微生物快速檢驗技術的臨床研究進展

李東明，張健東(通信作者)

天津市第三中心醫院·天津市重癥疾病體外生命支持重點實驗室·天津市人工細胞工程技術研究中心·天津市肝膽研究所 (天津 300170)

微生物感染性疾病具有起病急、進展快的特點，延遲治療、療程不足或抗感染治療不當均可影響患者預后。以往臨床對微生物感染性疾病患者多采用經驗性治療，但抗菌藥物的大量使用導致微生物對抗生素的耐藥性不斷增強，極大地增加了臨床治療難度。早期精準識別微生物病原體對治療和控制疾病具有十分重要的意義。微生物病原體鑒定是臨床微生物檢驗中最基礎的內容，但傳統的微生物檢驗方法操作復雜，要求檢驗人員具備較高的專業水平及豐富的檢驗經驗，且檢驗過程耗時較長，在臨床推廣應用中具有一定的局限性。近年來，隨著微生物快速檢驗技術的發展，免疫學檢驗技術、分子生物學檢驗技術、生物分子傳感器技術、生物基因芯片技術等逐漸在臨床檢驗中得到應用，并取得了一定的效果。基于此，本文將微生物快速檢驗技術的臨床研究進展綜述如下。

1 免疫學檢驗技術

免疫學檢驗技術已逐漸成為快速檢驗微生物最常用的方法之一，且有研究表明，該技術可有效簡化檢驗步驟，加快檢驗速度，提高檢驗準確度[1]。經分析，其原因為，免疫學檢驗技術是將免疫學原理作為理論依據，在對檢驗標本進行敏感標識操作后，利用“示蹤技術”對各類生理免疫學指標及病理免疫學指標進行特異檢驗，可省略掉進行病毒和細菌培養的過程，故可節省檢驗用時，提升檢驗效率。

目前，臨床常用的免疫學檢驗技術為熒光免疫分析技術及酶聯免疫分析技術。其中，熒光免疫分析技術是將熒光素作為抗原標志物，利用抗原抗體反應在熒光顯微鏡下呈現出的熒光特異性抗原抗體復合物檢測微生物的存在。呂治林[2]使用炭疽桿菌細胞壁及莢膜抗原特異的熒光對單克隆抗體進行標記，可快速準確鑒別炭疽桿菌。由此可見，熒光免疫分析技術具有特異性強、檢驗速度快等優點，在微生物快速檢驗中起到重要的作用。酶聯免疫分析技術是一種將酶的催化放大作用與特異性抗原抗體免疫反應相結合的微量分析技術。使用酶標記的抗原或抗體與待檢測抗原或抗體產生免疫反應后，會產生有酶標記的抗原抗體復合物，之后在反映液中加入底物，酶可催化底物水解顯色，因顏色變化可反映酶量的改變，故通過檢測吸光度的變化，可計算出待檢測微生物抗原或抗體的濃度。劉洋等[3]在篩查急診艾滋病病毒抗體時分別采用了膠體層析法、酶聯免疫吸附技術，發現酶聯免疫吸附技術對低、高值質控血清的檢出率高于膠體層析法，且該技術檢測的準確度、靈敏度及特異度均高于膠體層析法。龔亞東等[4]對兒童肺炎支原體感染進行檢驗的結果表明，酶聯免疫檢測法可獲得較好的檢出效果。由此可見，應用酶聯免疫技術進行微生物檢驗具有一定的臨床價值，且隨著全自動免疫分析儀的推廣應用，將兩者聯用，可使微生物檢驗更加準確、快速。

2 分子生物學檢驗技術

分子生物學的迅速發展使微生物臨床檢驗不再局限于研究微生物的外部特征及生理特征，也能對微生物的分子結構，甚至核酸結構進行深入研究。對微生物分子結構和核酸結構的研究可推動微生物檢驗從生化免疫法轉變為基因檢測法。當前，分子生物學技術中的聚合酶鏈反應技術是在特定的環境條件下對DNA片段進行分析，實施體外酶擴增處理，并經由檢驗擴增物質實現快速檢驗微生物的目的，因具有快速、敏捷特異等優點，其逐漸被用于微生物的臨床快速檢驗中。嚴維花等[5]的研究表明，實時熒光定量聚合酶鏈反應技術可為大腸埃希菌的快速準確定量檢測提供支持。左樂等[6]的研究表明，應用多重熒光聚合酶鏈反應技術對15種沙門菌的血清學分型進行鑒定具有操作快速、準確度及特異度高等優點，相對標準偏差均小于2.97%。李玲和楊麗瑋[7]的研究指出，反轉錄聚合酶鏈反應、多重聚合酶鏈反應、實時定量聚合酶鏈反應等聚合酶鏈反應技術在微生物的臨床檢驗中均具有檢測快速及準確度、靈敏度、特異度高的特點，其中熒光定量聚合酶鏈反應技術在微生物臨床檢驗中的準確度更高，可將該技術作為常規的微生物檢驗技術予以推廣。

3 生物分子傳感器技術

生物分子傳感器技術是一項融合了多種現代學科理論知識、借助電化學及生物化學原理進行微生物檢測的技術。與其他的微生物檢驗技術相比，該技術具有獨特的優越性[8]。相關研究顯示，新型的生物分子傳感器可在20 s內檢驗出SARS病毒、天花病毒、炭疽桿菌等微生物，滿足臨床快速準確檢驗微生物的要求[9]。楊趁霞[10]的研究指出，生物分子傳感器技術組的檢驗結果與臨床微生物培養結果(金標準)的符合率為94.00%。由此可見，應用生物分子傳感器技術檢驗微生物快速便捷、準確度較高，具有較高的應用價值。經分析，其原因為，生物分子傳感器技術是一種將傳感器技術與分子診斷技術有效結合的檢驗技術，該技術可將電信號轉變為生化反應信號，并可放大電信號及進行模數轉換，故可準確檢測出被測物質的濃度，有效檢出相應的微生物。

4 生物基因芯片技術

生物基因芯片技術是一種分子生物學技術，可一次性檢測上萬個基因，被認為是基因功能研究中最重大的發明之一。該技術以眾多特定的寡核苷酸片段或基因片段為基因探針，有規律地排列并固定在固相介質(如硅片、玻璃片、尼龍膜等)上，然后形成相應的生物分子點陣，可實現一次試驗同時檢驗多種微生物的目的，特點是檢驗效率高、樣品需求量少，故為臨床微生物檢驗注入了新的活力[11-12]。有研究表明，生物基因芯片技術具有微型化、高通量、可平行性地分析基因表達等優勢，在微生物病原體檢驗、種類鑒別、耐藥基因檢驗等領域發揮著越來越重要的作用[13]。當前已完成多種細菌、病毒等微生物的基因組測序，并將能反映微生物的特殊基因制作成一張芯片，經反轉錄處理后，通過檢驗樣本中有無微生物基因的存在及其表達水平，便可明確患者感染微生物的情況、當前的感染進程及宿主的反應等，從而利于不斷提高微生物檢驗的效率。也有研究表明，生物基因芯片技術作為前沿的生物微量分析技術，其自動化程度高、重復性好，且具有檢驗結果可靠、快速靈敏等特點，可被用于進行臨床微生物檢驗[14]。經分析，其原因為，在應用生物基因芯片技術檢驗微生物的過程中，需先制備已知微生物的特異性堿基序列基因探針，然后利用核酸分子對其有高度精確性的特點進行分析操作，從而在特定的條件下使被檢驗的微生物生成雙鏈核酸分子。由此可見，該技術的穩定性較高，可精準識別目標微生物，且近年來微生物的耐藥性不斷提高，多重耐藥率也隨之升高，應用生物基因芯片技術進行微生物檢驗可有效檢測出耐藥基因，提高檢測效率[15]。然而，生物基因芯片技術的檢驗成本相對較高，且其具有無法有效識別未制備基因探針的微生物等不足，在微生物檢驗的臨床應用中仍受到限制。未來需不斷加強對生物基因芯片技術的研究，并不斷為新發現的微生物制備特異性堿基序列基因探針，以推動生物基因芯片技術的發展。

5 小結

微生物感染性疾病的快速傳播嚴重影響人們的身體健康。為了有效控制微生物感染性疾病的發生和發展，需采用科學的微生物檢驗技術進行微生物檢驗，以便為后期治療提供參考。隨著微生物檢驗技術的快速發展，已出現的快速微生物檢驗技術包括免疫學檢驗技術、生物基因芯片技術、分子生物學檢驗技術及生物分子傳感器技術等，臨床需依據微生物的流行病學特征選取最為適宜的檢驗技術。目前，微生物快速檢驗技術不斷向高通量、微型化方向發展，且越來越多的智能化、自動化微生物檢驗設備被研發，并被應用于臨床，使微生物檢驗更加快速準確、微生物快速檢驗技術得以長足發展。