高效液相色譜法測定苦木注射液中7種生物堿含量*

賴正權，艾偉鵬，廖慧君，廖祝元，丘金燕，蔡雨峰，楊婷婷，黃裕茵，廖醒環，蘇子仁

[1.深圳大學總醫院藥學部，深圳 518055；2.華中科技大學協和深圳醫院(深圳大學第六附屬醫院)藥學部，深圳 518052；3.江西青峰藥業有限公司，贛州 341000；4.廣州中醫藥大學，中醫藥數理工程研究院，廣州 510006]

苦木注射液收載于《中華人民共和國衛生部藥品標準·中藥成方制劑》第二十冊，為苦木干燥枝或莖經加工制成。其原料苦木[Picrasmaquassioides(D.Don)Benn]為苦木科(Simaroubaceae)苦木屬植物，具有清熱、解毒、消炎的功效，用于感冒、上呼吸道感染、急性扁桃體炎、腸炎、細菌性痢疾等[1]。現代化學研究表明，苦木含有生物堿、苦味素、三萜類和揮發油類等化學成分，其中生物堿及苦味素為其主要的藥效成分[2-12]，具有抗菌消炎、解熱降壓、抗腫瘤、抗蛇毒和抗瘧等作用[13-16]。

部頒標準中對苦木注射液的質量控制方法僅有薄層色譜法及重量法，質量控制方法有待提高。有文獻報道采用高效液相色譜法單獨測定苦木注射液中鐵屎米酮類或咔巴啉類生物堿的含量[17-18]，其標準多側重于測定苦木注射液中同類母核結構成分的含量，而同時測定多個母核結構成分的方法尚未見報道。為確保該品種的質量穩定、可控，本實驗建立HPLC法同時測定苦木注射液中鐵屎米酮類和咔巴啉類共7個生物堿含量的分析方法，可為該品種質量控制體系的建立提供實驗依據。

1 儀器與試藥

1.1儀器 島津高效液相色譜儀(SPD-M20A PDA檢測器、CTO-20A柱溫箱、SIL-20AC自動進樣器、LC-20AT泵、LC solution色譜工作站，日本島津公司)；試驗室專用超純水機(重慶利迪現代水技術設備有限公司)；BSA224S-SW 電子天平(感量：0.1 mg，德國Sartorius公司)；CP225D電子天平(感量：0.01 mg，德國Sartorius公司)。

1.2試藥 對照品1-甲酸-6-羥基-β-咔巴啉(a)，1-甲酸-β-咔巴啉(b)，1-丙酸基-β-咔巴啉(c)，3-甲基-鐵屎米-5，6-二酮(d)，3-甲基-4-甲氧基-鐵屎米-5，6-二酮(e)，4-甲氧基-5-羥基鐵屎米酮(f)，4，5-二甲氧基-鐵屎米酮(g)由廣州中醫藥大學新藥開發研究中心從苦木[Picrasmaquassioides(D.Don)Benn.]的莖中分離得到，并經四大光譜確定結構式，HPLC歸一法測定純度>98%，可供對照用，化學結構式見圖1。苦木注射液由青峰藥業有限公司提供。甲醇為色譜純(Merck公司)，水為重蒸水，其余試劑均為分析純。

圖1 7個生物堿的化學結構式

2 方法與結果

2.1混合對照品溶液的制備 分別取1-甲酸-6-羥基-β-咔巴啉、1-甲酸-β-咔巴啉、1-丙酸基-β-咔巴啉、3-甲基-鐵屎米-5、6-二酮、3-甲基-4-甲氧基-鐵屎米-5、6-二酮、4-甲氧基-5-羥基鐵屎米酮、4，5-二甲氧基-鐵屎米酮對照品適量，精密稱定，加甲醇制成濃度分別為30，153，22.8，11.4，7.2，12，3 μg·mL-1對照品儲備溶液。4 ℃保存、備用。臨用前，用甲醇按照1，2/3，1/2，1/3，1/6和1/30的比例稀釋對照品儲備溶液，過0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.2供試品溶液的制備 取適量苦木注射液，過孔徑0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.3色譜條件 色譜柱為Phenomenex Gemini C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相30 mmol·L-1乙酸銨(冰乙酸調pH值4.5)溶液(A)-甲醇(B)梯度洗脫(0～6 min，5%→6% B；6～9 min，6%→20% B；9～30 min，20%→23% B；30～40 min，23%→30% B；40～50 min，30%→36% B；50～75 min，36%→65% B；75～80 min，65%→5% B；80～85 min，5% B)；流速1.0 mL·min-1；柱溫30 ℃；進樣量10 μL；檢測波長254 nm。結果化合物a、b、c、d、e、f、g均能達到基線分離，樣品中其他成分對測定無干擾，見圖2。

a.1-甲酸-6-羥基-β-咔巴啉；b.1-甲酸-β-咔巴啉；c.1-丙酸基-β-咔巴啉；d.3-甲基-鐵屎米-5，6-二酮；e.3-甲基-4-甲氧基-鐵屎米-5，6-二酮；f.4-甲氧基-5-羥基鐵屎米酮，g.4，5-二甲氧基-鐵屎米酮。

2.4線性關系考察 精密吸取混合對照品溶液，按“2.1”項下方法分別配制成6個不同質量濃度的對照品溶液，按“2.3”項下色譜條件進行測定。以峰面積為縱坐標(Y)，對照品質量濃度為橫坐標(X)，繪制標準曲線。結果見表1，線性相關系數均>0.999 0，表明線性關系良好。

表1 7個生物堿的線性回歸方程和線性范圍

2.5精密度試驗 取同一份混合對照品溶液(濃度：1/3倍儲備溶液濃度)，按“2.3”項下色譜條件連續進樣6次，結果1-甲酸-6-羥基-β-咔巴啉，1-甲酸-β-咔巴啉，1-丙酸基-β-咔巴啉，3-甲基-鐵屎米-5，6-二酮，3-甲基-4-甲氧基-鐵屎米-5，6-二酮，4-甲氧基-5-羥基鐵屎米酮和4，5-二甲氧基-鐵屎米酮峰面積的RSD分別為0.2%，0.3%，0.1%，1.0%，0.9%，0.5%和0.9%。表明儀器精密度良好。

2.6穩定性試驗 取同一批號苦木注射液(批號：181016)，按“2.2”項下方法制備樣品，在室溫下放置0，4，8，12，24，48 h時，分別按“2.3”項下色譜方法進樣測定，記錄各對照品的峰面積。結果1-甲酸-6-羥基-β-咔巴啉、1-甲酸-β-咔巴啉、1-丙酸基-β-咔巴啉、3-甲基-鐵屎米-5，6-二酮、3-甲基-4-甲氧基-鐵屎米-5，6-二酮、4-甲氧基-5-羥基鐵屎米酮和4，5-二甲氧基-鐵屎米酮峰面積的RSD分別為0.5%，0.7%，0.6%，1.2%，1.8%，0.5%和0.3%。表明供試品溶液在48 h內穩定。

2.7重復性試驗 取同一批號苦木注射液(批號：181016)6份，按照“2.2”項下方法制備樣品，按“2.3”項下色譜方法依次進樣，分別測定7個生物堿的含量。結果1-甲酸-6-羥基-β-咔巴啉、1-甲酸-β-咔巴啉、1-丙酸基-β-咔巴啉、3-甲基-鐵屎米-5，6-二酮、3-甲基-4-甲氧基-鐵屎米-5，6-二酮、4-甲氧基-5-羥基鐵屎米酮和4，5-二甲氧基-鐵屎米酮的平均含量分別為19.14，65.02，11.09，4.89，1.83，4.52，2.03 mg·L-1；RSD分別為0.8%，1.3%，0.4%，1.7%，2.1%，0.7%和0.5%。表明測定方法的重復性良好。

2.8加樣回收率試驗 量取已測含量的苦木注射液(批號：181016)2 500 μL共6份，分別置5 mL量瓶中，準確加入與樣品中含量等量的對照品溶液，加甲醇定容至刻度。按“2.2”項下方法同法制備供試品溶液，按“2.3”項下色譜條件測定，記錄色譜圖，計算回收率，結果見表2。1-甲酸-6-羥基-β-咔巴啉、1-甲酸-β-咔巴啉、1-丙酸基-β-咔巴啉、3-甲基-鐵屎米-5，6-二酮、3-甲基-4-甲氧基-鐵屎米-5，6-二酮、4-甲氧基-5-羥基鐵屎米酮和4，5-二甲氧基-鐵屎米酮的平均回收率分別為100.19%，100.23%，99.22%，100.51%，101.65%，99.69%，101.17%；RSD分別為1.05%，2.12%，0.91%，2.21%，0.97%，0.82%，1.38%。表明本方法符合分析方法學要求。

表2 7個生物堿的加樣回收率試驗結果

2.9樣品測定 取不同批次苦木注射液樣品，分別按“2.2”項下方法制備樣品，按“2.3”項下色譜方法分別進樣，測定7個生物堿的峰面積，計算含量，結果見表3。

表3 苦木注射液中7個生物堿的含量測定

3 討論

3.1流動相的選擇 苦木注射液的主要成分是生物堿類成分，筆者在本實驗考察了不同流動相系統(A：甲醇-乙酸銨溶液系統；B：甲醇-磷酸鹽緩沖溶液系統；C：甲醇-十二烷基苯磺酸鈉水溶液系統；D：甲醇-氨水系統)，結果發現以A系統分離度、峰形及理論塔板數較好。同時為了優化A系統的色譜條件，考察了流動相中不同pH值(3.5，4.0，4.5和5.0)、不同乙酸銨濃度(20，25，30，35 mmol·L-1)，最終優選了pH值4.5，乙酸銨濃度30 mmol·L-1。

3.2色譜柱的選擇 通過對比五個不同品牌的色譜柱：Phenomenex Luna C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Phenomenex Gemini C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、YMC Pack ODS(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Agilent Zorbax SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Waters SymmetryShield RP18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，結果發現Luna、Gemini色譜柱柱效較好，最后選用pH值適應范圍寬的Gemini色譜柱。

3.3指標成分的選擇 本研究選擇了7個生物堿成分作為指標，建立了HPLC法同時測定7種生物堿含量的分析方法，經系統的方法學考察，結果此法重現性好、操作簡便、準確性高。其中化合物3-甲基-4-甲氧基-鐵屎米-5，6-二酮首次被選為指標性成分，用于苦木注射液的質量評價。

3.4測定結果分析 無質量監控的同一廠家10批次產品中7個生物堿含量波動較大，7個生物堿總含量差異也大，提示加強指標成分的質量監控，有利苦木注射液的質量穩定。產品的質量與原料質量、生產工藝密切相關，要提高產品質量，不但要監控原料的質量，而且還要優化、穩定生產工藝。