?磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體、山羊抗兔二抗（上海碧云天生物技術(shù)公司，中國），超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、蛋白質(zhì)羰基（PCO）酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（上海科興商貿(mào)有限公司，中國），其余均為國產(chǎn)或進口分析試劑或材料，腸道菌群測序由上海生物工程有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組與模型制備15只SD大鼠按隨機數(shù)字表法分為對照組（NS組）、模型組（LPS組）、干預(yù)組（FMT組），每組5只。LPS組、FMT組通過腹腔注射LPS（5 mg/kg）1次制備大鼠ALI模型；相同條件下，NS組腹腔注射等體積無菌生理鹽水，造模完成24 h后，F(xiàn)MT組立即給予自制糞菌液（參照Cui等［8］的制備方法）灌胃（10 mL/kg，2次/d，持續(xù)2 d）；相同條件下，NS組和LPS組灌胃等體積生理鹽水。實驗期間各組大鼠常規(guī)攝食，房間溫度（25±5）℃、濕度40%～60%。觀察各組大鼠精神、體質(zhì)量、進食、毛色變化及對外界刺激反應(yīng)等。于最后一次FMT完成24 h后收集腹主動脈血、肺組織及結(jié)腸內(nèi)新鮮糞便。

1.2.2 血氧分壓［p（O）2］、肺濕/干質(zhì)量比（W/D）測定抽取腹主動脈血0.5 mL于血氣分析儀檢測p（O）2。取出右肺組織，清洗后吸干表面水分稱量得肺濕質(zhì)量（W），然后將肺組織放置于70℃烤箱內(nèi)烘烤2～3 d至完全脫水稱量肺干質(zhì)量（D），計算肺W/D。

1.2.3 肺大體觀察及肺損傷病理學(xué)評分將肺組織在生理鹽水中洗凈后觀察肺組織外觀情況。將左肺上葉固定后，經(jīng)過脫水、包埋、切片、HE染色等操作后，光鏡下觀察肺組織病理學(xué)形態(tài)，根據(jù)肺泡腔及肺泡間隔中性粒細胞滲出、肺泡間隔增寬、充血出血和纖維蛋白滲出情況進行病理學(xué)評分，0分為無或非常輕微，1分為輕，2分為中，3分為重，4分為極重。每張切片觀察5個不同的視野，以平均值作為每個樣本的肺損傷病理學(xué)評分。

1.2.4 腸道菌群測序收集各組大鼠結(jié)腸內(nèi)新鮮糞便放入無菌凍存管中保存，根據(jù)需要提取糞便樣品DNA進行腸道菌群測序，利用MiSeq控制軟件進行圖像分析：對97%相似水平下的操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）進行生物信息統(tǒng)計分析，利用實際觀測到的OTU計算出Alpha多樣性指數(shù)，包括ACE、Chao、Shannon和Simpson指數(shù)，其中ACE和Chao指數(shù)反映微生物豐度，Shannon和Simpson指數(shù)反映微生物多樣性；根據(jù)各組大鼠腸道菌群的OTU豐度計算出Beta多樣性距離矩陣，進行層次聚類分析后得到聚類樹圖，Beta多樣性可用于比較3組大鼠腸道菌群差異性；將序列進行物種分類，通過信息整理后得到科水平菌群分布柱狀圖。

1.2.5 血清SOD、MDA、PCO水平測定將收集到的大鼠血液樣本在4℃，3 000 r/min離心10 min后收集上清，ELISA法檢測血清中SOD、MDA、PCO水平。按照ELISA試劑盒說明書進行操作。

1.2.6 免疫組化染色將3組大鼠肺組織切片進行免疫組織化學(xué)染色，分析肺組織Nrf2的表達情況。在光鏡下觀察并攝取放大200～400倍的圖像，將圖像導(dǎo)入Image Pro Plus 6.0內(nèi)，先對圖像進行灰度轉(zhuǎn)化，明顯區(qū)分陽性區(qū)域與背景，手動描繪測量區(qū)域，軟件自動測量出區(qū)域面積（Area）及積分光密度（IOD）值，并算出平均光密度（IOD/Area）。

1.2.7 Western blot法 檢 測 肺 組 織HO?1及Nrf2蛋 白 表達將肺組織進行蛋白提取，用于檢測肺組織中HO?1蛋白含量，再按照細胞核蛋白提取試劑盒說明書，提取肺上皮細胞核蛋白，用于檢測活化Nrf2蛋白的表達，按BCA蛋白定量法檢測目的蛋白濃度，依次經(jīng)過電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、洗滌、一抗過夜孵育、再洗滌、二抗室溫孵育、再洗滌、曝光顯影、掃描圖像、測量灰度值后，以GAPDH為內(nèi)參，比較各組樣本目的蛋白表達情況。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法將各組數(shù)據(jù)使用SPSS 22.0進行統(tǒng)計學(xué)分析，所有計量資料均使用x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD?t法，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實驗期間大鼠一般情況NS組較前無明顯變化；LPS組大鼠與NS組相比，活動減少、精神萎靡、反應(yīng)遲鈍、呼吸增快、攝食減少、毛發(fā)暗淡。FMT后，大鼠活動、精神、對外界刺激反應(yīng)、攝食等均有好轉(zhuǎn)。

2.2 各組大鼠肺W/D、p（O）2比較與NS組相比，LPS組肺W/D明顯升高，p（O）2降低；與LPS組相比，F(xiàn)MT組大鼠肺W/D降低，p（O）2有所回升，組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

Tab.1 Changes of lung W/D,p(O)2 and lung injury pathological scores of rats in each group表1 各組大鼠肺W/D、p（O）2、肺損傷病理學(xué)評分變化（n=5，x±s）

2.3 肺大體觀察及肺損傷病理學(xué)評分

2.3.1 肺大體觀察NS組大鼠肺組織表面光滑呈均勻粉色，質(zhì)軟；LPS組部分大鼠肺組織外表可見出血、淤血、壞死等表現(xiàn)；FMT組大鼠肺組織表面出血、淤血、壞死情況減輕。

2.3.2 肺組織形態(tài)學(xué)觀察及肺損傷病理學(xué)評分NS組肺泡結(jié)構(gòu)完整，肺間質(zhì)及肺泡腔無明顯炎性細胞浸潤，LPS組肺損傷病理學(xué)評分明顯高于NS組（P＜0.05），LPS組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)雜亂，主要表現(xiàn)為肺泡間隔明顯增厚，肺泡腔及肺泡間質(zhì)出現(xiàn)大量炎性細胞、紅細胞浸潤，部分肺泡間隔斷裂；FMT組肺組織結(jié)構(gòu)清晰，肺泡腔及肺泡間質(zhì)炎細胞、紅細胞明顯減少，滲出減輕，但肺泡間隔較厚，F(xiàn)MT組的病理學(xué)評分較LPS組降低（P＜0.05），見圖1、表1。

Fig.1 HE staining of lung tissue of rats(×200)圖1 大鼠肺組織HE染色（×200）

2.4 大鼠腸道菌群宏基因組高通量測序結(jié)果

2.4.1 測序結(jié)果3組大鼠OTU數(shù)值比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表2。

2.4.2 Alpha多樣性分析3組大鼠ACE、Chao、Shannon、Simpson指數(shù)比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，見表2。

Tab.2 Diversity analysis of intestinal flora in three groups of rats表2 3組大鼠腸道菌群多樣性分析（n=5，x±s）

2.4.3 Beta多樣性分析FMT組與NS組菌群結(jié)構(gòu)成分較為相似，LPS組與以上2組菌群結(jié)構(gòu)組成相差較大，見圖2。

Fig.2 Similarity tree diagram圖2 相似性樹狀圖

2.4.4 大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)分析3組樣本均以乳酸桿菌科、紫單胞菌科、瘤胃球菌科、未分類菌、消化鏈球菌、毛螺菌科、普雷沃氏菌科為主，其中以乳酸桿菌科、紫單胞菌科最多；LPS組與NS組比較，乳酸桿菌科、消化鏈球菌科豐度降低，紫單胞菌科明顯增高，F(xiàn)MT組乳酸桿菌科、消化鏈球菌科豐度增高，紫單胞菌科降低，見圖3。

2.5 3組大鼠血清中SOD、MDA、PCO水平比較與NS組相比，LPS組血清中MDA、PCO明顯增高，SOD降低；FMT組血清中MDA、PCO較LPS組明顯減少，SOD表達升高（P＜0.05）；LPS組SOD/MDA、SOD/PCO均低于NS組及FMT組（P＜0.05），而NS組與FMT組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表3。

Tab.3 Changes of serum levels of SOD,MDA,PCO,SOD/MDA and SOD/PCO in three groups of rats表3 3組大鼠血清中SOD、MDA、PCO、SOD/MDA、SOD/PCO變化（n=5，x±s）

Fig.3 Histogram of family horizontal flora distribution圖3 科水平菌群分布柱狀圖

2.6 肺組織中HO?1、Nrf2蛋白表達比較NS組肺組織中Nrf2極少表達［（49.20±56.14）×10?6］，LPS組Nrf2蛋白表達增多［（2 169.60±1 364.42）×10?6］，F(xiàn)MT組［（4 671.80±2 291.79）×10?6］較LPS組進一步增多（n=5，F(xiàn)=11.285，P＜0.05），見圖4。Western blot結(jié)果顯示，NS組中Nrf2、HO?1較少表達，LPS組Nrf2、HO?1蛋白表達量較NS組增多，F(xiàn)MT組Nrf2、HO?1蛋白的表達量較LPS組進一步增多（P＜0.05），見圖5、表4。

Fig.4 Immunohistochemical staining for Nrf2 protein in rat lung tissue(SP,×400)圖4 免疫組化檢測大鼠肺組織中的Nrf2蛋白（SP，×400）

Fig.5 The expression of Nrf2 and HO?1 protein in rat lung tissue detected by Western blot assay圖5 Western blot檢測Nrf2、HO?1蛋白表達的結(jié)果

Tab.4 The expression levels of Nrf2 and HO-1 protein in the lung tissues of rats表4 Nrf2、HO-1蛋白在各組大鼠肺組織中的表達情況（n=3，x±s）

3 討論

LPS導(dǎo)致ALI是一個失控性炎癥級聯(lián)放大過程，促抗炎失衡、氧化抗氧化失衡、細胞凋亡紊亂等在該過程中發(fā)揮作用［9］。氧化應(yīng)激是ALI發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。LPS進入機體后刺激產(chǎn)生過多的活性氧（ROS）直接損傷肺泡上皮細胞及血管內(nèi)皮細胞，與之發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，產(chǎn)生具有細胞毒性作用的MDA，MDA再次損害上述細胞使肺損傷情況進一步惡化［10］。ROS對蛋白質(zhì)造成氧化損傷，產(chǎn)生PCO，PCO含量是判斷蛋白質(zhì)氧化損傷的敏感指標［11］。研究表明，氧化應(yīng)激反應(yīng)系統(tǒng)中重要抗氧化通路Keap1?Nrf2/ARE可通過激活下游的抗氧化酶基因的轉(zhuǎn)錄、表達，增強清除自由基能力，抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，進而減輕肺損傷［7］。Nrf2在調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激中起著重要作用。Nrf2生理狀態(tài)下無活性，通常與胞質(zhì)中的Keap1結(jié)合，泛素化后被蛋白酶降解，當受到氧化刺激時，兩者解偶聯(lián)，Nrf2入核并與Maf結(jié)合成異二聚體后與ARE結(jié)合，激活通路下游編碼Ⅱ相解毒酶基因和抗氧化相關(guān)蛋白的轉(zhuǎn)錄，使SOD、HO?1、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH?Px）、過氧化氫酶（CAT）等抗氧化酶表達增加［2，12］。SOD是清除氧自由基的關(guān)鍵酶，其與HO?1被Nrf2激活后通過分解血紅素生成的膽綠素和一氧化碳（CO）共同發(fā)揮清除氧自由基、抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、細胞保護等作用［13］。本研究結(jié)果顯示，NS組MDA、PCO處于較低水平，而SOD處于中等水平，此時氧化抗氧化反應(yīng)處于低水平平衡狀態(tài)，肺組織Nrf2及HO?1蛋白較少表達；當腹腔注射LPS后，肺組織形態(tài)學(xué)的改變，病理學(xué)評分增加、p（O）2降低以及肺W/D增高，說明大鼠出現(xiàn)ALI；SOD減少，MDA、PCO明顯增多，SOD/MDA及SOD/PCO均明顯降低，說明此時機體氧化應(yīng)激反應(yīng)強于抗氧化應(yīng)激反應(yīng)，血清中檢測出的SOD較NS組減少，但肺組織Nrf2及HO?1蛋白增多，考慮可能是由于氧化刺激使部分Nrf2入核被活化，激活Keap1?Nrf2/ARE信號通路，因此檢測出的Nrf2及HO?1蛋白增多，SOD因為清除自由基及氧化損傷產(chǎn)物被消耗，故而血清中檢測出較少的SOD；FMT后，Nrf2及HO?1蛋白、SOD均較LPS組明顯增多，MDA、PCO減少，SOD/MDA及SOD/PCO明顯升高，且與NS組數(shù)值接近，表明此時機體抗氧化能力明顯增強，使氧化抗氧化再次達到平衡，考慮可能原因是Nrf2大量入核被活化，顯著激活Keap1?Nrf2/ARE信號通路，使抗氧化物明顯增加；FMT組肺損傷病理學(xué)評分降低、肺W/D下降及p（O）2的升高，均說明ALI得到改善。以上結(jié)果表明，肺組織中Nrf2、HO?1及血清中的SOD、MDA、PCO水平與肺組織損傷及修復(fù)有關(guān)，提示FMT干預(yù)LPS誘導(dǎo)的大鼠ALI的作用機制與激活Keap1?Nrf2/ARE信號通路相關(guān)。

人體腸道細菌數(shù)目龐大，正常腸道菌群在調(diào)節(jié)宿主免疫系統(tǒng)、影響發(fā)育和生理等方面均發(fā)揮著重要作用，維持腸道微生態(tài)平衡，可避免許多疾病發(fā)生［3］。當腸道菌群紊亂時，可導(dǎo)致許多腸內(nèi)外疾病的發(fā)生。近年FMT在糾正菌群紊亂、修復(fù)腸屏障以及調(diào)節(jié)免疫等方面作用的研究取得了重要進展［14］。研究發(fā)現(xiàn)腸道菌群可通過“腸?肺軸”影響呼吸系統(tǒng)疾病的病理改變和免疫功能［15］。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)LPS組大鼠在出現(xiàn)ALI的同時腸道菌群發(fā)生了改變［5?6］。本研究發(fā)現(xiàn)LPS組Beta多樣性與NS組及LPS組有差異，其中乳酸桿菌科、消化鏈球菌科減少，紫單胞菌科明顯增多；FMT組與NS組在Alpha多樣性及Beta多樣性上相似，表明其菌群結(jié)構(gòu)、多樣性、豐度相似；同時，F(xiàn)MT組大鼠肺損傷情況較LPS組得到了改善，說明FMT對LPS誘導(dǎo)的ALI存在一定干預(yù)作用，這也與前述的“腸?肺軸”理論相符合，但其具體干預(yù)機制目前尚不明確。研究表明腸道菌群的代謝產(chǎn)物如乙酸、丙酸、丁酸等短鏈脂肪酸具有調(diào)節(jié)免疫、對抗炎癥、提供能量等作用［16?17］。本研究中也發(fā)現(xiàn)LPS組菌群結(jié)構(gòu)與NS組及FMT組有差異，因此考慮腸道菌群代謝產(chǎn)物的變化可能在上調(diào)Nrf2活化，激活Keap1?Nrf2/ARE信號通路中起重要作用。

綜上，F(xiàn)MT在LPS誘導(dǎo)的大鼠ALI中有一定的治療作用，其作用機制與上調(diào)Nrf2活化，激活Keap1?Nrf2/ARE信號通路，增加下游抗氧化物產(chǎn)生，從而減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)，腸道菌群的代謝產(chǎn)物短鏈脂肪酸可能在其中發(fā)揮重要作用，但其具體機制目前尚不明確，后期需進行相關(guān)實驗深入研究。