非酒精性肝病患者血清中G-CSF、sTREM1、TNF-α水平和腸道菌群分布變化的關聯性分析

鄒輝鑫

（南陽市中心醫院檢驗科，河南 南陽 473000）

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是一種與脂代謝、胰島素抵抗（Insulin resistance,IR）等相關的臨床綜合征[1]，主要病理特征為彌漫性肝細胞脂肪沉積和肝實質細胞變性，但NAFLD的發病機制目前仍未完全明確，同時其發病率近年來不斷攀升，成為威脅人類健康的重要問題[2]。有報道指出[3]，NAFLD與代謝綜合征有緊密聯系；近年來的研究認為不同糖代謝的NAFLD患者腸道菌群變化較為顯著[4]；腫瘤壞死因子-α（Tumour necrosis factor-α,TNF-α）能促進炎性因子釋放加重肝細胞損傷；粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（Granulocyte macrophage colony factor,GM-CSF）是一種造血因子，其在血管內皮細胞受損時大量釋放，進而調控機體免疫；可溶性髓樣細胞觸發受體（Soluble triggering receptors expressedon myeloid cells,sTREM-1）則是近些年發現的感染預測因子，預測敗血癥等方面效果頗佳[5]。目前NAFLD的血清學指標與腸道菌群均有相關研究[6-7]，但涉及上述指標的較為少見，基于此，本研究分析NAFLD患者血清GM-CSF、和sTREM-1、TNF-α水平和腸道菌群變化關聯性，為探明NAFLD的發病機制提供較好的理論依據。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2019年6月至2021年7月于本院收治的72例NAFLD患者為病例組，并根據不同預后情況將病例組分為預后不佳組和預后良好組，另外征集同期于本院體檢健康者30例作為對照組，病例組男45例、女27例，平均年齡（48.57±10.38）歲，體質指數（24.02±3.45）kg/m2；對照組男19例、女11例，平均年齡（49.12±9.79）歲，體質指數（23.34±2.76）kg/m2。兩組組間一般資料比較，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性，本研究已獲得醫院醫學倫理委員會批準。

納入標準：⑴符合臨床對NAFLD的診斷標準[8]，經影像學檢測，肝臟近場回聲增強，遠場回聲減弱，且肝臟管道結構顯示模糊；⑵患者對研究了解知情。排除標準：⑴酒精性脂肪性肝病；⑵合并心、肺、腎等臟器患嚴重疾病；⑶近期服用腸動力藥、微生物制劑；⑷因病毒性肝炎、腎功能不全、血液疾病等導致脂肪肝；⑸妊娠、孕期婦女；⑹既往有胃腸道病史。

1.2 方法 ⑴血清標本檢測：入組后清晨采集所有受試者的靜脈血標本，靜置1 h，使用低速離心機（中科中佳,SC-3616）于室溫中1500 r/min離心20min，取上清裝于EP管，送至低溫冰箱封存，融凍一天后樣本未出現溶血、絮狀現象，外觀無異常，進行下一步檢測。采用酶聯免疫法檢測血清GM-CSF、sTREM-1、TNF-α水平，試劑盒購自北京中杉金橋生物公司，檢測步驟按照說明書進行操作。同時使用全自動生化分析儀測定空腹血糖（Fasting blood glucose,FPG），空腹胰島素（Fasting insulin,FINS），另外用胰島素抵抗指數（Homeostasis model assessment,HOMA-IR）表示胰島素敏感性和IR程度，根據計算公式HOMA-IR=FPG×FINS/22.5；⑵腸道菌群檢測：入組后采集所有受試者的糞便0.5 g，制成標本送檢，用連續稀釋法稀釋成10～1至10～7后，依照各菌種的正常菌數范圍進行細菌培養，厭氧型置入厭氧盒內在恒溫箱培育72 h，需氧型置入有氧環境中，在恒溫箱培育24 h，統計培養基上的菌落數，檢測雙歧桿菌、酵母菌、腸桿菌、腸球菌的菌群數量，轉化成對數值（LgCFU/g），來定量表示腸道菌群的水平，并計算雙歧桿菌/腸桿菌比值（B/E）；⑶腸道菌群Alpha多樣性指數：所有受試者入組后行腸鏡檢測，在距肛門20 cm處提取1塊黏膜組織進行檢測，使用細菌基因組DNA試劑盒（上海恒遠生物科技公司），應用Novaseq PE250（美國Illumina公司）進行上機質檢、測序，根據說明書操作步驟，提取黏膜組織DNA，使用Uparse軟件對測序得到的有效序列進行分類[9]，得到分類單元（Operational taxonomic units,OTU），使用Alpha分析對腸道菌群多樣性進行觀察，包括Chao1、Shannon、Simpson指數，Chao1指數估計樣本所含OTU的總數，Shannon指數和Simpson指數估計微生物樣本群落的多樣性。

1.3 統計學方法 應用IBM SPSSStatistics 24.0軟件行統計學分析，對正態分布的計量資料以（±s）表示，采用獨立t檢驗；計數資料使用率（%）表示，行χ2檢驗，采用Spearman法分析腸道菌群水平與血清GM-CSF、sTREM-1、TNF-α水平的相關性，采用ROC曲線分析血清GM-CSF、sTREM-1、TNF-α對NAFLD預后的評估效能，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組腸道菌群變化比較 結果顯示，病例組的雙歧桿菌、酵母菌數目和B/E值顯著低于對照組，腸桿菌、腸球菌數目顯著高于對照組（P＜0.05），見表1。

表1 兩組腸道菌群變化比較（LgCFU/g,±s）

表1 兩組腸道菌群變化比較（LgCFU/g,±s）

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2.2 兩組腸道菌群多樣性比較 結果顯示，兩組的Chao1指數比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；病例組的Shannon指數低于對照組，而Simpson指數高于對照組（P＜0.05），見表2。

表2 兩組腸道菌群多樣性比較（±s）

表2 兩組腸道菌群多樣性比較（±s）

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2.3 兩組血清GM-CSF、sTREM-1、TNF-α水平比較 結果顯示，病例組的GM-CSF、sTREM-1以及TNF-α水平均高于對照組（P＜0.05），見表3。

表3 兩組血清GM-CSF、sTREM-1、TNF-α水平比較（±s）

表3 兩組血清GM-CSF、sTREM-1、TNF-α水平比較（±s）

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2.4 兩組其他生化指標比較 結果顯示，病例組的FPG、FINS以及HOMA-IR均高于對照組（P＜0.05），見表4。

表4 兩組其他生化指標比較（±s）

表4 兩組其他生化指標比較（±s）

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2.5 NAFLD患者GM-CSF、sTREM-1、TNF-α水平與B/E相關性分析結果 采用Spearman法分析腸道菌群水平與血清GM-CSF、sTREM-1、TNF-α水平的相關性，結果顯示，GM-CSF、sTREM-1、TNFα、HOMA-IR與B/E呈負相關（P＜0.05），見表5。

表5 NAFLD患者GM-CSF、sTREM-1、TNF-α水平與B/E相關性分析結果

2.6 不同預后情況NAFLD患者GM-CSF、sTREM-1、TNF-α水平比較 結果顯示，預后不佳組的GM-CSF、sTREM-1以及TNF-α水平均高于預后良好組（P＜0.05），見表6。

表6 不同預后情況NAFLD患者GM-CSF、sTREM-1、TNF-α水平比較（±s）

表6 不同預后情況NAFLD患者GM-CSF、sTREM-1、TNF-α水平比較（±s）

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2.7 GM-CSF、sTREM-1、TNF-α水平對NAFLD患者預后的評估價值 結果顯示，采用ROC曲線分析GM-CSF、sTREM-1、TNF-α對大腸癌圍術期感染患者預后的評估價值，GM-CSF、sTREM-1、TNF-α評估NAFLD患者預后的AUC為0.811（95%CI：0.701～0.894）、0.800(95%CI：0.689～0.885)、0.808（95%CI：0.699～0.892），TNF-α敏感度最好為75.00%，GM-CSF特異度較高為86.36%，見表7、圖1。

表7 GM-CSF、sTREM-1、TNF-α水平對NAFLD患者預后的評估價值

圖1 GM-CSF、sTREM-1、TNF-α評估NAFLD患者預后的ROC曲線

3 討論

NAFLD被認為是一種與IR、遺傳易感性等關系緊密的應激性肝受損，較早前已成為歐洲國家較常見的肝病原因，近年來發病率更是顯示上升的趨勢。NAFLD的臨床危險因素也呈現多樣化的特點[10]，如肥胖、高血壓、糖尿病和代謝綜合征等，部分NAFLD患者可能發展成為肝硬化，然而由于NAFLD臨床癥狀無明顯特點,大多數患者易忽視進而造成漏診、誤診。同時由于該病與代謝綜合征等關聯緊密，導致患者機體代謝紊亂，造成全身性危害,許多患者發展為肝硬化之前可能已病死于心血管疾病[11]。目前臨床診斷NAFLD的金標準仍然是肝組織病理活檢，可囿于其創傷性，無法全面推廣,而近些年的無創評估NAFLD病情的工具，均無法取代病理活檢來檢測患者肝纖維化程度，尋找評估NAFLD的血清、生化指標已成為當前研究的熱點[12]。本研究基于此背景進行研究，發現NAFLD患者腸道菌群變化和血清細胞因子GM-CSF、sTREM-1、TNF-α水平存在較好相關性，且三者水平變化與腸道菌群失衡共同作用，可能導致NAFLD的產生，這一發現在近年來NAFLD的相關研究中并不多見,可為研究創新之處，現報告如下。

腸道菌群棲息在人體腸道內的微生物群落，種類多、數量大。人體腸道內含有大量細菌，而不同階段和環境，腸道菌群數量都有不同的變化，但對于健康機體而言，腸道菌群始終保持著動態平衡。本研究結果顯示，病例組的雙歧桿菌、酵母菌數目和B/E值顯著低于對照組，腸桿菌、腸球菌數目顯著高于對照組，提示相比常人，NAFLD患者的腸道菌群明顯失調。分析原因，可能是NAFLD患者因肝病變和膽汁異常分泌，腸道內pH失調，結合型膽汁酸抑制腸道外細菌的作用降低，繼而導致體內腸道菌群失衡[13]；另外由于NAFLD與代謝綜合征的密切關系，可能引發患者消化道功能異常，胃腸道動力不足、蠕動減少，腸道清除功能降低，導致大量細菌過度繁殖，也可能造成菌群失衡。另一方面，研究結果還發現病例組的Shannon指數低于對照組，而Simpson指數高于對照組。Shannon指數代表菌群多樣性，Simpson指數代表菌群豐富度，Shannon指數值越大，表示多樣性越好，Simpson指數越大，種類越單一，本結果提示NAFLD患者的腸道菌群多樣性較常人明顯減少。聯系上述腸道菌群數目的結果來看，NAFLD的腸道菌群失衡、多樣性減少可能與NAFLD的發病有重要關聯[14]。

此外，結果顯示，病例組的GM-CSF、sTREM-1、TNF-α水平和FPG、FINS、HOMA-IR均高于對照組，說明NAFLD患者相比常人，體內炎癥反應較明顯，并已出現血糖代謝紊亂和IR現象。造成這一現象，推測原因可能是腸道菌群失調，導致腸道通透性增加，促進細菌移動，激活細胞免疫反應，從而加重炎癥反應。另一方面，研究結果表明GM-CSF、sTREM-1、TNF-α、HOMA-IR與B/E值均呈負相關，B/E值代表厭氧菌抑制致病菌定值腸道的能力，可全面地反映腸道菌群變化情況，因而上述結果提示腸道菌群的失調可能與GM-CSF、TNF-α的水平高低和HOMA-IR相關，考慮到GM-CSF和TNF-α的功能，分析可能是肝細胞受損時促進GM-CSF大量釋放，激活免疫反應，加重肝臟病變，而TNF-α的上升代表體內炎癥反應嚴重，細胞浸潤較深，破壞腸黏膜屏障，進而腸道菌群失衡，同樣導致肝臟病變發生，形成惡性循環[15]。至于sTREM-1與腸道菌群失衡的關系，推測是sTREM-1誘導級聯式的炎癥反應導致腸黏膜受損，引發菌群失衡，具體作用機制尚需要更深入地研究予以闡明。

最后，研究發現，預后不佳組患者的GM-CSF、sTREM-1、TNF-α水平高于預后良好組，同時ROC曲線分析顯示GM-CSF、sTREM-1、TNF-α評估NAFLD患者預后的AUC為0.811、0.800、0.808，提示GM-CSF、sTREM-1、TNF-α具 有 較 好 評 估NAFLD預后的效能；亦有研究表明[16-17]，NAFLD的預后存在多種危險因子，其中包括遺傳因素、基礎疾病、手術等，這些因素皆有可能對血清標志物GM-CSF、sTREM-1、TNF-α的評估效能造成一定影響，因此若臨床將該指標納入評估指標中，仍需聯系實際因素綜合進行考慮。

綜上，NAFLD患者腸道菌群失衡較為明顯，且GM-CSF、sTREM-1、TNF-α水平異常上調，腸道菌群變化與GM-CSF、sTREM-1、TNF-α水平有重要相關，可能共同作用導致NAFLD的發生，另外GM-CSF、sTREM-1、TNF-α能有效評估NAFLD預后。同時本研究存在一定局限性，研究樣本偏少，并且未對NAFLD病情有效分類以分析不同病情患者的腸道菌群和血清學指標的聯系，這些有待于之后擴大樣本量，行全面性的研究，予以進一步探討。