膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)鏡術(shù)后血清miR-140、IL-1β、MMP-13水平變化及臨床意義

白云鶴

（焦作市人民醫(yī)院關(guān)節(jié)外科，河南 焦作 454002）

膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）是一種常見的慢性退行性骨關(guān)節(jié)病，初期一般表現(xiàn)為關(guān)節(jié)痛、酸脹和不適，隨著病情進展，可出現(xiàn)關(guān)節(jié)積液、關(guān)節(jié)交鎖、O型腿或X型腿等[1-2]。關(guān)節(jié)鏡手術(shù)目前臨床常用的治療KOA的術(shù)式之一，可以利用關(guān)節(jié)器械通過小切口進入到關(guān)節(jié)腔，可以縮短手術(shù)切口，適用范圍廣，且術(shù)后疤痕攣縮不會影響關(guān)節(jié)活動，關(guān)節(jié)內(nèi)部結(jié)構(gòu)清晰可見，不遺漏[3]。微小核糖核酸-140 (microRNA-140,miR-140)是一種的非編碼小分子RNA，廣泛參與細胞的增殖、分化和凋亡。既往研究顯示，miR-140在冠心病及肺癌中出現(xiàn)異常表達[4-5]。然而miR-140在KOA患者中的表達情況尚未見相關(guān)文獻記載。 白細胞介素-1β（interleukin-1β,IL-1β）是一種促炎細胞因子,能激活中性粒細胞和巨噬細胞吞噬入侵的病原體，釋放有毒的氧和氮自由基，參與抗病毒和抗感染的免疫過程[6]?；|(zhì)金屬蛋白酶-13(matrix metalloproteinase 13,MMP-13)是基質(zhì)金屬蛋白酶家族成員之一,在骨關(guān)節(jié)炎發(fā)展過程中起重要作用[7]。因此，本研究在采用節(jié)鏡手術(shù)治療KOA患者的基礎(chǔ)上，觀察關(guān)節(jié)鏡手術(shù)后KOA患者血清miR-140、IL-1β、MMP-13水平的變化，并分析該指標的變化與KOA患者療效的相關(guān)性，為術(shù)后治療方案調(diào)整提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019年2月至2021年2月在本院收治的KOA患者120例，其中男性79例，女性41例，年齡47～73歲，平均（60.57±6.56）歲。納入標準：符合KOA診斷標準[8]；患者及家屬了解并給予知情同意。排除標準：⑴類風濕性關(guān)節(jié)炎；⑵化膿性關(guān)節(jié)炎；⑶痛風性關(guān)節(jié)炎；⑷免疫性關(guān)節(jié)炎；⑸關(guān)節(jié)外傷；⑹嚴重軀體疾病。所有患者均采用關(guān)節(jié)鏡手術(shù)治療，根據(jù)術(shù)后1個月療效將其分為優(yōu)良組（n=88）和中差組（n=32）。經(jīng)醫(yī)院倫理委員會通過。

1.2 治療方法 所有患者均采用關(guān)節(jié)鏡手術(shù)治療。首先實施硬膜外麻醉，患者仰臥在手術(shù)臺上。大腿根部安裝下肢止血帶。準備好灌洗液并保持適當?shù)膲毫Α５夥Ｒ?guī)消毒皮膚，鋪無菌巾。在膝部做外側(cè)或內(nèi)側(cè)小切口1 cm至關(guān)節(jié)腔，屈膝90°置入關(guān)節(jié)鏡。通過關(guān)節(jié)鏡探查關(guān)節(jié)腔，然后去除游離體、骨刺和病變半月板。采用負壓吸引裝置徹底吸除關(guān)節(jié)腔內(nèi)的殘留的組織碎片。術(shù)后徹底沖洗關(guān)節(jié)腔，取出器械并放置引流管。

1.3 療效評估 術(shù)后1個月后進行臨床療效評估[9]。優(yōu)：膝關(guān)節(jié)疼痛、腫脹及僵硬等臨床癥狀完全消失，功能基本恢復(fù)，可正常行走。良：膝關(guān)節(jié)疼痛基本消失，腫脹及僵硬等臨床癥狀明顯減輕，功能基本恢復(fù)，疲勞時可復(fù)發(fā)。中：膝關(guān)節(jié)疼痛、腫脹及僵硬等臨床癥較前略有減輕，疲勞時可反復(fù)發(fā)作。差：膝關(guān)節(jié)相關(guān)臨床癥狀和體征無改善，活動仍受限。

1.4 觀察指標

1.4.1 一般資料 根據(jù)研究目的，設(shè)計調(diào)查表，收集所有患者的一般資料，包括性別、年齡、病程、體質(zhì)指數(shù)（body mass index,BMI）、病變部位、半月板破裂情況、KOA遺傳史、吸煙史、飲酒史、術(shù)后康復(fù)鍛煉情況、是否合并糖尿病及高血壓。

1.4.2 膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)活動度 采用疼痛視覺模擬評分(Visual Analogue Scale/Score,VAS)[10]評估術(shù)前和術(shù)后1個月的疼痛程度。方法是使用一條長約10cm的游動標尺，一面標有10個刻度，兩端分別為“0”分端和“10”分端，0分表示無痛，10分表示最劇烈的無法忍受的疼痛。采用奎森功能演算指數(shù)(Lequesne)[11]評分來評價術(shù)前及術(shù)后1個月的病情及關(guān)節(jié)功能。量表分為疼痛或不適5項（0～8分）、行走能力（0～8分），生活能力（0～8分）3個部分。得分越高，說明膝骨性關(guān)節(jié)炎越嚴重。采用膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)活動度(range of motion,ROM)[12]來評價術(shù)前和術(shù)后1個月的膝關(guān)節(jié)活動度。用膝關(guān)節(jié)量角器測量膝關(guān)節(jié)ROM，以股骨外髁為軸，以股骨縱軸為固定臂，以腓骨小頭與外踝的連線為移動臂，測量膝關(guān)節(jié)屈伸范圍，設(shè)定膝關(guān)節(jié)伸直時活動度為0°。

1.4.3 血清學指標 分別于術(shù)前、術(shù)后1個月清晨抽取空腹靜脈血3 ml，室溫下放置2 h，然后1000×g離心20 min，取上清待檢。采用實時熒光定量PCR（real-time quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR）法測定血清miR-140表達水平。按照上?？泼羯锟萍加邢薰旧a(chǎn)的miR-140試劑盒中的操作步驟，提取血清總RNA。選用上海研卉生物科技有限公司提供的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，將血清總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以U6作為內(nèi)參基因（上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′；下游引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′）。miR-140引物（上游引物：：5′-ACACTCCAGCTGGGTAC CACAGGGTAG-3′；下游引物：5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGT-3′）。引物由赫澎（上海）生物科技有限公司提供。反應(yīng)條件：25℃5 min，42℃30 min，85℃5 min，滅活逆轉(zhuǎn)錄酶活性，用去離子水將cDNA稀釋10倍后-20℃保存。采用上海艾研生物科技有限公司生產(chǎn)的ABI實時熒光定量PCR儀QuantStudio 3進行qRT-PCR操作。程序設(shè)定為：95℃預(yù)熱3 min，(95℃30 s，60℃30 s，72℃15 s)35個循環(huán)，72℃5 min終止反應(yīng)。采用2-ΔΔCt算法計算miR-140相對表達水平。采用酶聯(lián)免疫吸附法測定檢測IL-1β水平，試劑盒購自南京賽泓瑞生物科技有限公司。按照試劑盒操作說明，每孔加標準品或樣品100μl。除去液體。加入100μl生物素化檢測抗體，37℃孵育1 h。除去液體。加入100μl辣根過氧化物酶偶聯(lián)物。37℃孵育30 min。吸出并沖洗5次。加入90μl底物試劑。37℃孵育15 min。加入50μl停止液。立即在450 nm處讀取光密度值。計算IL-1β濃度。同法檢測MMP-13水平。試劑盒購自南京卡米洛生物工程有限公司。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 18.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，滿足正態(tài)分布且方差齊的計量資料采用（±s）表示，采用兩樣本獨立t檢驗比較組間差異，計數(shù)資料用率表示，采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 KOA患者關(guān)節(jié)鏡術(shù)后的臨床療效 120例KOA患者術(shù)后1個月，優(yōu)52例，良36例，中30例，差2例。優(yōu)良率為73.33%（88/120）、中差率為26.67%（32/120）。

2.2 兩組KOA患者一般資料比較 優(yōu)良組患者在年齡、病程、BMI、半月板破裂、吸煙史、術(shù)后康復(fù)鍛煉及合并糖尿病方面與中差組相比，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 兩組KOA患者一般資料比較（n，%）

2.3 兩組KOA患者的VAS評分、SAS評分與Lequesne指數(shù)比較 術(shù)后1個月，優(yōu)良組KOA患者的VAS評分與Lequesne指數(shù)評分均低于中差組（P＜0.05），優(yōu)良組KOA患者的ROM大于中差組（P＜0.05）。見表2。

表2 兩組KOA患者的VAS評分與SAS評分比較（±s）

表2 兩組KOA患者的VAS評分與SAS評分比較（±s）

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2.4 兩組KOA患者的血清學指標比較 術(shù)后1個月，優(yōu)良組KOA患者的miR-140表達水平高于中差組（P＜0.05），優(yōu)良組KOA患者的IL-1β、MMP-13水平均低于中差組（P＜0.05）。見表3。

表3 兩組KOA患者的血清學指標比較（±s）

表3 兩組KOA患者的血清學指標比較（±s）

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2.5 血清miR-140、IL-1β、MMP-13水平變化與ROM之間的相關(guān)性分析 Spearson相關(guān)性分析顯示，血清miR-140、IL-1β、MMP-13水平變化與ROM呈顯著的正相關(guān)關(guān)系（r=0.342，P＜0.05）。

2.6 血清miR-140表達與IL-1β、MMP-13之間的相關(guān)性分析Spearson相關(guān)性分析顯示，血清miR-140表達與IL-1β、MMP-13呈顯著的正相關(guān)關(guān)系（r=0.331，P＜0.05）。

2.7 血清miR-140、IL-1β、MMP-13對KOA患者療效的預(yù)測價值 將兩組納入ROC曲線分析，血清miR-140、IL-1β、MMP-13及 聯(lián) 合 檢 測 預(yù) 測KOA患者療效的曲線下面積(areas under the curve,AUC)分別為0.745、0.712、0.660、0.903（P＜0.05）。見圖1、表4。

圖1 血清miR-140、IL-1β、MMP-13與KOA患者療效的ROC曲線測量值

表4 血清miR-140、IL-1β、MMP-13水平與KOA患者療效的ROC曲線特征

3 討論

KOA是一種以關(guān)節(jié)軟骨變性、破壞及骨質(zhì)增生為特征的慢性關(guān)節(jié)疾病[13]。臨床上以中老年患者最為常見，女性發(fā)病率(70%)高于男性[14]。典型的癥狀是膝關(guān)節(jié)疼痛和腫脹，隨著時間的推移會逐漸發(fā)展，并可能導(dǎo)致膝關(guān)節(jié)畸形[15]。KOA的發(fā)生對患者的日常生活有嚴重的影響，尤其是行走和上下樓梯時會更加痛苦。因此，要及早發(fā)現(xiàn)，及時治療，避免出現(xiàn)關(guān)節(jié)畸形等情況。

本研通過關(guān)節(jié)鏡手術(shù)的方式來治療KOA患者，結(jié)果顯示，120例KOA患者術(shù)后1個月，關(guān)節(jié)功能恢復(fù)的優(yōu)良率為73.33%，說明關(guān)節(jié)鏡手術(shù)對KOA患者有較好的療效。關(guān)節(jié)鏡手術(shù)是關(guān)節(jié)疾病中常用的一種微創(chuàng)技術(shù)，通過自然關(guān)節(jié)間隙，打開兩個直徑5 mm左右的通道，在關(guān)節(jié)內(nèi)置入棒狀光學儀器，然后在顯示器上反映關(guān)節(jié)的細微結(jié)構(gòu)，在關(guān)節(jié)鏡的監(jiān)視下取出關(guān)節(jié)病變滑膜、游離體及其他病理物質(zhì)，具有創(chuàng)傷小，術(shù)后愈合效果好等優(yōu)點[16]。本研究結(jié)果顯示，優(yōu)良組KOA患者在年齡、病程、BMI、半月板破裂、吸煙史、術(shù)后康復(fù)鍛煉及合并糖尿病方面與中差組相比，差異顯著，提示以上因素可能是影響KOA患者療效的危險因素。本研究結(jié)果顯示，術(shù)后1個月，優(yōu)良組KOA患者的VAS評分與Lequesne指數(shù)評分均低于中差組，提示關(guān)節(jié)鏡手術(shù)可以減輕患者的疼痛，改善患者的關(guān)節(jié)功能。既往實踐證明，關(guān)節(jié)鏡下關(guān)節(jié)成形術(shù)能夠顯著緩解KOA患者的臨床癥狀，并能有效減輕膝關(guān)節(jié)疼痛，有較好的治療效果[17]。因關(guān)節(jié)鏡手術(shù)是一種創(chuàng)傷小、安全有效、疼痛少、易于被患者接受的微創(chuàng)治療方法，且術(shù)后早期即可活動和使用肢體，關(guān)節(jié)功能恢復(fù)快，可有效緩解患者的癥狀。同時本研究結(jié)果顯示，優(yōu)良組KOA患者的ROM大于中差組，提示關(guān)節(jié)鏡手術(shù)可改善患者的關(guān)節(jié)活動范圍。由于關(guān)節(jié)鏡手術(shù)早期患者即可活動肢體，關(guān)節(jié)功能恢復(fù)較快，因而關(guān)節(jié)活動范圍大于中差組。

本研究結(jié)果顯示，術(shù)后1個月，優(yōu)良組KOA患者miR-140的表達水平高于中差組。miR-140在軟骨細胞中呈特異性高表達，在維持軟骨細胞平衡的同時，調(diào)節(jié)人類軟骨形成和發(fā)育[18]。既往研究顯示，miR-140參與骨關(guān)節(jié)炎軟骨的損傷修復(fù)[19]。結(jié)合本研究結(jié)果說明，miR-140高表達有利于KOA患者的軟骨修復(fù)。本研究結(jié)果顯示，優(yōu)良組KOA患者術(shù)后1個月的IL-1β、MMP-13水平均低于中差組，提示關(guān)節(jié)鏡手術(shù)可減輕KOA患者的炎癥反應(yīng)。IL-1β由先天免疫系統(tǒng)的前哨細胞，即單核細胞和巨噬細胞產(chǎn)生，對免疫應(yīng)答的組織修復(fù)中顯示出較大優(yōu)勢。當機體受到致病菌、病毒及其類似物刺激時，IL-1β分子可迅速激活，以不同形式參與抗病毒和抗感染的免疫過程[20]。IL-1β水平可反映機體炎癥疾病的嚴重程度，提示關(guān)節(jié)鏡手術(shù)可有效降低機體的炎癥反應(yīng)。在骨和軟骨的發(fā)育過程中，MMP-13參與了關(guān)節(jié)炎中關(guān)節(jié)損傷和破壞的過程。MMP-13水平的降低有利于KOA患者關(guān)節(jié)損傷的修復(fù)。Spearson相關(guān)性分析顯示，血清miR-140、IL-1β、MMP-13水平變化與ROM呈顯著的正相關(guān)關(guān)系，提示血清miR-140、IL-1β、MMP-13水平的變化會直接影響KOA患者的術(shù)后康復(fù)。ROC曲線分析結(jié)果顯示，血清miR-140、IL-1β、MMP-13及聯(lián)合檢測預(yù)測KOA患者療效的AUC分別為0.745、0.712、0.660、0.903，提示臨床可根 據(jù) 血 清miR-140、IL-1β、MMP-13水 平 預(yù) 測KOA患者療效。

綜上所述，關(guān)節(jié)鏡手術(shù)治療KOA患者，可減輕患者的疼痛、焦慮，提高血清miR-140表達水平，降低血清IL-1β、MMP-13水平，改善關(guān)節(jié)活動度。血清miR-140、IL-1β、MMP-13水平對KOA患者療效有較高的預(yù)測價值。