間接免疫熒光法檢測血小板相關抗體新判讀標準的建立和評價

楊細媚，萬祥輝，黃超，付晶晶，劉志強，柯江維

（1.江西省兒童醫院檢驗科，2.腫瘤醫院檢驗科，江西 南昌 330006）

血小板具有復雜的抗原系統,包括與其它組織或細胞所共有的抗原,如ABO血型系統抗原和人類白細胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)；血小板特異性抗原(human platelet antigen，HPA)等[1]，而輸血，感染等因素可誘導機體產生血小板抗體，導致相應疾病的產生[2-3]。目前研究較多的血小板自身抗體有兩類：一類是針對HLA類抗原的抗體，即血小板表面相關抗體 (platelet associated immunoglobulin,PAIg)；一類是針對血小板糖蛋白的血小板特異性抗體[4-5]。本研究采用修正判讀標準后的間接免疫熒光法(indirect immunofluorescence assay,IIF)檢測PAIg。現對新標準進行評估，確定其可靠性，了解其在免疫性血小板減少癥(immune thrombocytopenia,ITP)和紅斑狼瘡(lupus erythematosus,SLE)相關臨床疾病中的診斷意義，及與流式細胞儀法(flow cytometry method,FCM)的符合率。

1 材料與方法

1.1 一般資料 收集2020年全年江西省兒童醫院確診的ITP患兒261例，男154例，女107例，平均年齡3.51歲；SLE患兒50例，男8例，女52例，平均年齡12.69歲，為實驗組。AA患兒50例為病例對照組，男19例，女31例，平均年齡5.38歲。正常體檢兒童50例為正常對照組，男30例，女性20例，平均年齡3.50歲。

1.2 儀器與試劑 萊卡熒光顯微鏡。 BD FACSCantoⅡ流式細胞儀。血小板抗體間接免疫熒光法檢測試劑盒購于歐蒙診斷試劑有限公司。CD61，FITC-IgG購于BD公司。

1.3 檢測方法 IIF法檢測PAIg，以修正前后的新舊標準進行兩次判讀，對兩次結果進行統計學分析。然后用FCM檢測PAIg，對兩組方法檢測的一致性進行分析。

1.3.1 IIF法檢測PAIg按試劑說明書的檢測方法進行操作。結果判讀：將原來的判讀標準“與陽性對照結果一致判斷為陽性”修正為“血小板著染均一熒光，以熒光強度大于或等于陽性對照稀釋3倍后的熒光強度判斷為陽性”。

1.3.2 FCM檢測PAIg抽取EDTA-K2抗凝血，分離富血小板血漿(platelet rich plasma,PRP)，用PBS洗滌3遍，-20℃保存待測。每管分別加入3μl鼠抗人CD61-PE，l0μl羊抗IgG-FITC單克隆抗體避光孵育15 min,PBS緩沖液洗滌后，離心5 min，再用4%的甲醛溶液重懸，以CD61對血小板設門上流式細胞儀檢測。結果判斷：采用CellQuestPro軟件分析。

1.4統計學方法 采用SSPS 24.0統計軟件對數據進行統計分析，對新舊兩種判讀標準進行配對χ2檢驗。IIF和FCM兩種檢測方法采用Kappa一致性分析及McNemer檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 IIF檢測PAIg在ITP和SLE診斷中的意義以臨床診斷作為金標準，使用新的判讀標準后，ITP和SLE患兒PAIg的陽性率分別從19.54%(51/261)上升到62.07%(162/261)和16.00%(8/50)上升到38.00%(19/50)。新舊標準的陽性率有統計學差異 (P=0.000)，總的診斷效率從45.01%上升到67.64%(P=0.000)。研究發現其中17例持續性和慢性ITP患兒治療后PAIg陽性率為29.42%(5/17)，遠低于急性組ITP患兒64.34%(157/244)，見表1。AA組中PAIg的陽性率從修正前的14.00%(7/50)上升到修正后的28.00%(14/50)，正常對照組中，修正標準前后均為1例陽性。

表1 IIF法檢測PAIg新舊判讀標準的方法學評價（%）

2.2 各組PAIg在兩種方法中的一致性分析 IIF法在ITP患兒中PAIg陽性率為64.00%(32/50)，FCM法陽性率為74.00%(37/50)，IIF法與FCM法的符合率為88.00%。通過McNemer檢驗(P=0.125)，提示兩種方法診斷情況一致;Kappa值為0.680，提示兩種方法診斷結果存在一致性。IIF法在SLE患兒的陽性率為38.00%(19/50)，FCM法陽性率為34.00% (17/50)，IIF法與FCM法的符合率為84.00%。通過McNemer檢驗(P=0.727)，提示兩種診斷方法無差異；Kappa值0.653提示兩種方法診斷結果存在一致性。見表2。IIF在50例AA患兒中檢出14例PAIg，FCM法檢出12例，IIF法與FCM法的符合率88.00%。通過McNemer檢驗(P=0.375)，提示兩種方法診斷情況一致，Kappa值為0.733，提示兩種方法診斷結果一致性較好。正常對照組中，IIF法檢出1例PAIg，FCM全陰，兩種方法的符合率為98.00%。見表3。

表2 ITP組和SLE組兩種檢測方法的一致性分析

表3 AA組和正常對照組兩種方法的一致性分析

3 討論

ITP是兒童常見的出血性疾病之一，國內外研究報道血小板自身抗體的檢測在ITP鑒別診斷和療效中有較高的應用價值[6-8]。血小板抗體檢測方法較多，常用的有血小板粘附免疫熒光實驗(platelet adhesion immunofluorescence test,PAIFT)、酶聯免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)，FCM等。PAIFT方法簡單，是較早的敏感方法，1986年國際血小板血清學研討會曾將其作為參考方法,并規定任何新的血小板抗體檢測方法均應與其進行比較[9]。ELISA是現今國內外應用最普遍的方法，但其敏感性和特異性均較低。近年來FCM法檢測PAIg在國內外臨床逐步推廣使用，比較成熟[10-11]。本研究采用IIF法，其原理類似PAIFT法，說明書的判讀標準為“與陽性對照一致判為陽性”，故判讀時以陽性對照的熒光強度為標準，與陽性對照一致判斷為陽性，結果發現陽性率很低。通過與公司商討對判讀標準進行具體化解讀：“血小板著染均一熒光，熒光模型與陽性對照一致，但熒光強度需進一步摸索，本研究以陽性對照稀釋3倍的熒光強度進行判斷”。陽性率得到大幅提升，且與FCM進行Kappa一致性分析得出兩種方法的結果一致，符合率較好。本研究發現急性ITP患兒的PAIg陽性率明顯高于慢性或者經過治療后的，可能是由于治療抑制了抗體的產生，導致抗體水平降低。由此可見，檢測PAIg可成為鑒別急慢性ITP和隨訪患者的有用工具，與Salah Aref等[12]報道的結果一致。血小板相關抗原與其他細胞或組織存在共有抗原，故自身免疫性疾病如SLE患者體內亦可檢測出PAIg[13]。本實驗方法檢測SLE組患兒的PAIg陽性率明顯低于李敏等[14]的報道，可能原因在于本研究人群為SLE患兒，而其研究人群為SLE伴血小板減少的患者。SLE組檢測PAIg陽性結果的熒光強度常強于ITP組患兒，推測SLE組患兒本身存在其他的自身抗體。AA組用IIF法檢測的陽性率亦較高，但與FCM檢測的陽性率接近，可見AA組出現的假陽性率不是由于方法學的原因導致。有研究報道[15]AA組患兒PAIg水平增高，表明這部分患者體內存在針對自身血小板抗原的自身免疫反應，還有研究報道[16]AA組患兒體內血小板抗體與多次輸血有關。本研究AA組的14例患兒中有10例有2次以上輸血史。總之，與FCM法比較，IIF法不需要對標本進行血小板富集，洗滌等前期處理，整個操作過程簡單，耗時短，成本低廉。尤其針對血小板數量少的患兒來說更合適，因為IIF法檢測PAIg所需標本量很少，且不受標本中血小板數量影響，提高了因采血困難和采血量大患兒家屬的滿意度。

本實驗采用修正判讀標準后，IIF法陽性率得到大的提升，但總的陽性率在ITP患兒中還有待提高，特異性較一般。而且因是人工判讀，結果存在主觀差異，難以標準化。但由于其操作簡便，標本需要量少，患兒家屬易于接受，與FCM的符合率較好，IIF更適合對ITP患兒的PAIg進行篩查診斷。