添加鐵氧化物對水稻土產甲烷微生物EPS性能的影響

李友臣, 王 進, 鐘 成, 陳天虎, 岳正波

(合肥工業大學 資源與環境工程學院,安徽 合肥 230009)

溫室氣體的溫室效應是導致全球變暖的主要原因,而甲烷作為一種溫室氣體,它的溫室效應比二氧化碳更強。稻田土壤是溫室氣體甲烷的重要排放源之一,而中國是世界上重要的水稻生產國,水稻種植面積約占世界稻田總面積的23%[1-2]。我國南方水稻土土壤中存在鐵氧化物,其對有機質的厭氧產甲烷過程存在一定的促進或抑制作用,鐵氧化物可以作為微生物胞外呼吸的終端電子受體/供體、電子儲存介質或種間電子傳遞介質促進環境微生物的新陳代謝[3]。文獻[4]研究發現在水稻土中添加Fe(OH)3和纖鐵礦后,由于Fe(Ⅲ)還原對電子的競爭消耗,使土壤產甲烷過程被抑制;文獻[5]研究發現添加鐵氧化物,抑制了水稻土中甲烷的形成。但是結晶度較高的鐵氧化物如針鐵礦、赤鐵礦、磁鐵礦等對于產甲烷過程具有促進作用;文獻[6]研究發現以乙酸鈉為碳源,厭氧微生物產甲烷過程中,添加水熱合成針鐵礦和天然針鐵礦能促進甲烷的釋放,使甲烷累計釋放量提前達到最大值;文獻[7]通過富集水稻土微生物研究發現,添加納米磁鐵礦能夠明顯促進丁酸互營氧化產甲烷過程;文獻[8]研究發現向水稻土中添加導體鐵氧化物磁鐵礦和半導體鐵氧化物赤鐵礦,能夠創造一種特殊的微生物種間相互關系,從而能夠促進乙醇或乙酸的產甲烷過程。

胞外聚合物(extracellular polymeric substance,EPS)是微生物在基質代謝、細胞生長及死亡等各項生命活動中產生的,并釋放一類溶解性的有機質,主要由多糖、蛋白質、核酸、腐殖酸等組成[9-13]。EPS在微生物鐵氧化物共存體系中具有重要作用,鐵氧化物可以同微生物進行胞外電子傳遞,并促進微生物的生長和代謝過程[14-15]。文獻[16]以希瓦氏菌和惡臭假單胞菌的EPS為研究對象,發現EPS具有氧化還原性質,蛋白為EPS中的氧化還原物質。文獻[17]研究發現黃酮素在針鐵礦促進甲烷生產過程中發揮重要作用。但目前對于水稻土甲烷釋放過程中微生物EPS的性質認識還比較有限。

三維熒光光譜(excitation-emission-matrix spectra,EEM)能夠獲得激發波長和發射波長同時變化時的熒光強度信息,能識別和表征復雜體系中熒光光譜重疊的對象,是非常有用的光譜指紋技術,具有高靈敏度、高選擇性、高信息量、且不破壞樣品結構等優點。而EPS含有熒光性基團物質,利用EEM對其進行觀測解析已有大量的研究報道,如文獻[9]對厭氧污泥和好氧污泥EPS進行了EEM解析,發現熒光峰的位置、強度和各種峰強度的比率受pH和EPS濃度影響顯著。文獻[18]發現熒光類蛋白物質在微生物聚集體形成過程中的作用比腐殖酸類物質更加重要。因此,本研究構建了鐵氧化物水稻土微生物體系,首先研究了以乙酸鈉為底物的甲烷產生過程,然后利用化學分析、EEM和紅外光譜技術對EPS及其產生過程進行了分析表征,以期認識EPS組分及性質變化規律,揭示EPS對水稻土甲烷產生過程的影響和作用機制,為進一步認識水稻田溫室氣體釋放提供支撐。

1 材料與方法

1.1 實驗設計

以500 mL血清瓶為反應器,有效反應體積為200 mL,乙酸鈉初始濃度為20 mmol/L,水稻土取自合肥肥東,添加量為10.0 g/L。針鐵礦和赤鐵礦添加量為20 mmol/L(基于鐵元素),初始pH為7。加入所有營養成份后,鼓氬氣排除空氣,并用鋁塞密封,置于35 ℃恒溫培養箱培養。在產氣量為理論產氣量的1/4、1/2、3/4和結束時,進行EPS提取,樣品分別記作S1、S2、S3和S4。

1.2 測試分析

1.2.1 EPS提取及成分分析

胞外聚合物EPS的提取采用離心法[19],取50 mL樣品于離心管內,在5 000 r/min下離心5 min,提取上清液即為EPS。多糖測試方法采用蒽酮硫酸分光光度計法進行測定,以葡萄糖作為標樣做標準曲線[20];蛋白質測試方法采用改進的Lowry法進行測定,以牛血清蛋白作為標樣做標準曲線[21];腐殖酸測定采用福林酚法[22];DNA采用二苯胺法進行測量(標準物質為2-脫氧-D-核糖);TOC、TN采用島津TOC-V CPH分析儀進行測定。EPS中多糖和蛋白質含量分別用比色法測定值同TOC和TN的比值表示。

1.2.2 電化學表征方法

電化學實驗在室溫條件下采用三電極體系的電化學工作站，使用玻碳電極作為工作電極,鉑絲電極作為對電極,以及采用飽和甘汞電極作為參比電極,選用計時安培法測量EPS的電子接受能力,以磷酸鹽(pH=7.0)為緩沖劑,在測量之前使用氮氣吹脫。向20 mL空白體系中(0.1 mol/L KCl,0.1 mol/L phosphate,pH=7.0)加入待測的微生物胞外聚合物樣品1 mL,設置工作電極Eh=-0.6 V的條件下,測量樣品的電子接受能力[23]。

1.2.3 三維熒光光譜

實驗采用日本分光FP6500 熒光分光光度計對EPS 進行分析。三維熒光光譜以5 nm為增量從激發波長250 nm掃描到450 nm,以2 nm為增量從發射波長300 nm掃描到50 nm,掃描速度為2 000 nm/min,響應時間為0.2 s。用相同體積的樣品進行測定,采用Origin8.0對光譜圖進行數據分析[24]。

1.2.4 傅立葉紅外光譜法

實驗采用日本島津IRPrestige-21 紅外光譜儀對制作好的樣品進行測定。將提取的EPS 倒在培養皿上冰凍,用冷凍干燥機處理后的樣品與KBr 以1:100的比例研磨,壓片成型后用紅外光譜儀測定。掃描條件如下:光譜范圍為4 000～400 cm-1,掃描次數為10,分辨率為4 cm-1[9]。

2 結果與討論

2.1 甲烷產生及底物消耗

體系累積產甲烷及底物消耗過程如圖1所示。

圖1 累積產甲烷及底物消耗過程

接種后25 d處于微生物生長的遲滯期,增長較慢,甲烷產生和底物消耗量均較少。25～60 d處于厭氧微生物增長的對數期,甲烷產生和底物消耗主要發生在此階段。60 d后,厭氧微生物處于穩定期,底物消耗基本完成。鐵氧化物的加入提升了底物消耗速率和甲烷生成速率,這與文獻[6]的研究結果一致。

2.2 EPS組分

多糖、蛋白質和腐殖酸等是EPS的主要成分[25]。產甲烷過程EPS多糖、蛋白質和腐殖酸的變化如圖2所示。

在產甲烷初始階段多糖含量較低,然后逐步增加。蛋白質的變化趨勢正好相反,初始階段含量較高,甲烷產生過程中濃度較低。初始腐殖酸含量較低,隨著反應的進行,腐殖酸的含量逐漸升高并趨于穩定。

各體系反應初期(S1)中EPS多糖幾乎無差異,而鐵氧化物的存在促進了胞外蛋白質的產生。在甲烷產生的高峰期(S2和S3)添加針鐵礦和赤鐵礦的體系,EPS中多糖和蛋白質含量降低。反應末期(S4)空白組的多糖較低,蛋白質濃度較高。在產甲烷對數增長期鐵氧化物組腐殖酸的含量高于空白對照組。

產甲烷過程EPS電子接受能力變化如圖3所示,在反應初期(S1),EPS的電子接受能力較低。在產甲烷高峰期(S2和S3)EPS的電子接受能力有所提升,鐵氧化物組的電子接受能力礦物組高于空白組,這可能是由于腐殖酸含量較高(圖2c)。腐殖酸含量提升能夠部分解釋添加鐵氧化物體系較高的產甲烷速率和底物消耗速率(圖1)。

圖2 產甲烷過程EPS多糖、蛋白質和腐殖酸的變化

圖3 產甲烷過程EPS電子接受能力變化

2.3 EPS的相關分析

2.3.1 三維熒光光譜

EPS三維熒光光譜的分析結果如圖4所示,主要出現了4個熒光峰,分別是類色氨酸蛋白質峰A(λEx=280 nm,λEm=340 nm),類腐殖酸熒光峰B(λEx=330 nm,λEm=430 nm),類腐殖酸熒光峰C(λEx=405 nm,λEm=459 nm),紫外區類富里酸熒光物質峰D(λEx=255 nm,λEm=482 nm)[26-27]。

圖4 EPS三維熒光光譜分析結果

反應初期(S1)EPS各峰峰強較低表明此時微生物分泌胞外物質較少,隨著厭氧微生物的生長,胞外物質開始大量生成。在厭氧微生物進入對數增長期(S2和S3),各體系中類腐殖酸、類富里酸熒光峰的峰強逐漸增強。這和腐殖酸含量變化(圖3)以及底物消耗速率加快(圖1)等現象一致,說明類腐殖酸和類富里酸物質在產甲烷過程中具有重要作用。

甲烷產生的高峰期(S2和S3),添加針鐵礦體系中類腐殖酸、類富里酸熒光峰的峰強高于赤鐵礦組以及對照組。這同體系電子傳遞能力以及產甲烷速率的變化相一致。添加赤鐵礦體系中類腐殖酸熒光峰的峰強上升,在樣S3中類腐殖酸熒光峰峰強達到最大,此時赤鐵礦組中產甲烷速率最大(圖1)。在樣S4中,空白組中類色氨酸蛋白質峰的峰強最強,與蛋白質含量分析結果一致(圖2b)。

添加針鐵礦組體系中反應開始后類腐殖酸熒光峰峰強呈現上升趨勢,反應結束后呈現下降趨勢。這同針鐵礦組中的產甲烷速率相對應(圖1)。在厭氧微生物進入對數增長期后,添加針鐵礦體系類腐殖酸熒光峰的峰強高于空白對照組。結合底物消耗和甲烷產生過程數據可知針鐵礦的加入促進了EPS中腐殖酸含量的增加,提高了體系的電子傳遞能力,進而促進了產甲烷過程。

2.3.2 熒光區域積分法(FRI)分析

根據文獻[27]提供的熒光區域積分法(fluorescence regional integration,FRI),將熒光光譜圖劃分為5個熒光區域(Ⅰ～Ⅴ),分別對應芳香族蛋白質、芳香族蛋白質Ⅰ、類富里酸物質Ⅱ、類色氨酸蛋白質和類腐殖酸物質。據此可以對EPS熒光光譜區域積分可得,每組樣品各個區域占總區域物質的比例如圖5所示。在樣品S1中,鐵氧化物組蛋白質所占比例高于空白對照組,這與圖2b中蛋白質的含量相對應。而隨著厭氧發酵的進行,在樣品S3和S4中,鐵氧化物組蛋白質所占比例低于空白對照組,腐殖酸和富里酸所占總比例高于空白對照組,這與腐殖酸含量變化規律相對應(圖3)。說明腐殖酸和富里酸在厭氧發酵過程中具有重要作用。

圖5 EPS的熒光積分分析

2.3.3 熒光類物質作用分析

對EEM分析結果中各熒光峰強度同乙酸鈉消耗速率、產甲烷速率進行相關性分析,發現相關系數介于0.679～0.998之間。由此表明EPS中的類色氨酸蛋白質、類腐殖酸和類富里酸含量與底物消耗速率和產甲烷速率呈一定的正相關,其對于底物消耗和產甲烷具有促進作用。鐵氧化物組底物消耗速率和產甲烷速率在樣品S3中達到最大,而此時鐵氧化物組腐殖酸和富里酸峰強達到最大;空白對照組在樣品S4中,底物消耗速率和產甲烷速率達到最大,此時空白組的腐殖酸和富里酸的峰強最高,這是由于腐殖酸和富里酸具有電子傳遞能力,提升了體系內的電子傳遞能力,進而提高了底物消耗速率和產甲烷速率。說明鐵氧化物的加入,較快提升了體系內的腐殖酸和富里酸的生成,從而提升了反應底物消耗速率和產甲烷速率。鐵氧化物具有導電性,因此鐵氧化物的加入,可能提升了微生物間的電子傳遞能力[28],促進了微生物的快速生長,從而促進了微生物胞外聚合物的快速分泌,EPS中含有腐殖酸和富里酸的生成,進而使鐵氧化物組的底物消耗速率和產甲烷速率快速達到最大。

2.4 紅外光譜表征

3組樣品EPS的紅外光譜圖如圖6所示,圖6中3 431 cm-1處是-OH的伸縮振動;3 000 cm-1處是C—H的伸縮振動,1 654 cm-1處是蛋白質酰胺Ⅰ的C=O伸縮振動；1 532 cm-1處是蛋白質酰胺Ⅱ的N-H變形振動；1 455 cm-1處是CH3振動；1 400 cm-1處是羧基的伸縮振動[29]；1 092 cm-1和1 042 cm-1為多糖結構的振動[30]。1 400 cm-1處羧基伸縮振動和3 431 cm-1處-OH的伸縮振動是腐殖酸、富里酸主要官能團,1 654 cm-1處蛋白質酰胺Ⅰ的C=O伸縮振動和1 532 cm-1處蛋白質酰胺Ⅱ的N-H變形振動是類色氨酸蛋白質的主要官能團[31]。

從圖6可以看出，隨著反應進行,各峰強度逐漸升高。在樣S4中,赤鐵礦組位于1 092 cm-1多糖結構振動峰強最高,這與圖2中多糖含量相對應。從紅外光譜中可以看出,EPS中存在腐殖酸、富里酸和類色氨酸蛋白質等物質,與化學分析及EEM分析結果一致。

在樣S2和S3中,鐵氧化物組位于1 400 cm-1處羧基和3 431 cm-1處羥基的峰強,赤鐵礦組高于針鐵礦組高于空白對照組,說明鐵氧化物的加入促進了體系內的腐殖酸含量,且赤鐵礦的促進作用高于針鐵礦組高于空白對照組。在樣S1、S2和S3中,赤鐵礦組位于1 532 cm-1處是蛋白質酰胺Ⅱ的N-H變形振動,強于針鐵礦組和空白對照組。樣S4中空白對照組位于1 654 cm-1處是蛋白質酰胺Ⅰ的C=O伸縮振動峰強最強,與三維熒光光譜結果相一致。

圖6 EPS的紅外光譜圖

3 結 論

鐵氧化物的加入提升了水稻土產甲烷微生物體系的產甲烷速率和底物消耗速率。化學分析和紅外分析結果表明EPS主要組分為多糖、蛋白質和腐殖酸類物質。EEM分析結果表明EPS組分腐殖酸、富里酸和類色氨酸蛋白質強度變化同產甲烷速率、底物消耗速率呈現線性正相關關系。鐵氧化物的加入有利于促進EPS組分腐殖酸的生成,進而提高了體系內微生物的電子接收能力,從而有利于微生物主導的底物消耗和甲烷產生過程。