LDL-C的測定：現狀與發展

何紫云，鄢盛愷

（遵義醫科大學檢驗醫學院，貴州 遵義 563006）

眾所周知，低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）是動脈粥樣硬化性心血管疾病（atherosclerotic cardiovascular disease，ASCVD)的獨立危險因素，也是調脂治療的首要靶標，因此，LDL-C測定的準確性及標準化對于ASCVD的防治至關重要。LDL-C的臨床檢測經歷了從公式法到勻相測定法（直接法）的發展，近年來國內外相繼報道了一些新的檢測方法及基于LDL的新的臨床檢測項目如低密度脂蛋白顆粒（LDL particles，LDL-P）、小而密低密度脂蛋白膽固醇（small and dense LDL cholesterol，sd LDL-C）、低密度脂蛋白甘油三酯（LDL triglyceride，LDL-TG）、低密度脂蛋白鞘磷脂（LDL sphingomyelin，LDL-SM）等，極大地豐富了基于LDL的臨床檢測項目及其在ASCVD防治中的應用價值。

1 LDL-C的測定

臨床上通過測定LDL-C水平進行ASCVD患者的管理，從而提高對患者的診治水平。研究表明，LDL-C每降低1mmol/L，主要心血管事件和全因死亡的相對風險分別降低22%和10%[1]。2020年ESC/EAS血脂異常管理指南強調LDL-C在ASCVD一級和二級預防中的重要性，建議高危患者的LDL-C水平應控制在1.8 mmol/L或更低水平，并提出更為嚴格的LDL-C分級治療目標[2]。由于LDL-C與心血管疾病之間的緊密關系，以及它在臨床實踐中的重要性，準確測定患者的LDL-C水平尤為重要。傳統LDL-C的檢測方法如超速離心法、電泳法、Friedwald公式法（間接法）、沉淀法、免疫法、勻相測定法等一直在不斷更新與優化，測定的標準化也越來越受到臨床實驗室的重視。LDL-C的測定方法、基于LDL的幾種新的檢測指標及其方法比較，見表1。

表1 基于LDL的檢測指標與方法比較

1.1 Friedwald公式法 Friedwald公式法（簡稱F公式）最早于1972年提出，是目前臨床檢測LDLC較為常用的方法，也是美國膽固醇教育計劃（national cholesterol education program，NCEP）推薦的常規檢測方法。該法通過測定總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白膽固醇 （high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）計算而得，即LDL-C=TC－HDL-CTG/5（以mg/dl計）或LDL-C=TC－HDL-C－TG/2.2（以mmol/L計），具有簡便、快速、直接等優點，適用于大部分人群LDL-C的測定[3]。由于F公式以極低密度脂蛋白（very low density lipoprotein，VLDL）組成恒定（VLDL-C/TG=0.2，均以mg/dl計）的假設為前提，受脂蛋白變異程度影響較大，當待測樣本中存在乳糜微粒（chylomicron，CM）、β脂蛋白（如Ⅲ型高脂血癥）及TG＞4.52 mmol/L時，不宜采用此公式。此外，新型調脂藥物如前蛋白轉化酶枯草溶菌素9（proprotein convertase subtilisin/kexin type 9,PCSK9）單克隆抗體的使用，使得一些患者的LDLC水平遠低于1.81 mmol/L，此時使用F公式估算LDL-C可能存在很大負偏差，這將影響ASCVD高危患者的進一步治療[4]。

1.2 勻相測定法 目前臨床實驗室測定血清LDLC普遍采用勻相測定法（直接法），其原理基于不同的表面活性劑（或特異性抗體等）特異性遮蔽或溶解其余脂蛋白，然后直接定量測定LDL-C，包括表面活性劑清除法（SUR法）、過氧化氫酶清除法（CAT法）、可溶性反應法（SOL法）、保護性試劑法（PRO法）和杯芳烴法（CAL法）等。這類方法無需對樣本進行預處理，具有所需標本少、操作簡便、易于自動化等優點，因此在國內外得到迅速發展和應用[5]。但這些方法測定LDL-C仍存在偏差較大的問題，有些試劑尚不能滿足NCEP分析質量目標要求。美國疾病控制與預防中心（Center for Disease Control and Prevention，CDC）的超速離心-肝素錳沉淀-AK膽固醇測定法[也稱為β-定量法(beta quantification，BQ法)]，是國際上廣泛認可的LDL-C測定參考方法，被NCEP所推薦，也是國際臨床化學會聯合溯源委員會（JCTLM）參考方法列表中列出的唯一的LDL-C參考方法（https://www.bipm.org/jctlm/）。美國國家標準與技術研究所（NIST）研制的3個批次的參考物質CRM 1951a、1951b和1951c（每個批次為2個不同濃度水平的冰凍人血清）均用此法定值。我國目前已有國家一級標準物質GBW09178-09180和GBW09193-09196等幾種LDL-C冰凍血清，使用的是小體積BQ法定值。應該注意的是，冰凍血清對于LDL-C測定可能不具互通性，將其用于常規方法溯源或不同常規方法間的比對并不十分可靠，用其校準的分析系統檢測實際樣品時可能會產生偏差。行之有效的LDL-C標準化方法可能是使用參考方法與常規方法且都使用新鮮血清進行一分為二的樣品比對[6]。Yano等[7]應用日本協和（Kyowa Medex）和日本積水（Sekisui Medical）公司兩種不同LDL-C勻相測定法試劑，分別對198例新鮮高TG血清樣本[≥1.7 mmol/L（150 mg/dl）]進行測定，結果表明兩法具有很強的相關性；同時，對其中32例LDLC結果有明顯差異或高甘油三酯血癥[TG≥4.5mmol/L(400mg/dl)]標本應用BQ法進行測定，結果顯示兩法與BQ法均具有很好的相關性。最近Kayamori等[8]比較了日本臨床化學學會（JSCC）推薦的自動化測定LDL-C的參考方法（基于超速離心—硫酸葡聚糖鎂沉淀結合酶法分析的原理）與傳統BQ法測定47例健康對照和126例病例[TG＜11.29 mmol/l(1000 mg/dl)]血清LDL-C水平。結果表明，兩者具有很好的一致性（r=0.999），顯示這種準確、簡便、自動化的方法可用于LDL-C定量分析及測定的標準化。

1.3 Martin/Hopkins公式法 Martin/Hopkins公式法（簡稱Martin公式）是基于垂直自動超速離心（vertical auto profile,VAP）技術直接計算LDL-C的新方法，即LDL-C=TC-HDL-C-TG/可調因子（以mg/dl計）[9]。該公式最大的優勢在于LDL-C濃度極低時，可準確計算LDL-C，且對標本是否禁食無特殊要求，方便患者檢查和臨床樣本收集。Song等[10]用近18萬韓國人群隊列數據比較了多個LDL-C的計算公式，認為Martin公式可能是評估亞洲人群LDL-C與ASCVD風險關聯的最佳方法。因此，2018年包括ACC/AHA在內的多個學會血脂管理指南均推薦Martin公式作為低LDL-C首選估算方法[11]。Martin公式與F公式類似，不同點是依賴于用TG與非HDL-C水平的可調因子來估算LDL-C，多數情況下，兩者測定的結果具有良好的一致性。但對于嚴重的高TG血癥患者，由于CM和VLDL等大顆粒脂蛋白增加，可致Martin公式測得LDL-C結果偏低；此外，使用Martin公式進行LDL-C估算時，還需在實驗室信息軟件中查找最佳調節因子，操作過程較F公式更為復雜。

1.4 Sampson公式法 Sampson公式法是利用美國國立衛生研究院數據庫推導出的一種適用于高TG（≥9.03 mmol/L）標本估計LDL-C的新方法，即：計），特別適用于LDL-C水平極低和TG水平極高患者LDL-C水平的估算[12]。Martinez-Morillo等[13]進行了F公式、Martin公式與Sampson公式估算LDL-C準確性的比較研究，認為Sampson公式可能是臨床實驗室計算LDL-C的一種經濟有效的替代方法。Piani等[14]研究比較了包括F公式在內的12種不同公式計算LDL-C水平，結果顯示，Martin公式和Sampson公式最具優勢。Sampson公式相較于Martin公式最明顯的特點是在大多數實驗室信息系統可以自動計算，更易在一般臨床實驗室推廣使用。

2 LDL-P的測定

LDL顆粒是血液循環中膽固醇的主要載體，其在動脈內膜的聚集可造成動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）及ASCVD的發生發展。與LDL-C測定的是LDL顆粒中的膽固醇質量不同，LDL-P測定的是LDL顆粒的實際數量（顆粒濃度），是從LDL顆粒的具體數量來反映LDL水平的，相比LDL-C而言其更能直觀反映LDL對血管內皮損傷的危害程度。因為每個LDL所含的膽固醇含量不同，LDL顆粒數量可能比顆粒大小更重要，尤其是LDL-C與LDL-P不一致時，LDL-P可能比LDL-C更能預測心血管事件的風險，更適用于判斷他汀治療后心血管殘余風險并指導調整治療方案[15]，因此，LDL-P的臨床檢測與應用越來越受到各國學者的重視。通常建議ASCVD中危患者的LDL-P應＜1200 nmol/L，高危或極高危患者則應＜1000 nmol/L[16]。目前測定LDL-P的方法主要有：VAP技術、凝膠電泳法（gel electrophoresis，GE）及核磁共振波譜法（nuclear magnetic resonance spectroscopy，NMR）等。

2.1 VAP技術VAP技術是一種基于DGUC的改良技術，通過單垂直旋轉密度梯度超速離心分離脂蛋白。其通過特殊的緩沖液和離心體系可有效縮短離心時間，且無需患者空腹，不受TG水平干擾，能滿足臨床快速檢測的要求。該法可在1h內同時測定脂蛋白顆粒（含LDL-P）和亞組分的膽固醇含量（含LDL-C），是美國國家脂質協會（NLA）等組織推薦使用的方法。Williams等[17]使用VAP技術檢測136例冠狀動脈造影患者LDL-P含量，測定結果精密度高[變異系數(CV)＜5%]。但該法需特殊設備且運營成本高，在項目測定標準化、溯源性等方面仍有一些問題需要解決，且我國缺乏多中心標準化的對比實驗數據。美康生物科技血脂亞組分檢測用VAP儀器及配套試劑盒已獲國家藥品監督管理局注冊證，這將極大地推動VAP技術在我國的臨床研究及其在ASCVD防治中的應用。

2.2 凝膠電泳法 凝膠電泳法（GE）是以瓊脂凝膠、聚丙烯酰胺凝膠（polyacrylamide gradient gel，PAG）等作為支持介質的區帶電泳法，根據LDL-P在電場中的遷徙率不同將LDL中的各種顆粒成分分離。基于GE法的LDL-P測定方法包括梯度凝膠電泳法（GGE）、管狀凝膠電泳法（TGE）和PAGE等。GGE的優勢在于具有高分辨能力且已有商業化的試劑，但對操作者的熟練程度要求高、分離時間長（＞12h）且結果的自動化分析困難限制了此方法的應用。Quantimetrix公司研發出LipoprintTM脂蛋白分析系統已獲美國食品和藥物管理局（FDA）認證批準，具有高效快速、低實驗消耗等優點，與GGE法具有良好的相關性。該系統根據脂蛋白顆粒大小和所帶電荷多少，通過3%高分辨率聚丙烯酰胺管狀凝膠電泳法（PTGE）分離LDL和HDL，可在1h內把LDL分成7個亞型，同時測定包括LDL-P在內的各種脂蛋白顆粒大小、表型及濃度。Varady等[18]通過測定16例肥胖者在4個不同時間點的LDL-P的大小，比較了此法與PAGE之間的一致性，發現盡管兩種方法在不同LDL顆粒（大、中、小）大小分布方面有很好的一致性，但LDL-P大小絕對值之間還是存在一定差異，LipoprintTM脂蛋白分析系統測定LDL-P大小比PAGE法結果整體偏高（1.1±3.0A）。

2.3 NMR技術NMR技術是利用不同脂蛋白顆粒脂質甲基獨有的核磁共振光譜信號區分脂蛋白組分并進行脂蛋白顆粒定量測定的方法。該法測定LDL-P具有較好精密度（批內、批間CV為2.6%～5.8%），可滿足臨床實驗室的常規檢測要求[19]。LipoScience Corp研制開發的Vantera分析儀及配套的NMR Lipo Profile試劑盒已獲FDA批準，可用于脂蛋白顆粒及亞組分的測定[20]。Fernández-Cidón等[21]使用NMR技術進行85例男性患者LDL-P的測定，結果表明NMR技術為AS提供了比傳統脂質譜更好的ASCVD風險分層信息。藺亞暉等[22]進行了NMR技術穩定性的評估，并在1 091例中國人群中進行了血脂譜一致性的比較，結果表明NMR技術檢測可獲得更豐富的血脂亞類譜。但該法缺點是需特殊實驗平臺（儀器）、運營成本甚至高于VAP技術，難以在常規臨床實驗室普及采用。

3 sd LDL-C的測定

通常將密度＞1.034 g/ml，直徑為22.0～24.1 nm的LDL稱作sdLDL。研究表明，sdLDL比大而輕的LDL更易被氧化，更易促進泡沫細胞形成，是AS斑塊發展及心肌梗死的危險因素。Ikezaki等[23]進行了一項包含3 094名受試者的Framingham子代預期 研 究，比 較 血 漿TC、TG、HDL-C、LDL-C、sd LDL-C、LDL-TG、殘粒樣顆粒脂蛋白膽固醇（remnant-like particles cholesterol，RLP-C）、富含甘油三酯脂蛋白膽固醇 （triglyceride-rich lipoprotein cholesterol，TRL-C）及脂蛋白(a)[Lp(a)]等指標，結果表明sd LDL-C是最易致AS的脂蛋白參數。sd LDL-C水平與冠狀動脈狹窄程度、頸動脈內膜中層厚度、內臟脂肪面積、胰島素抵抗指數等密切相關，有助于ASCVD風險評估及相關疾病的嚴重程度判斷。因此，sd LDL-C作為一種新興的與ASCVD及其并發癥相關的生物標志物，在結合傳統血脂分析指標基礎上，可考慮將其列為臨床常規篩查項目，且需更深入地了解如何控制其水平。對于臨床實驗室而言，根據所用檢測方法建立適當的sd LDL-C參考區間非常必要。目前檢測sd LDL-C的方法主要有：高效液相層析法（high performance liquid chromatography，HPLC)、過氧化物酶檢測法、凝膠電泳法、NMR技術、計算法、DGUC等。

3.1 HPLC HPLC是一種基于粒度分離的高級脂蛋白分析的參考方法，可進行脂蛋白亞組分包括sd LDL-C在內的顆粒數量測定。HPLC測定sd LDL-C主要有陰離子交換高效液相層析法(AEXHPLC)和凝膠滲透高效液相層析法(GP-HPLC）。Manita等[24]建立了一種基于AEX-HPLC測定sd LDL-C的方法并進行了驗證，認為該方法可用于心血管疾病風險的預估和常規臨床實驗室分析。Toshima等[25]建立了基于GP-HPLC進行高通量脂蛋白譜檢測的LipoSEARCHR系統，可進行包括脂蛋白亞組分在內的全套脂蛋白測定，具有所需標本量少、標本類型覆蓋范圍廣、準確和快速等特點。Masuda[26]通過測定404名患者服用降脂藥后的脂蛋白亞類水平（包括sd LDL-C），比較了HPLC與F公式法的測量準確性，認為在評估經治療后患者的LDL-C水平時HPLC更準確，在低LDL-C[＜1.0 mmol/L（40 mg/dl）]患者中，測量值往往高于計算值。

3.2 過氧化物酶檢測法 過氧化物酶檢測法（也稱“直接酶法”）利用聚氧乙烯芐基苯基醚衍生物作為表面活性劑，選擇性地與sd LDL-C發生顯色反應。此法具有操作簡便、易于臨床實驗室使用等優點，為sd LDL-C的臨床常規檢測提供了可能。Denka Seiken公司研發的過氧化物酶檢測試劑盒是FDA批準的首個sd LDL-C檢測試劑，其操作簡單，精密度好（批內、批間CV均＜5%），與DGUC具有良好的相關性。Vanavanan等[27]應用直接酶法和PTGE同時測定了242例患者血清sd LDL-C水平，并探討其在代謝綜合征患者ASCVD風險預測方面的差異。結果顯示，兩種測定方法具有良好的相關性，直接酶法測定的致AS脂蛋白顆粒比PTGE法范圍更廣，可識別潛在的有血管風險的患者。國內Fan等[28]對市售的七種sd LDL-C直接酶法試劑進行性能驗證研究，發現這些商品化試劑盒性能基本能夠滿足臨床檢測要求，但試劑之間可比性較差，測定的標準化的問題亟待解決。

4 其它基于LDL的檢測項目

4.1 LDL-TG的測定LDL是一種復雜的顆粒混合物，除膽固醇外，其脂類部分主要由磷脂和TG組成。作為一種新的檢測項目，LDL-TG有可能成為LDL-C對ASCVD風險預測的補充。Hirano等[29]研究表明，LDL-TG是除LDL-C以外用于預測ASCVD風險的敏感指標，且與全身性炎癥的關系密切。但LDL-TG與ASCVD關聯的機制尚不清楚，有可能與AS表型相同的現象有關。LDL-TG檢測的經典方法包括超速離心法、HPLC和電泳分離法。最近，Ito等[30]開發了一種檢測LDL-TG的自動化勻相測定法，其原理與勻相測定法測定LDL-C相似。主要利用兩種不同的表面活性劑（1和2），在自動分析儀上直接測定LDL-TG，這種方法與傳統DGUC分離LDL之后測定LDL-TG的結果之間有很好的相關性。應用該法測定正常人群LDL-TG中位數為0.09 mmol/L，LDL-TG摩爾含量約為LDL-C含量的5%。目前該方法主要用于科研領域，尚未在臨床常規應用。

4.2 LDL-SM的測定 鞘磷脂（SM）是脂蛋白磷脂的主要成分之一,主要存在于富含載脂蛋白B顆粒的VLDL及其分解代謝物LDL中。研究發現,LDLSM在人冠狀動脈平滑肌細胞中誘導炎癥反應，血清LDL-SM水平較高患者LDL聚集敏感性增加，提示LDL-SM也可能是ASCVD的預測因子[31]。通過使用PCSK9抑制劑或健康飲食誘導的類似成分變化，可降低LDL-SM及LDL聚集敏感性，從而降低ASCVD風險并減緩AS發生發展。LDL-SM的檢測主要使用質 譜法 （mass spectrometry，MS）。Ruuth等[32]建立了MS檢測血清LDL-SM含量的方法，并用于評估LDL顆粒聚集敏感性及藥物和飲食的影響。目前，尚未有可在臨床常規實驗室開展LDL-SM檢測的方法，在LDL-SM測定的方法學及臨床應用領域還需做更多的工作。

5 小結

LDL-C作為臨床上對ASCVD患者進行管理的重要指標，依賴于臨床實驗室的準確測定及與臨床的良好溝通。隨著一些新型高效調脂藥物如PCSK9抑制劑等和非禁食樣本的逐步使用，臨床對LDL-C檢測的準確性要求也越來越高，選擇更加準確的LDL-C檢測方法或開發基于LDL其他成分的檢測方法，有益于患者更好地進行降脂治療、減少相關不良反應。建立包括參考方法、參考物質和標準化計劃在內的可靠的參考系統，開發適合各種臨床病例（如異常TG水平）的準確、特異、具有自主知識產權的臨床檢測試劑仍是目前LDL-C研究的熱點與難點。盡管我國在LDL-C測定的標準化方面做了大量的工作，勻相測定法檢測試劑質量已大幅提高，研發出了可供臨床使用的LDL-C冰凍血清國家標準物質，但LDL-C測定的標準化工作仍然面臨諸多問題，如研制與實際血清樣本行為一致的具有互通性（沒有基質效應）的參考物質/質控物質等。sd LDL-C、LDL-P、LDLTG、LDL-SM等幾種基于LDL其他成分的新的臨床檢測項目被開發，極大地豐富了血脂管理在ASCVD防治中的臨床應用價值。但這些項目除sd LDL-C外還多處于研究、驗證及發展階段，建立這些新項目測定的參考方法，特別是開發出適合臨床實驗室常規開展的檢測試劑，建立各自合適的參考區間，并在臨床推廣使用這些新的檢驗項目，將會為ASCVD的防治提供更多的幫助、助推精準診治的發展。