EBV-DNA檢測(cè)與鼻咽癌患者免疫狀態(tài)及預(yù)后的相關(guān)性分析

路愛麗，魯廣建

（1.河南省新鄉(xiāng)市第一人民醫(yī)院 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第五臨床學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科,河南 新鄉(xiāng) 453000；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科,河南 新鄉(xiāng) 453000）

EB病毒（EBV）感染與鼻咽癌的發(fā)病密切相關(guān)[1]。已有研究表明，在鼻咽癌高發(fā)地區(qū)，鼻咽癌組織中的EBV的EBER基因陽(yáng)性率超過90%，大約53%～96%的首診鼻咽癌患者在治療前可檢測(cè)到血液中存在EBV-DNA[2]。目前血漿中循環(huán)EBV-DNA載量已被確定為鼻咽癌的腫瘤標(biāo)志物，也被作為篩查、監(jiān)測(cè)和預(yù)測(cè)鼻咽癌疾病進(jìn)展的重要標(biāo)志。但在鼻咽癌患者中有關(guān)EBV與外周血免疫細(xì)胞亞群間的關(guān)系研究較少，這種改變對(duì)患者預(yù)后的影響也尚不清楚。此外，不同中心采用的EBV-DNA檢測(cè)方法存在差異，其臨床意義還有待更多臨床數(shù)據(jù)的驗(yàn)證[3]。本研究以我院2017年1月至2021年1月收治的鼻咽癌患者60例為研究對(duì)象，采用PCR-熒光探針法檢測(cè)EBV-DNA、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)免疫細(xì)胞亞群，分析EBV-DNA與鼻咽癌患者免疫狀態(tài)及其與鼻咽癌分期和預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年1月至2021年1月收治的鼻咽癌患者60例為觀察組。納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴經(jīng)活檢確診鼻咽癌；⑵均為實(shí)診患者；⑶均采用基于鼻咽與頸部MRI掃描的根治性調(diào)強(qiáng)放療。另選取同期在我院體驗(yàn)的健康者60例為對(duì)照組。觀察組男41例，女19例；年齡21～76歲，平均（56.29±7.63）歲；對(duì)照組男38例，女22例；年齡19～77歲，平均（55.83±7.26）歲。兩組性別、年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。觀察組患者于入院后第一天（治療前）和放射治療四個(gè)月后各檢測(cè)一次EBV-DNA和免疫淋巴細(xì)胞亞群。

1.2 方法

1.2.1 EBV-DNA檢測(cè)方法 采用EBV核酸定量檢測(cè)試劑盒（PCR-熒光探針法），購(gòu)自圣湘生物科技公司。具體如下：采集全血樣本，取1 ml紅細(xì)胞裂解液加入2 ml離心管，加入800μl全血樣本，充分混勻，12000 rpm/min離心1 min，去上清；再加入1 ml紅細(xì)胞裂解液，充分混勻，12000 rpm/min離心3 min,去上清；再加1 ml生理鹽水，直接12000 rpm/min離心10 min，去上清；在管底白色沉淀中加入400μl核酸釋放劑，震蕩混勻，75°C恒溫處理10 min后瞬時(shí)離心，備用。在上海之江宏石SLAN 96P擴(kuò)增儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將待測(cè)樣本、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照以及定量參考品加入專用PCR反應(yīng)管，按說明書要求設(shè)置反應(yīng)參數(shù)，反應(yīng)結(jié)束后記錄Ct值。Ct值≤39為EBV-DNA陽(yáng)性。

1.2.2 免疫細(xì)胞亞群檢測(cè) 抽取受試者外周靜脈血2 ml肝素抗凝，采用貝克曼CytoFLEX流式細(xì)胞儀及其分析軟件，嚴(yán)格按其操作要求測(cè)定免疫淋巴細(xì)胞亞群，主要包括：CD3+T淋巴細(xì)胞、CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞、CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞、CD19+B淋巴細(xì)胞、CD56NK細(xì)胞的比例及CD4+／CD8+的比值。

1.2.3 相關(guān)定義及計(jì)算 靈敏度=a/（a+b）；特異度=d/（c+d）。a、b分別為EBV-DNA陽(yáng)性、陰性的鼻咽癌患者；c、d分別為EBV-DNA陽(yáng)性、陰性的健康者。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。采用ROC曲線分析EBV-DNA陽(yáng)性預(yù)測(cè)治療后疾病進(jìn)展情況的效能。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組EBV-DNA陽(yáng)性率比較 觀察組陽(yáng)性率（81.67%）高于對(duì)照組（3.33%）（P＜0.05），見表1。

表1 兩組EBV-DNA陽(yáng)性率比較

2.2 EBV-DNA陽(yáng)性率與鼻咽癌分期的關(guān)系 根據(jù)AJCC分期標(biāo)準(zhǔn)（第八版），觀察組患者中I期7例，其中EBV-DNA陽(yáng)性3例（42.86%）；II期12例，陽(yáng)性8例（66.67%）；III期28例，陽(yáng)性26例（92.86%）；IV期13例，陽(yáng)性12例（92.31%）。早期（I+II）患者EBV-DNA陽(yáng)性率為57.89%（11/19），晚期（III+IV）患者為92.68%（38/41），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=10.495，P=0.001）。

2.3 EBV-DNA與免疫細(xì)胞亞群的關(guān)系 治療前EBV-DNA水平與CD19+B細(xì)胞水平呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05），而與其他免疫細(xì)胞亞群水平不存在相關(guān)（P＞0.05），見表2。

表2 EBV-DNA與免疫細(xì)胞亞群的關(guān)系

2.4 EBV-DNA檢測(cè)結(jié)果與鼻咽癌進(jìn)展的關(guān)系 調(diào)強(qiáng)放療結(jié)束時(shí)進(jìn)行EBV-DNA檢測(cè)，其中陽(yáng)性9例（15.00%），陰性51例（85.00%），隨訪12個(gè)月，無腫瘤進(jìn)展47例（78.33%），復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移13例（21.67%）。放療結(jié)束時(shí)EBV-DNA陽(yáng)性患者復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移發(fā)生率（66.67%）高于陰性患者（13.73%）（P＜0.05），見表3。

表3 調(diào)強(qiáng)放療結(jié)束時(shí)EBV-DNA檢測(cè)結(jié)果與鼻咽癌進(jìn)展的關(guān)系

2.5 EBV-DNA陽(yáng)性預(yù)測(cè)鼻咽癌進(jìn)展的效能 放療結(jié)束時(shí)EBV-DNA陽(yáng)性預(yù)測(cè)鼻咽癌進(jìn)展的敏感度為46.15%，特異度為93.62%，ROC曲線下面積為0.699（95%CI：0.515～0.882）（P＜0.05），見圖1。

2.6 CD19+B預(yù)測(cè)鼻咽癌進(jìn)展的效能 治療前CD19+B水平預(yù)測(cè)鼻咽癌進(jìn)展的敏感度為88.72%，特異度為79.24%，ROC曲線下面積為0.729（95%CI：0.638～0.819）（P＜0.05），見圖2。

圖2 CD19+B水平預(yù)測(cè)鼻咽癌進(jìn)展的ROC曲線

3 討論

早在上世紀(jì)末，已有研究者從鼻咽癌患者血液中發(fā)現(xiàn)EBV-DNA，因此認(rèn)為EBV-DNA可作為診斷鼻咽癌的一項(xiàng)腫瘤標(biāo)志物[4]。但是，EBV-DNA在臨床中推廣應(yīng)用存在一個(gè)重要問題，即不同機(jī)構(gòu)檢測(cè)EBV-DNA的結(jié)果往往存在較大差異，其主要原因是檢測(cè)方法學(xué)的不同，PCR技術(shù)應(yīng)用過程中關(guān)于DNA提取、擴(kuò)增方法、臨界值選取等的差異，均可影響檢測(cè)結(jié)果[5-6]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)EBVDNA檢測(cè)片段越小，結(jié)果陽(yáng)性率越高，這說明DNA樣本是一些碎片狀態(tài)，可能增加檢測(cè)的不穩(wěn)定性[7]。本研究采用熒光定量PCR（探針法）檢測(cè)EBV-DNA，該檢測(cè)方法通過使用DNA結(jié)合染料、熒光PCR引物或探針等實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)目的基因的擴(kuò)增，從而對(duì)目的基因進(jìn)行定量分析，具有較高的準(zhǔn)確性。本研究通過系統(tǒng)分析EBV-DNA陽(yáng)性與鼻咽癌患者免疫狀態(tài)及其與鼻咽癌分期和預(yù)后的相關(guān)性，以期為EBV-DNA的研究提供更多循證資料。

本研究結(jié)果顯示，觀察組EBV-DNA陽(yáng)性率（81.67%）高于對(duì)照組（3.33%）；且早期患者EBVDNA陽(yáng)性率(57.89%)明顯低于晚期患者(92.68%)。已有研究表明，EBV-DNA陽(yáng)性與鼻咽癌N分期以及臨床分期均存在相關(guān)，隨著分期的升高，陽(yáng)性率呈現(xiàn)持續(xù)上升趨勢(shì)[8-9]。本研究結(jié)論與此一致，說明EBV-DNA水平能夠反映患者體內(nèi)的腫瘤負(fù)荷。

已有研究表明，大部分發(fā)鼻咽癌患者（53%～96%）在接受放療前血清EBV-DNA明顯升高，但在放療后即迅速降低[10-11]。Chan等[12]研究報(bào)道，EBV-DNA與鼻咽癌患者化療預(yù)后有關(guān)，可作為篩選輔助化療高危患者的指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，60例患者治療前EBV-DNA陽(yáng)性為49例，在調(diào)強(qiáng)放療結(jié)束時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，陽(yáng)性患者僅為9例。對(duì)患者隨訪12個(gè)月，結(jié)果顯示，放療結(jié)束時(shí)EBV-DNA陽(yáng)性患者復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移發(fā)生率（66.67%）高于陰性患者（13.73%），進(jìn)一步證實(shí)治療后EBV-DNA仍為陽(yáng)性的患者預(yù)后較差，與黎晚霞等[13]研究結(jié)論一致。本研究中ROC曲線分析顯示，放療結(jié)束時(shí)EBVDNA陽(yáng)性預(yù)測(cè)鼻咽癌進(jìn)展的敏感度為46.15%，特異度為93.62%，ROC曲線下面積為0.699（95%CI：0.515～0.882），表明EBV-DNA可作為預(yù)測(cè)患者病情進(jìn)展的有效指標(biāo)。大樣本（700例）長(zhǎng)期（50.7個(gè)月）隨訪研究也表明，高載量的治療前及治療后EBV DNA是鼻咽癌預(yù)后不良的預(yù)測(cè)因子，其治療失敗的風(fēng)險(xiǎn)更高[13]。本研究與此符合，進(jìn)一步證實(shí)治療后EBV-DNA陽(yáng)性是鼻咽癌疾病進(jìn)展、出現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的最強(qiáng)有力的危險(xiǎn)因素。因此建議對(duì)于放療后仍為陽(yáng)性的患者，應(yīng)及時(shí)采取積極的挽救性治療措施，以防止病情進(jìn)展。但目前關(guān)于放療后EBV-DNA仍為陽(yáng)性的患者可從何種治療方案中獲益，還有待更多臨床研究提供相關(guān)證據(jù)[14]。

從免疫的角度來看，部分鼻咽癌屬于EBV感染的惡性疾病，鼻咽癌也是一種免疫相關(guān)疾病。病毒能夠感染刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫效應(yīng)，而腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為，均與免疫功能狀態(tài)有關(guān)。目前關(guān)于鼻咽癌患者中EBV-DNA與免疫細(xì)胞亞群的關(guān)系及對(duì)預(yù)后的影響的研究還較少，本研究結(jié)果顯示，EBV-DNA與CD19+B細(xì)胞比例呈負(fù)相關(guān)，CD19是一種分子量為95000的糖蛋白，為最早發(fā)現(xiàn)的B淋巴細(xì)胞系表面標(biāo)志。EB病毒載量引起CD19+B細(xì)胞比例改變?cè)谄渌膊≈幸灿邢鄳?yīng)的研究證據(jù)[15]。本研究中ROC分析顯示，治療前CD19+B水平預(yù)測(cè)鼻咽癌進(jìn)展的AUC值為0.729，具有較好的預(yù)測(cè)效能。

綜上所述，EBV-DNA陽(yáng)性可反映鼻咽癌的腫瘤負(fù)荷，與鼻咽癌分期及預(yù)后密切相關(guān)。放療結(jié)束時(shí)EBV-DNA仍為陽(yáng)性，以及治療前CD19+B水平較低的患者長(zhǎng)期預(yù)后較差，應(yīng)盡可能采取適當(dāng)?shù)妮o助治療，以降低復(fù)發(fā)率，延長(zhǎng)患者生存期。