紫甘藍(lán)色素的提取純化及性質(zhì)分析

＊呂楚瀅 劉軍民

（中山大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院 廣東 510275）

1.背景

色素通常分為天然色素和合成色素，其中花青素是最為人所知的一類色素，而紫甘藍(lán)色素是花青素中的一員。紫甘藍(lán)為十字花科蕓薹屬，原產(chǎn)于歐洲地中海沿岸至北海沿岸地區(qū)，現(xiàn)如今在我國已廣泛種植。紫甘藍(lán)色素通常是指以花青素與糖苷結(jié)合的形式存在的花色苷結(jié)構(gòu)[1]。紫甘藍(lán)色素具有天然無毒，色彩鮮艷以及抗氧化的優(yōu)點(diǎn)，可應(yīng)用于衣物染色[2]、食品添加劑[3]和腫瘤治療[4]等方面。

(1)天然色素

天然色素是指從天然原料（一般為植物）中提取出來的色素，可分為三類。第一類是類黃酮類色素，基本結(jié)構(gòu)為2-苯基苯并吡喃酮，具有清除氧自由基的功能，所以常用于藥物。本實(shí)驗(yàn)研究的花色苷就是一種類黃酮類色素。第二類是醌類色素，具有很強(qiáng)的鰲合性，故要避免和金屬離子接觸。第三類是類胡蘿卜素類色素，通常為共軛烯烴結(jié)構(gòu)，是一種脂溶性色素，對光、熱和金屬過氧化物敏感。

(2)花色苷結(jié)構(gòu)

圖1 花色苷的結(jié)構(gòu)

花色苷（Anthocyanin）是指花色素與糖分子通過糖苷鍵結(jié)合而成的化合物（圖1），花色素的結(jié)構(gòu)為2-苯基苯并吡喃型陽離子，其基本骨架為C6-C3-C6。2-苯基苯并吡喃型陽離子結(jié)構(gòu)通常被稱為母核，母核上的羥基和甲氧基的數(shù)量不同造就了花青素種類的不同，常見的有六種：矢車菊色素、芍藥色素、天竺葵色素、飛燕草色素、牽?；ㄉ匾约板\葵色素（表1）[5]。

表1 種類繁多的花色苷[5]

(3)花色苷的提取

花色苷類的色素主要存在于植物體中的花、葉和果實(shí)等部位，其中含有的酚類化合物是具有抗氧化作用的活性物質(zhì)，可以入藥，提取的目的是要提出其中的多酚類物質(zhì)。花色苷在pH值較小的條件下穩(wěn)定存在，因此大多數(shù)花色苷提取的方法都在酸性溶液中進(jìn)行。

①溶劑提取法?；ㄉ战Y(jié)構(gòu)中含有若干個(gè)羥基和甲氧基，是一種極性化合物。根據(jù)溶液的相似相溶原理，花色苷常用極性溶液溶解。常規(guī)的溶劑是水和甲醇、乙醇或者丙酮等極性溶劑的混合物。用于食物時(shí)，出于安全考慮，也用檸檬酸、酒石酸等酸性溫和的酸作提取液。因?yàn)闃悠分谐３：卸喾N抗氧化物質(zhì)，所以沒有一種溶劑可以同時(shí)將樣品中的所有有機(jī)物都提取出來，一般都需要多種溶劑混用。

②超聲波輔助提取法。超聲波是指頻率高于2×104Hz的聲波，具有能量集中的特點(diǎn)。它可以使花青素溶液中產(chǎn)生氣泡，在持續(xù)的聲波作用下氣泡會(huì)爆炸性破裂，產(chǎn)生局部壓力，使植物細(xì)胞破裂。

③微波提取法。微波是指頻率在300MHz-300GHz的電磁波。微波的加熱方式是體加熱，不同于常規(guī)加熱。常規(guī)的加熱方式是通過熱輻射由表及里進(jìn)行傳導(dǎo)式加熱，能量利用效率低且溫度分布不勻。而微波加熱是將吸收的電磁能轉(zhuǎn)變成為熱能，升溫快并且里外溫度相差不大。在2011年，Liazid等人[6]在100℃和磁力攪拌下，25mL的40%的甲醇水溶劑中，選擇500W的功率，實(shí)現(xiàn)了在5min內(nèi)從葡萄皮中提取了花色苷，且重復(fù)性良好。由于微波提取具有能量效率高、可重復(fù)性和選擇性優(yōu)越的特點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)采用微波提取的方法。

(4)花色苷的純化

經(jīng)過初步提取的色素水溶液中除了有我們所需要的多酚類物質(zhì)，還有許多的糖、酸等大分子雜質(zhì)，需要對粗提取液進(jìn)一步純化。

①膜分離法。膜分離法是利用各種天然或人工制造的具有選擇透過性的膜，如超濾膜、滲透膜和反滲透膜等，對粗提取液進(jìn)行過濾，具有節(jié)能、分離效率高和產(chǎn)品質(zhì)量高的優(yōu)點(diǎn)。但由于該方法對設(shè)備要求較高，成本昂貴，不適用于工業(yè)應(yīng)用。②重結(jié)晶法。使用醋酸鉛使色素沉淀，過濾，酸洗，再過濾，得到純度較高的花色苷溶液。但由于醋酸鉛有毒，該法不適用于食用色素的提純。③柱層析法。柱層析法通常選擇氧化鋁和硅膠作吸附劑。吸附劑將混合物中的各組分從溶液中吸附到其表面上，然后再用溶劑洗脫。由于各組分被吸附的程度不同，吸附強(qiáng)的組分移動(dòng)慢，后洗出，吸附弱的組分移動(dòng)快，先洗出，從而達(dá)到分離的目的。出于成本和可操作性的考慮，本實(shí)驗(yàn)采用的是最常用的柱層析法。

本文選取紫甘藍(lán)為研究對象，通過微波萃取和柱層析法提取和純化天然的紫甘藍(lán)色素，并探究不同酸度和金屬離子對其穩(wěn)定性的影響，為花色苷的工業(yè)生產(chǎn)提供依據(jù)。

2.實(shí)驗(yàn)部分

(1)實(shí)驗(yàn)試劑

濃鹽酸（Hydrochloric Acid,HCl），丙酮（Acetone），正丁醇（n-butanol），硫酸鋁（Aluminium Sulpate），氯化鉀（Potassium Chloride），氯化鎂（Magnesium Chloride），氯化鎳（II）六水（Nickel（II）Chloride Hexahydrate），醋酸鉛（Lead Acetate），乙酸銅（Cupric Acetate Monohydrate），硅膠（Silica Gel），均為分析純，購于廣州化學(xué)試劑廠，使用時(shí)根據(jù)需要進(jìn)行干燥純化操作或直接使用。

(2)實(shí)驗(yàn)儀器

MCR-3微波化學(xué)反應(yīng)器：采用非脈沖微波連續(xù)加熱，設(shè)定功率檔位為7檔，輻射溫度60℃和輻射時(shí)間為180s；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：采用Heidolph Hei-VAP Value Digital型號；上海元析牌紫外可見光度計(jì)：采用掃描型UV-6000PC型號；真空干燥箱、酸度計(jì)。以上試劑與儀器均由中山大學(xué)東校區(qū)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心提供。

(3)紫甘藍(lán)色素的提取和純化

①洗凈晾干切碎紫甘藍(lán)并準(zhǔn)確稱取1 0 g（實(shí)際為10.1825g），置于1個(gè)錐形瓶中。加入50mL的0.35mol/L鹽酸，微波輻射3min，趁熱過濾，得到色素粗提取液。色素粗提液旋蒸至約5mL時(shí)取出，用于柱層析中的濕法上樣。②用硅膠作為吸附劑，濕法裝柱，濕法上樣，柱層析進(jìn)行純化，流動(dòng)相為正丁醇:丙酮:水:鹽酸=6:1:1:2。收集紅色洗脫液，經(jīng)過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)旋干，并真空干燥得到紅色粉末，稱重為0.4126g，提純率為4.05%。③取適量色素膠質(zhì)，在50mL容量瓶中配為色素水溶液，利用紫外可見分光光譜儀進(jìn)行吸收光譜掃描，控制其吸光度范圍在0.1-1.0之間。

(4)探究不同酸度對紫甘藍(lán)天然色素的影響

①在50mL容量瓶中，配置0.1mol/L鹽酸溶液和0.1mol/L氫氧化鈉水溶液。②用0.1mol/L鹽酸溶液，0.1mol/L氫氧化鈉水溶液，以及蒸餾水，按不同體積比配制pH為3，5，7，9，11的溶液，分別取3mL不同酸度的溶液，放置于5個(gè)干凈的試管中。③在以上試管中，分別逐滴加入2mL的色素溶液，放置10min，發(fā)現(xiàn)不同樣品呈現(xiàn)出不同程度的粉色，然后測吸光度。

(5)探究金屬離子對紫甘藍(lán)天然色素的影響

①在6個(gè)干凈試管中分別加入配好的4mL色素水溶液。②在6個(gè)含4mL色素水溶液的試管中，分別逐滴加入1mL配好的0.1mol/L的K+、Cu2+、Mg2+、Al3+、Ni2+及Pb2+離子溶液。③放置10min，發(fā)現(xiàn)不同樣品呈現(xiàn)不同的顏色，然后測吸光度。

3.結(jié)果與分析

(1)不同酸度對色素性質(zhì)的影響

圖2 不同酸度的色素溶液的紫外可見光譜曲線

圖3 不同pH值下花色苷結(jié)構(gòu)的變化[5]

表2 不同酸度的紫甘藍(lán)色素溶液的吸光度

因?yàn)榭瞻捉M用的是5mL的原色素溶液，其最大的Abs值為0.363（見圖2中的黑色線），而實(shí)驗(yàn)組均為2mL原色素溶液和3mL不同pH值的水溶液的混合液，所以經(jīng)朗伯-比爾定律A=Kcl公式（其中K為摩爾吸光系數(shù)，c為吸光物質(zhì)的濃度，l為吸收介質(zhì)的厚度）校正得，2mL的原色素溶液稀釋成5mL溶液后，其最大的Abs值應(yīng)為0.145。

隨pH增大，溶液的顏色從粉紅變成淡粉，顏色逐漸變淺。在pH值為3-5的范圍內(nèi)，色素溶液的最大吸收波長幾乎不變，但吸光度逐漸減小；當(dāng)pH值提高到7時(shí)，吸光度有一個(gè)小幅度的提高；而pH為9-11時(shí)，吸收波長紅移，吸光度繼續(xù)減?。▓D2和表2）。

這是因?yàn)榛ㄉ站哂幸环N受酸堿條件影響較大的結(jié)構(gòu)。在不同的pH條件下，花色苷有四種不同的結(jié)構(gòu)形式（圖3）：淺紫色的醌型堿（Quinoidal Base，A）、紅色的黃烊鹽離子（Flavylium，AH+）、無色的甲醇假堿（Carbinol Pseudobase，B）、無色的查耳酮（Chalcone，C）。當(dāng)溶液的pH值較小時(shí)，花青素以紅色的黃烊鹽陽離子（AH+）的形式存在，當(dāng)pH值增大時(shí)，水分子親核攻擊AH+的2位，破壞其雙鍵，生成的無色甲醇假堿B，吸光度下降。當(dāng)pH值繼續(xù)增大到7-9范圍時(shí)，B會(huì)脫去質(zhì)子形成藍(lán)色的醌型堿，吸光度增大。當(dāng)pH值大于9后，隨pH值增大，醌型堿會(huì)開環(huán)變成查耳酮C，吸光度會(huì)降低。

(2)不同金屬離子對色素性質(zhì)的影響

空白組用的是5mL的原色素溶液，其最大的Abs值為0.363（見圖4中的黑色線），而實(shí)驗(yàn)組均為4mL原色素溶液和1mL不同金屬離子的水溶液的混合液，所以經(jīng)朗伯-比爾定律校正得，4mL的原色素溶液稀釋成5mL溶液后，其最大的Abs值應(yīng)為0.290。

隨著K+、Mg2+水溶液的加入，溶液的最大吸收波長幾乎沒變，都保持在525nm左右，顏色為粉紅色。隨著Ni2+的溶液的加入，溶液的最大吸收波仍在525nm左右，但是吸光度有所下降，為淺粉色。加入Al3+離子溶液之后溶液顏色變成了深紫色，最大吸收波長紅移至565nm，吸光度急劇增大。加入Pb2+離子溶液后，顏色為綠色，最大吸收波長紅移至600nm，吸光度上升。而加入Cu2+后溶液顏色變成淺綠，吸收波長也紅移至600nm，吸光度降低（圖5和表3）。

圖4 加入不同金屬離子溶液的色素溶液的紫外光譜曲線

圖5 加入不同金屬離子水溶液后的色素水溶液

表3 加入不同金屬離子溶液的色素溶液的吸光度

分析原因可知，花色苷分子含酚羥基和γ-吡喃酮環(huán)，容易與金屬離子發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，形成紫甘藍(lán)-金屬離子絡(luò)合物，可吸收紫外或可見光區(qū)的某一部分波長而發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移躍遷，電子從酚氧基配體的π軌道躍遷到金屬離子的某一軌道，使紫甘藍(lán)在紫外-可見區(qū)域吸收發(fā)生改變。K+和Mg2+可能沒有與花色苷發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，查閱文獻(xiàn)可知，Mg2+對花色苷有穩(wěn)定作用，在植物體中大量存在[7]。而Ni2+和Cu2+離子，其價(jià)電子層結(jié)構(gòu)分別為3d8和3d9，（n-1）d軌道未填滿，可與花色苷配位，形成內(nèi)軌配合物，發(fā)生配位電荷轉(zhuǎn)移，表現(xiàn)為顏色變淺。因Cu2+離子溶液本身是藍(lán)色，加入色素溶液后變成淺綠色。Al3+和Pb2+離子最外層的s、p和d軌道都是空軌道，可與花色苷配位得到外軌配合物，電子由花色苷躍遷至金屬離子的空軌道時(shí)，波長紅移，吸光度增加，溶液顏色變深，其中以Al3+的增色效應(yīng)最明顯。

4.結(jié)語

本實(shí)驗(yàn)提取并純化了紫甘藍(lán)色素以及測試了不同酸度和金屬離子對紫甘藍(lán)色素的影響，結(jié)果表明，在不同酸度的溶液中，花色苷分子有四種不同的形態(tài)，分別對應(yīng)不同的顏色。在金屬離子溶液中，由于花色苷分子含酚羥基和γ-吡喃酮環(huán)，所以易與Ni2+、Cu2+、Al3+和Pb2+離子發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，生成不同顏色的復(fù)合物。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)需要使用微波萃取儀、柱層析分離裝置、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀和紫外可見吸收光譜儀等儀器，可以使材料化學(xué)專業(yè)的同學(xué)熟悉完整的由物質(zhì)制備純化到物質(zhì)性質(zhì)研究的整個(gè)流程，了解常用的分離提純裝置和測試表征儀器，提高他們的動(dòng)手能力，綜合運(yùn)用課堂所學(xué)的基礎(chǔ)知識，深化對材料的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的了解，拓寬知識面，為后續(xù)學(xué)習(xí)和未來的科研道路奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。