循環血漿中miR-150-5p表達與原發性高血壓的關系

霍江華，倪倩，田沖沖，楊燁，盧小敏，俞黎黎，李長峰，錢炳俊

(1.江蘇醫藥職業學院醫學技術學院，江蘇 鹽城 224005； 2.鹽城市第一人民醫院檢驗科，江蘇 鹽城 224005)

原發性高血壓是一種嚴重影響我國居民健康的多因素慢性疾病，也是導致我國居民心血管病死亡的主要原因，調查顯示我國年齡≥18歲居民的高血壓患病率為25.2%，患病人數多達2.7億，但目前其分子機制尚未完全清楚[1]。研究表明，微RNAs(microRNAs，miRNAs)可通過參與活化腎素-血管緊張素-醛固酮系統、促進血管平滑肌收縮、影響血管內皮細胞功能等途徑參與高血壓的發生發展[2]。研究發現，自發高血壓大鼠主動脈弓內miR-150-5p的表達水平降低，而miR-150-5p表達水平的降低使轉錄因子特異性蛋白1(specific protein 1，SP1)及其下游基因血管緊張素Ⅱ1型受體的表達增加，從而導致自發高血壓大鼠的血壓升高；同時該研究還發現，應用抗氧化表沒食子兒茶素沒食子酸酯能通過增加miR-150-5p的表達，降低自發性高血壓大鼠血壓[3]。可見，miR-150-5p參與了血壓調節。有研究發現，高血壓患者循環血液中出現了多種miRNAs的表達改變，但有關高血壓患者循環miR-150-5p表達變化的人群研究較少，且結果并不一致[4-5]。本研究通過測定受試者循環miR-150-5p的表達水平，分析miR-150-5p表達與高血壓之間的關系。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2019年5—11月在鹽城市第一人民醫院住院的80例原發性高血壓患者作為高血壓組，符合《中國高血壓防治指南(2018年修訂版)》[6]中的原發性高血壓診斷標準[收縮壓≥140 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)和(或)舒張壓≥90 mmHg]，選擇同期31例非高血壓(收縮壓<140 mmHg和舒張壓<90 mmHg)患者作為非高血壓組。排除繼發性高血壓、有原發性腎臟疾病患者，所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1信息收集及血樣采集 使用統一編制的調查問卷對兩組研究對象的一般狀況(性別、年齡等)和高血壓相關危險因素(吸煙、飲酒等)進行問卷調查，并測量受試者身高和體重，計算體質指數(body mass index，BMI)。兩組研究對象均采集空腹靜脈血2份。一份測定空腹血糖、血紅蛋白、總蛋白、白蛋白、總膽固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、血尿酸等生化指標，并由臨床醫師按照糖尿病、高脂血癥、高尿酸血癥的診斷標準依據實驗室檢查結果做出相應疾病的診斷；另一份用乙二胺四乙酸抗凝，3 000×g離心10 min，分離血漿并于-80 ℃儲存，留待進行miRNAs相對表達水平分析。

吸煙是指現在每日吸煙量超過1支，持續時間不少于1個月或過去曾經吸煙；飲酒是指過去半年內男性飲酒者日均酒精攝入量≥41 g，女性飲酒者日均酒精攝入量≥21 g[7-8]。糖尿病、高脂血癥、高尿酸血癥等疾病的診斷分別由臨床醫師按照《內科學》第9版[9]相應診斷標準進行判斷。①糖尿病：具有典型的臨床癥狀加上任意血糖≥11.1 mmol/L或空腹血糖≥7.0 mmol/L或葡萄糖負荷試驗2 h血糖≥11.1 mmol/L，沒有糖尿病典型臨床癥狀時必須重復檢測以確認診斷[10]；②高脂血癥：血清中總膽固醇≥6.2 mmol/L或三酰甘油≥2.3 mmol/L或LDL-C≥4.1 mmol/L[9]；③高尿酸血癥：男性和絕經后女性血尿酸>420 μmol/L、絕經前女性>350 μmol/L[11]。

1.2.2血漿miRNAs提取 取200 μL血漿樣本置冰上融化后加入600 μL的Trizol LS(美國Invitrogen公司生產，批號：10296010)，室溫變性處理10 min，然后加入200 μL氯仿冰浴10 min后12 000×g離心15 min，取上層水相，加入兩倍體積無水乙醇，最后使用E.Z.N.A.?Micro RNA Kit(美國Omaga Biotek公司生產，批號：R6842-01)進行miRNAs的過柱純化[12]。

1.2.3miR-150-5p的實時定量聚合酶鏈反應(real-time quantitative polymerase chain reaction，qPCR)及靶基因預測 先用E.coli Poly(A) Polymerase[美國New England Biolabs(NEB)公司生產，批號：M0276]對純化的miRNAs進行加尾，以加尾后產物為模板按照the RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kits(美國Thermo Scientific公司生產，批號：K1622)說明書進行反轉錄。以通用引物和特異引物分別作為上下游引物，按照AceQ? qPCR SYBR Green Master Mix(南京Vazyme有限公司生產，批號：R223-01)試劑盒說明書測定miRNAs表達量。以U6為內參，按公式Δct=Ct(miR) Ct(U6)計算Δct值，并用2-Δct計算miR-150-5p的相對表達水平(arbitrary units，AU)[4,12]。U6引物、通用引物和miR-150-5p的特異引物均為上海生工科技有限公司合成，其序列如下，U6正向引物：5′-CTCGC TTCGG CAGCA CAT-3′；U6反向引物：5′-AACGC TTCAC GAATT TGCGT-3′；通用引物5′-CAGTG CAGGG TCCGA GGT-3′；miR150-5p的特異引物(miR150-5p-F)：5′-CTCCC AACCCC TTGTA CCAGT-3′。利用starBase對miR-150-5p的靶基因進行在線預測，并用venny2.1在線繪圖軟件將miRDB、targetScan和miRTarBase三個數據庫預測得到的靶基因求交集，最后利用starbase的通路分析功能對共同靶基因進行信號通路富集分析[13-14]。

2 結 果

2.1兩組患者的一般情況比較 兩組患者的性別、年齡、血糖、血紅蛋白、總蛋白、白蛋白等生化指標，以及吸煙、飲酒、合并癥等比較差異均無統計學意義(P>0.05)，高血壓組的體重、BMI、收縮壓、舒張壓均高于非高血壓組(P<0.01)。見表1。

表1 高血壓組和非高血壓組患者一般情況比較

2.2miR-150-5p的表達 高血壓組血漿miR-150-5p的相對表達水平為2.33(1.96,3.29)×104AU，非高血壓組為5.46(3.98,7.01)×104AU，高血壓組血漿miR-150-5p的相對表達水平較非高血壓組降低57.33%(Z=-6.080，P<0.001，圖1a)。糖尿病組與非糖尿病組血漿miR-150-5p的相對表達水平分別為3.24(2.06,4.15)×104AU和2.74(2.07,4.60)×104AU，高脂血癥組與非高脂血癥組分別為2.32(1.91,3.38)×104AU和3.22(2.11,4.66)×104AU，高尿酸血癥與非高尿酸血癥組分別為2.48(1.87,3.84)×104AU和2.80(2.09,4.56)×104AU，比較差異均無統計學意義(Z=-0.099，P=0.921；Z=-1.821，P=0.069；Z=-1.168，P=0.243)。見圖1b～d。按照BMI將所有受試者分為消瘦組(BMI<18.5 kg/m2)、正常組(kg/m218.5

圖1 不同疾病狀態下循環血漿miR-150-5p的相對表達水平比較

2.3miR-150-5p表達與血壓的相關性分析 采用Pearson積矩相關分析miR-150-5p相對表達水平與血壓的關系顯示，受試者血漿miR-150-5p的相對表達水平與其收縮壓、舒張壓均呈負相關(r=-0.521、r=-0.503，均P<0.001)，見圖2。

miR:微RNA；1 mmHg=0.133 kPa

2.4miR-150-5p的靶基因預測結果 生物信息學分析結果顯示，miR-150-5p可能結合的靶基因有17個，分別為SP1、鋅指E盒同源結合蛋白1、基質金屬蛋白酶14、蛋白激酶Cα、VPS53、程序性細胞死亡因子4、EPH受體B2、核受體亞家族2 F組成員2、高爾基體SNAP受體復合物成員1、缺氧誘導的脂滴相關蛋白、鋅指和含BTB結構域的蛋白7A、脂聯素受體2、Cbl原癌基因、腫瘤蛋白p53、E1A結合蛋白EP300、早期生長反應蛋白2和轉錄因子原癌基因MYB(圖3)。除參與腫瘤的發生發展外，這些靶基因也可以調控黏著斑信號通路、胰島素信號通路、促分裂原活化的蛋白激酶信號通路、Wnt信號通路、p53信號通路、凋亡信號通路和Notch信號通路等通路，參與調節細胞分化、凋亡和血管生成等過程(圖4)。

miR：微RNA

SNARE:可溶性NSF附著蛋白受體；mTOR：哺乳動物雷帕霉素靶蛋白；MAPK：促分裂原活化的蛋白激酶；ERBB：酪氨酸激酶受體；miR：微RNA

3 討 論

miRNAs是由18～22個核苷酸構成的非編碼單鏈RNA，成熟的miRNAs主要通過與目標靶基因3′非翻譯區結合，誘導其降解或抑制其翻譯，參與心血管病發生發展的各個過程[15]。自2008年在腫瘤患者血漿和血清中被發現以來，循環miRNAs因其諸多優點迅速成為疾病標志物研究的熱點[16]。現有研究表明，在高血壓患者血漿或血清中可檢測出多種miRNAs的表達改變，這些miRNAs的表達改變早于癥狀出現，不僅可作為潛在的高血壓疾病的分子標志物，而且部分miRNAs的改變與靶器官損傷有關，可成為潛在的靶器官損傷分子標志[17]。

miR-150-5p是一種在重度心力衰竭、缺血性腦卒中等疾病的發生發展中發揮重要作用的miRNAs，循環miR-150-5p的表達水平可以作為重度心力衰竭、缺血性腦卒中的生物標志物[18-19]。Qian等[3]通過轉錄組學分析發現，高血壓大鼠主動脈內皮細胞中的miR-150-5p表達下調，并證實miR-150-5p通過靶向調控轉錄因子SP1，進一步上調高血壓大鼠胸主動脈中血管緊張素Ⅱ1型受體表達，介導腎素-血管緊張素系統參與高血壓的發展。雖然動物實驗已發現miR-150-5p基因敲除小鼠的收縮壓明顯增高，而升高miR-150-5p的表達水平又能夠降低自發性高血壓大鼠的血壓[3,20]，但是目前有關循環miR-150-5p表達與高血壓關系的研究仍較少，且結果不一致。Karolina等[5]研究發現，高血壓患者循環血液中的miR-150-5p水平較血壓正常者降低；而Hijmans等[4]的研究卻得出了不同的結果，雖然高血壓患者循環血液中出現了多種miRNAs表達的顯著改變，如miR-21、miR-126、miR-146a和miR-34a等，但是miR-150-5p的表達水平卻僅稍有降低。本研究結果顯示，高血壓組血漿miR-150-5p的相對表達水平低于非高血壓組，且其相對表達水平與血壓呈負相關，提示循環miR-150-5p可能在高血壓發生發展中發揮作用。對高血壓引起miR-150-5p表達水平降低的機制進行研究發現，血管緊張素 Ⅱ 誘導的miR-150-5p宿主基因MIR150DNA甲基化可能是導致miR-150-5p水平下降的重要原因，應用表沒食子兒茶素沒食子酸酯能夠減少MIR150基因的甲基化，增加miR-150-5p表達水平[21]。

miR-150-5p的目標靶基因較多，這些基因不僅可通過調節下游基因表達經多種途徑參與血壓調節，而且相互之間也存在復雜的調控機制。本研究結果顯示，miR-150-5p可能參與SP1、鋅指E盒同源結合蛋白(zinc finger E-box binding homeobox，ZEB)1、基質金屬蛋白酶14、蛋白激酶Cα、VPS53、程序性細胞死亡因子4、EPH受體B2、核受體亞家族2 F組成員2、高爾基體SNAP受體復合物成員1、缺氧誘導的脂滴相關蛋白、鋅指和含BTB結構域的蛋白7A、脂聯素受體2、Cbl原癌基因、腫瘤蛋白p53、E1A結合蛋白EP300、早期生長反應蛋白2和轉錄因子原癌基因MYB基因的表達調控。其中，轉錄因子SP1在高血壓的發生發展中發揮重要作用，研究表明轉錄因子SP1不僅可以通過上調神經纖毛蛋白1、神經纖毛蛋白2和血管內皮生長因子等基因的表達參與血管內皮的生成分化，還能夠促進上皮細胞鈉通道α亞基、血管緊張素Ⅱ1型受體等基因表達，引起腎素-血管緊張素-醛固酮系統的激活，并能參與各種刺激作用下血管平滑肌細胞的增殖、生長和分化[22-23]。同時研究還發現，ZEB2和SP1之間存在正反饋調節，SP1能夠增加ZEB2的穩定性，而ZEB2又能夠通過調節SP1的表達參與內皮細胞的活化、血管生成等過程[24]。研究表明，miR-150-5p可以通過靶向負調控p53信使RNA的表達，進而影響血管內皮生長因子和紅細胞生成素等血管生成相關蛋白的基因表達，從而參與血管生成過程的調節[25-26]。Liu等[27]的研究發現，miR-150過表達的轉基因小鼠，下游靶向基因血清應答因子表達下調，而血清應答因子可通過調節miR-1、miR-133a和miR-21的表達水平發揮心肌保護作用；此外，miR-150可通過靶向作用于信號轉導及轉錄激活因子1保護低氧誘導的心肌細胞[28]。

綜上可知，miR-150-5p可能通過多種機制參與原發性高血壓的發生發展，循環血漿中miR-150-5p的表達水平與血壓呈負相關，可能成為高血壓疾病診斷的新型標志物。但是miR-150-5p參與血壓調節的機制較復雜，尚需進一步的試驗研究。