酒石酸唑吡坦在模擬失重狀態下SD大鼠體內十二指腸吸收特性*

張旸，井娟，趙軍，張瑞濤，徐媛，劉雪英，王慶偉

(1.中國人民解放軍空軍軍醫大學第二附屬醫院藥劑科，西安 710038；2.中國人民解放軍陸軍軍醫大學士官學校，石家莊 050081；3.中國人民解放軍空軍軍醫大學藥學系藥物化學教研室，西安 710032)

航天員進入太空后，由于晝夜頻繁更迭會造成生物鐘紊亂，容易引起睡眠障礙。酒石酸唑吡坦(zolpidem tartrate，ZPD)用于治療失眠癥，可選擇性與苯二氮 ω1受體結合，常規治療期內極少產生耐受性和身體依賴性，唑吡坦的不良反應發生率較其他鎮靜催眠藥物低[1]，例如肝腎功能、心血管疾病方面的不良反應發生率十分罕見[2]，撤藥后反跳反應及戒斷反應也少于其他鎮靜催眠藥物，更多地不良反應則以頭痛和頭暈、口干、便秘等現象為主[3]。因此，安全性比較高的酒石酸唑吡坦類藥物適于作為航天員在失重環境下調整睡眠的一線用藥。但是由于航天失重環境會引起機體生理功能改變，進而影響到藥物的藥動學及藥效學特征，從而給航天用藥帶來隱患[4]。同時十二指腸是酒石酸唑吡坦在體內的主要吸收部位[5]，因此需要考察模擬失重狀態下酒石酸唑吡坦在十二指腸中吸收如何改變。

1 材料與方法

1.1儀器 1200高效液相色譜儀(美國安捷倫科技有限公司)；BP221S型萬分之一電子分析天平(德國塞多利斯，感量：0.01 mg)；BT100-1F 型蠕動泵驅動器(保定蘭格恒流泵有限公司)；RWD510 型動物麻醉系統(深圳市瑞德沃生命科技有限公司)；Milli-Q Advantage A10超純水機(德國默克密理博)；KH5200DV超聲儀(浙江昆山禾創超聲儀器有限公司)。

1.2試藥 酒石酸唑吡坦對照品(中國食品藥品檢定研究院，含量：97.2%，批號：171258-201602)；酒石酸唑吡坦原料(上海曙燦實業有限公司，批號：99295-93-6，純度85.0%)；自制純水；甲醇和磷酸為色譜純；其余試劑為市售分析純；水為色譜用水和純化水。

1.3動物 清潔級健康雄性SD大鼠，體質量(220±20)g，由空軍軍醫大學動物實驗中心提供，動物質量合格證號：醫動字第08-005號，動物許可證號：SCXK(軍)2014-007。在實驗室溫度約25 ℃以及適宜濕度的條件下喂養7 d，實驗前一天間隔12 h不投放飼料，但可以正常飲水。

1.4方法

1.4.1模擬失重大鼠模型的建立 將SD大鼠隨機分為4組模型(模擬失重1，2，3，4周)，每組6只。將模型組大鼠尾部清潔后基部剔毛，乙醇消毒并風干，涂抹松香酊，稍晾干，兩側用醫用膠布貼合并橫向固定，膠布末端系繩，連接可裝卸式鏈條，鏈條另一端固定至籠頂的不銹鋼轉環；調整繩子的長度使大鼠后肢懸垂剛剛脫離水平面，身體與水平面成30 °～40 °夾角，而大鼠仍可自由旋轉及自由飲食，每日光照和黑暗時間各12 h，每只大鼠單獨飼養[6]。

1.4.2Krebs-Ringer(K-R)試液 稱取氯化鈣0.37 g、葡萄糖1.4 g，先加入少量純化水使溶解，然后分別稱取氯化鈉7.8 g、氯化鎂0.02 g、氯化鉀0.35 g、磷酸二氫鉀0.32 g與碳酸氫鈉1.37 g，加入純化水不斷攪拌溶解后再與氯化鈣及葡萄糖溶液混勻，用純化水稀釋并定容至1 L，所得溶液即為K-R試液，臨用前使用1.0 mol·L-1NaOH或1.0 mol·L-1HCl調節pH值。

1.4.3對照品溶液 分別精密稱定酒石酸唑吡坦對照品4.0 mg，加入K-R液超聲并充分溶解后用10 mL棕色量瓶中定容，制得400 μg·mL-1酒石酸唑吡坦對照品儲備液。取對照品儲備液2 mL，稀釋定容至8.0 mL，制得100 μg·mL-1酒石酸唑吡坦對照品溶液。

1.4.4供試液 分別精密稱定酒石酸唑吡坦原料藥5.0 mg，用K-R溶液溶解至50 mL量瓶中，制得100 μg·mL-1供試液。

1.4.5空白對照液 吸取K-R試液適量，按照大鼠在體單向腸灌流(single pass intestinal perfusion，SPIP)實驗操作方法，將流出腸灌流液收集即得。

1.4.6HPLC色譜條件 Intertsil ODS-3色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)，加預柱：Waters X Terra C18柱；流動相：乙腈-甲醇-磷酸緩沖液(0.15%磷酸、0.15%三乙胺)按20：17：63比例配制，等度洗脫，洗脫時間15 min。檢測波長為254 nm。柱溫：25 ℃。流速為1.0 mL·min-1，進樣量：10 μL。

1.4.7方法學考察

①專屬性。精密量取對照品溶液、“1.4.4”項下腸灌流液、空白對照液按“1.4.6”項下色譜條下進樣分析。

②標準曲線的繪制。精密量取“1.4.3”項下酒石酸唑吡坦對照品儲備液，用K-R液稀釋為5，10，20，50，100，200 μg·mL-1的系列標準溶液。取上述溶液按“1.4.6”項下色譜條件進樣分析，以酒石酸唑吡坦峰面積(Y)對濃度(X，μg·mL-1)進行線性回歸。

③精密度。分別吸取酒石酸唑吡坦低、中、高不同濃度(5，50，200 μg·mL-1)的對照品溶液，按“1.4.6”項下色譜條件每個濃度溶液連續進樣6次。

④穩定性。取酒石酸唑吡坦腸灌流液分別在0，2，4，8，12，24 h按“1.4.6”項下色譜條件進樣測定。

⑤回收率。吸取已知含量的酒石酸唑吡坦腸灌流液9份，每份吸取0.5 mL，分成3組，一組3份。每組加入體積為0.2，0.25，0.3 mL濃度為100 μg·mL-1的對照品溶液，再加入K-R液稀釋至1.0 mL，按“1.4.6”項下色譜條件進樣測定，計算加樣回收率。

1.4.8大鼠在體單向腸灌流實驗 將模擬失重組SD大鼠和正常組SD大鼠禁食12 h以后麻醉，麻醉方式采用吸入異氟烷，仰臥方式固定在實驗臺，沿大鼠腹部中線打開腹腔，將供試腸段(十二指腸)分離出來，長度選取約為10 cm。將十二指腸兩端切口并插管用縫合線結扎，提前將0.9%氯化鈉溶液加熱到37 ℃并沖洗腸道內容物。同時預熱供試液至37 ℃，然后以1.0 mL·min-1的流速灌流沖洗10 min，收集灌流液。隨后調整流速至0.2 mL·min-1，平衡30 min。灌流瓶加入供試液稱質量并記錄質量，在進口端以0.2 mL·min-1的流速進行灌流，收集液小瓶稱質量并記錄，放在出口端每隔15 min收集一份腸灌流液，共計收集2 h。收集完成后稱質量供試液小瓶與收集灌流液小瓶質量并記錄。灌流實驗結束后剪下十二指腸段并測量其長度與內徑。

灌流液3000×g離心10 min，離心后吸取上清液，再用孔徑0.22 μm微孔濾膜濾過，最后進行樣品分析。由于腸道對灌流液水分吸收會造成體積改變，本實驗采用重量法對灌流液體積進行校正，并利用以下公式[7]計算藥物的吸收速率參數(Ka)和有效滲透系數(Peff)：

式中Vin與Vout分別為進口端與出口端的灌流液體積[灌流液密度預定為1 g·(cm3)-1]，Cin和Cout分別為進口端和出口端灌流液濃度，l與r分別為十二指腸腸段的長度與內徑(cm)，Q為灌流速度。

2 結果

2.1專屬性 實驗結果顯示保留時間4.2 min處腸灌流液與對照品，并且空白對照液沒有雜質干擾，見圖1。

A.空白對照液；B.對照品；C.腸灌流液。

2.2標準曲線 腸灌流液中酒石酸唑吡坦的標準曲線回歸方程為：Y=27.233 4X-10.572 2，r=0.999 9，表明酒石酸唑吡坦在5～200 μg·mL-1濃度范圍內線性關系良好。

2.3精密度 通過對測得酒石酸唑吡坦低、中、高濃度的峰面積進行計算得到精密度RSD分別為0.41%，0.36%，0.23%(n=6)。

2.4穩定性 通過對測得酒石酸唑吡坦峰面積進行計算得出樣品在24 h內RSD為0.72%(n=6)，樣品含量變化符合要求，表明供試液在24 h內穩定性良好。

2.5回收率 酒石酸唑吡坦在K-R試液中平均回收率為99.63%，RSD為0.43%(n=9)。

2.6酒石酸唑吡坦SD大鼠十二指腸吸收動力學 酒石酸唑吡坦在模擬失重狀態下與正常組SD大鼠十二指腸段中的吸收情況見表1。結果表明酒石酸唑吡坦在模擬失重狀態下SD大鼠體內十二指腸Peff和Ka均小于正常組SD大鼠，差異有統計學意義(P<0.05)，并且模擬失重2周時Ka最小，第4周時趨于正常，但仍小于正常組吸收參數。因此模擬失重狀態對會減少酒石酸唑吡坦在SD大鼠十二指腸段吸收程度和吸收速度。

表1 十二指腸的吸收參數

3 討論

大鼠在體SPIP技術十分成熟，重復性高，同時對大鼠腸黏膜的損傷較小，因此已經成為FDA認可的可用于研究藥物吸收的方法之一。該方法可以保證在實驗過程中實驗對象的神經支配和血液供應都得到較完整的保護，測得結果與人體腸道吸收近似[8-9]。本次實驗采用SPIP研究酒石酸唑吡坦在模擬失重狀態下SD大鼠體內十二指腸吸收特性分析，通過與正常狀態SD大鼠十二指腸吸收參數進行比較，為航天中宇航員精準用藥提供依據。

目前人體模擬失重的主要方法有浸水實驗、頭低位臥床等[10]。動物模擬失重模型主要有尾部懸吊模型。該方法是一種成熟的方法，可以創建基于地面的失重模型，模仿與太空飛行相關的許多生理變化[11]。故本實驗采用經典Morey-Holton大鼠尾吊模型[6]，該造模方法為將SD大鼠尾部固定，并且調整長度使大鼠后肢懸垂脫離水平面，使大鼠身體與水平面夾角成30°。該模型能有效模擬真實太空飛行中宇航員的一系列生理變化，例如尿量增大，骨和肌肉萎縮，頭頸部水腫等改變。根據CHOWDHURY等[12]通過對比模擬失重動物模型中尾部懸掛與骨盆懸掛研究發現，該模型具有穩定、創傷小，在實驗過程中動物可以保證正常的體質量增長以及較少的骨骼畸變等優點。所以，該方法被認為是目前動物模擬失重的最理想造模方式之一。

建立酒石酸唑吡坦含量測定方法時，經過對比不同型號色譜柱的保留時間以及樣品峰型，最終確定使用Intertsil ODS-3型色譜柱。同時考察了不同流動相以及流動相比例的效果。起初采用0.05 moL·L-1磷酸溶液作為流動相水相，但發現樣品峰型有拖尾現象，故采用加入三乙胺調節pH值，最終確定流動相水相中分別加入0.15%磷酸以及三乙胺時，色譜峰出峰時間以及峰型效果最佳。最初流動相比例為水相占83%，甲醇占7%，乙腈占10%，導致出峰時間在約27 min，出峰時間過長，故調整流動相比例最終為乙腈(20%)-甲醇(17%)-磷酸緩沖液(63%)，出峰時間顯著提前到約4.2 min。

灌流實驗中，腸道在吸收藥物的同時也會吸收或分泌水分，造成腸灌流液出口端的質量濃度發生變化，所以需要對出口液體積進行校正。校正方法通常為酚紅法和重量法，但是研究發現酚紅在腸道內會存在一定程度的吸收，對實驗結果產生影響，所以此次實驗采用重量法進行校正[13]。同時在實驗過程中，藥物會有部分吸附到灌流管路中，為了使灌流儀中管路等實驗器材對實驗結果的干擾最小，需要在正式實驗前預平衡30 min。

酒石酸唑吡坦由于不良反應較少，是航天員在太空中治療失眠的一線用藥[13-14]。但由于失重狀態下會引起藥物在體內吸收發生變化，進而導致藥物在體內的藥動學及藥效學特征改變[16-17]，從而影響航天員用藥安全，根據微重力狀態下藥物代謝變化規律制定個體化給藥方案，是奠定航天中安全、高效用藥的重要基礎之一。實驗研究發現，失重狀態下十二指腸的Peff和Ka較正常組變化很大，均小于正常組大鼠。模擬失重2周時吸收速率參數最低，模擬失重4周時吸收參數趨于正常。文獻[18]報道，隨著模擬失重時間不斷增加，機體會產生較大應激反應，此時大鼠體液丟失、體質量降低、蛋白質合成減少以及肌肉萎縮等原因造成藥物在體內的吸收、分布、代謝以及排泄過程都發生了改變。因此當失重時間達到2周的時候，大鼠機體正處于應激狀態，導致酒石酸唑吡坦在大鼠體內吸收降低。失重4周的時候大鼠已經適應了失重狀態，體內的應激反應減小，所以吸收參數較前3周趨于正常狀態。Peff和Ka是決定藥物在腸道吸收速度與程度的重要參數，本實驗說明在失重狀態下，SD大鼠對酒石酸唑吡坦吸收程度和吸收速度減少，如果航天員采用正常劑量服藥，可能會造成藥物藥效降低，無法起到治療失眠作用。但是具體如何調整還需要進一步進行藥動學以及藥物代謝酶相關研究。