MMP-3與MMP-13在幽門螺桿菌相關胃炎中的表達及其臨床意義

宋世磊，丁光偉，閆方博，萬磊

（河南科技大學附屬許昌市中心醫院1.消化內科；2.胃鏡室；3.病理科，河南 許昌 461000）

慢性胃炎是一種常見的由各種原因引起的慢性胃粘膜炎性疾病，其發病率在各種胃疾病中居首[1]。慢性胃炎的發病機制目前尚不清楚，但是諸多影響因素如：生活習慣、遺傳和傳染性因素（幽門螺桿菌）均可導致患慢性胃炎的風險增加[2]。人基質金屬肽酶13（MMP-13）是一種蛋白水解酶，由Freij及其團隊在1994發現[3]。在慢性炎癥引起的頭頸部鱗狀癌，軟骨肉瘤，膀胱移行細胞癌和口腔粘膜癌中檢測到MMP-13的表達[4]。有研究結果表明，在幾百例癌癥患者中，約有21%的患者表達了MMP-13 mRNA，在診斷時所有漿膜浸潤的腫瘤均顯示高水平的MMP-13 mRNA，表明MMP-13的表達在組織炎癥發展過程中具有至關重要的作用[5]。人基質金屬肽酶3（MMP-3）是基質金屬肽酶家族中的一員，有研究發現，對幽門螺桿菌感染者使用藥物進行治療后，在患者病情恢復的同時，其血清MMP-3表達水平也隨之降低[6]。同時國外研究報道，MMP-3表達量的增加可激活MMP-13上游靶基因，從而促進MMP-13的表達[7]。幽門螺桿菌感染與慢性胃炎的發生密切相關，幽門螺桿菌誘導潰瘍和胃炎中TNF-α和IL-1β的分泌，從而刺激胃上皮細胞中MMP-3和MMP-13的分泌，因此，胃細胞可能會受到幽門螺桿菌定植的影響，從而促進炎癥并損害胃粘膜[8]。因此本研究以102例慢性胃炎患者為研究對象，探討MMP-3和MMP-13表達水平與幽門螺桿菌相關胃炎的關系，為臨床幽門螺桿菌相關胃炎的治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取我院消化科自2019年1月至2020年1月確診的102例慢性胃炎患者作為研究對象，納入標準：⑴參照《中國慢性胃炎共識意見（2017，上海）》[9]，胃鏡和病理組織切片活檢確診為慢性胃炎；⑵所選患者具有完整的臨床基礎資料。排出標準：⑴患者年齡小于18歲；⑵妊娠或哺乳期婦女；⑶近一個月內服用過抗幽門螺桿菌類藥物；⑷合并患有其他嚴重胃部疾病；⑸患者存在嚴重精神障礙，無法正常溝通交流。根據14C尿素呼氣試驗結果，將102例慢性胃炎患者分為幽門螺桿菌（H.pylori）陽性組和陰性組，其中H.pylori陽性組59例，H.pylori陰性組43例。本研究已取得患者本人及家屬知情同意，且通過我院醫學倫理委員會審批。

1.2 主要試劑 MMP-3（批號：201549）、MMP-13蛋白抗體（批號：201544）購自武漢Elabscience公司；山羊抗兔二抗（批號：SW201948）購自上海寶生物有限公司；DAB顯色試劑盒（批號：a847910）購自北京萬泰德瑞診斷技術有限公司；進口山羊血清（批號：414587）購自鼎國生物有限公司。

1.3 H-E染色 將組織蠟塊切成5μm，置于防脫載玻片上，經脫蠟（二甲苯）、水化（梯度乙醇）處理，蘇木素和伊紅染色2 min,水洗后脫水，中性樹脂封片，顯微鏡下觀察。

1.4 免疫組織化學法 將組織蠟塊切成5μm，置于防脫載玻片上，經脫蠟（二甲苯）、水化（梯度乙醇）處理后進行如下步驟：⑴PBS溶液浸泡3次，每次5 min，晾干；⑵將切片置于枸櫞酸鈉緩沖液中煮沸15 min進行抗原修復，PBS浸泡3次，每次5 min；⑶3%雙氧水浸泡10 min,用于去除內源性酶，PBS浸泡3次，每次5 min；⑷每張切片的組織上滴加50μl山羊血清，封閉30 min；⑸棄去山羊血清，不用清洗，加50μl一抗孵育，4℃過夜；⑹次日，棄去一抗，PBS浸泡3次，每次5 min，晾干，滴加50μl二抗（生物素標記的羊抗兔IgG）孵育30 min；⑺棄去二抗，PBS浸泡3次，每次5 min，滴加DAB顯色劑，鏡下觀察組織顏色，適時終止；⑻PBS洗去DAB顯色劑，滴加蘇木素復染約5 min，自來水沖洗，1%的鹽酸酒精（75%）溶液分化5s，自來水沖洗5 min藍化；⑼依次經過70%、80%、90%、95%、無水乙醇各5 min，二甲苯20 min后用中性樹脂封片。顯微鏡下觀察MMP-3、MMP-13蛋白表達水平。

1.5 免疫組化結果判定 采用雙盲法，由兩位未參與前期試驗且有病理工作經驗的工作人員在（×100）視野下對蛋白表達結果進行統計。采用半定量分析法進行統計，具體計分方法如：⑴陽性細胞表達率：0分=無表達、1分=1%～25%、2分=25%～50%、3分=50%～75%、4分=75%以上；⑵染色強度：0分=無顏色、1分=淺黃色、2分=黃色、3分=棕黃色。兩者得分相乘作為最后得分，≥2分為表達陽性，＜2分則為陰性。

1.6 統計學方法 采用SPSS23.0軟件統計分析數據，符合正態分布的計量資料采用均數±標準差（±s）表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；計數資料以例頻數/百分率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗，危險因素分析采用Logistic回歸分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般資料比較 102例慢性胃炎患者中H.pylori陰性組43例（42.16%）,其中男性25例（58.14%）,女性18例（41.86%），年齡23～65，平均年齡（41.15±7.07）歲；H.pylori陽性組59例（57.84%），其中男性37例（62.71%），女性22例（37.29%），年齡24～67歲，平均年齡（41.51±7.11）歲，H.pylori陰性和H.pylori陽性患者性別構成比和年齡差異均無統計學意義（P＜0.05）。

2.2 HE染色結果 有病理結果可以發現，H.pylori陰性組患者胃粘膜有少量炎性細胞浸潤，同時伴有少量淋巴細胞和漿細胞浸潤；而H.pylori陽性組患者胃粘膜大部分腸化生，固有腺體減少，同時組織結構大量被破壞，并伴有較多炎性細胞浸潤，見圖1。

圖1 兩組患者胃組織病理鏡下表現（蘇木素-伊紅染色，×40）

2.3 兩組患者MMP-3、MMP-13蛋白表達水平比較 兩種蛋白的表達均位于細胞核內，與H.pylori陰性組比較，H.pylori陽性組MMP-3和MMP-13蛋白表達水平均顯著升高，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1和圖2。

圖2 兩組患者胃組織鏡下MMP-3、MMP-13蛋白表達水平（免疫組織化學，×200）

表1 兩組患者MMP-3、MMP-13蛋白表達水平比較[n（%）]

2.4 MMP-3、MMP-13表達水平與患者基礎指標的關系 通過比較不同年齡、性別、吸煙史和飲酒史患者發現，其胃組織中MMP-3、MMP-13表達水平均無顯著性差異（P＞0.05），見表2。

表2 胃組織中MMP-3、MMP-13蛋白表達情況和臨床基礎指標的關系[n（%）]

3 討論

胃炎是臨床上常見的消化道疾病，根據病理和病程特點，胃炎常分為急性胃炎和慢性胃炎兩大類。其中慢性胃炎的發生率較高，治療藥物種類繁多，但治療效果較差，很容易復發[10]。慢性胃炎的病因和機制非常復雜，通常是由多種因素引起的，其中氧自由基破壞胃粘膜的假設已逐漸為人們所接受。氧自由基是重要的致病因子，主要通過脂質過氧化和共價鍵結合引起胃粘膜損傷[11]。胃粘膜損傷是由于胃粘膜防御功能和損傷因子之間的平衡被破壞，最終導致胃的急慢性炎癥性損傷[12]。研究證實，慢性胃炎患者更容易患胃癌。此外，慢性胃炎的炎癥活動期被認為是浸潤性胃癌癌前病變的第一階段。因此，為了預防疾病的發展，慢性胃炎應引起足夠的重視并得到治療[13]。幽門螺桿菌誘發慢性胃炎的發病機理尚不清楚，但是在幽門螺桿菌的目前已知研究中發現，可產生多種毒力因子。有研究顯示，在小鼠感染幽門螺桿菌后，其胃粘膜發生不典型增生和萎縮的時間明顯早于無幽門螺桿菌感染的小鼠，說明幽門螺桿菌感染可加重慢性胃炎的病情[14]。

基質金屬蛋白酶（MMP）通過調節細胞的生長,分化,凋亡,侵襲,轉移，血管生成和免疫監視，在疾病發展的多個步驟中起重要作用[15]。目前MMPs家族成員已鑒別出MMP1～26共計26種，根據其同源性，可分為膠原酶、明膠酶、基質降解素和基質溶解素等6大類，其中已被證實MMP-3可激活MMPs家族其他成員。MMP-3為一種基質溶解素，其作用是分解細胞外基質，從而導致外界環境中的病原菌更容易進入細胞內部，從而加速疾病的發生發展[16]。MMP-13，也稱為人膠原酶-3，被認為在多種炎性疾病的發展過程中起重要作用。有研究發現，在早期骨關節炎中，MMP-13的表達和含量均顯著上升,且隨著疾病的進程呈現上升趨勢[17]。但是目前關于MMP-3與MMP-13蛋白在慢性胃炎中的研究還鮮有報道，但是同作為MMPs家族中的一員，其表達也存在一定的關聯性。在正常細胞中，MMP-13的表達水平一般相對較低，但是有研究發現，在關節炎等疾病中，MMP-3蛋白表達水平的增加，可促進MMP-13蛋白的高表達，從而引起疾病向不利于轉歸的方向發展[18]。

在本研究中，與未感染幽門螺桿菌的胃炎患者相比，感染幽門螺桿菌的胃炎患者胃粘膜大部分腸化生，固有腺體減少，同時組織結構大量被破壞，并伴有較多炎性細胞浸潤，表明較普通胃炎患者，在感染幽門螺桿菌后，其對患者機體損傷更加嚴重。對比H.pylori陰性組和陽性組發現，H.pylori陽性組MMP-3與MMP-13蛋白表達水平均顯著高于H.pylori陰性組，結合病理結果，進一步反應了幽門螺桿菌對機體的損傷嚴重程度，其機制可能是幽門螺桿菌通過產生某些毒力因子，從而促進機體MMP-3的蛋白表達增加，同時MMP-3靶向調控MMP-13蛋白表達水平，是MMP-13表達水平增加，MMP-3與MMP-13蛋白表達增加后，促進機體炎癥水平的加重，從而使疾病向不利于轉歸的方向發展。同時本研究也分析了不同年齡、性別、吸煙和飲酒史患者的MMP-3與MMP-13蛋白表達水平，結果顯示MMP-3與MMP-13蛋白表達水平與患者年齡、性別及生活習慣并無相關性，因此也可更進一步的說明MMP-3和MMP-13蛋白的表達水平可能是受到了幽門螺桿菌的影響。

綜上，MMP-3與MMP-13可能參與了幽門螺桿菌致炎過程，幽門螺桿菌可能導致了其異常表達，從而促進了胃粘膜上皮細胞增殖紊亂的發生，使患者炎癥加重，這可能是幽門螺桿菌治病的可能機制之一，有望為臨床幽門螺桿菌引起的慢性胃炎提供治療靶點。