QuEChERS-高效液相色譜-串聯質譜法檢測氟吡菌胺及其代謝物和霜霉威在葉用萵苣中的殘留及消解動態

唐紅霞, 黃佳慶, 孫 強, 溫廣月, 董茂鋒*,, 王偉民*,

(1. 上海市農業科學院 農產品質量標準與檢測技術研究所 農藥安全評價研究中心，上海 201106；2. 上海科立特農產品檢測技術服務有限公司，上海 201106)

葉用萵苣Lactuca sativa L. var. ramosa Hort.在種植過程中，極易感染霜霉病、軟腐病、菌核病等多種病害[1]。687.5 g/L 氟菌 · 霜霉威懸浮劑由德國拜耳作物科學公司研發，對霜霉病、疫病、晚疫病和猝倒病等常見卵菌綱病害具有良好的防治效果[2-3]，常用于防治萵苣病害。中國《食品安全國家標準 食品中農藥最大殘留限量》[4]中，關于氟吡菌胺和霜霉威鹽酸鹽 (圖式1) 的殘留定義描述分別為氟吡菌胺和霜霉威，但在JMPR 報告[5]中，氟吡菌胺的膳食風險評估定義分別評估氟吡菌胺及其代謝物2,6-二氯苯甲酰胺。關于氟吡菌胺在葉菜類蔬菜中的最大殘留限量 (MRLs) 中國規定為30 mg/kg[4]，國際食品法典委員會 (CAC) 規定為30 mg/kg[6]，美國規定為25 mg/kg[7]。關于霜霉威在葉菜類蔬菜中的MRL 值，CAC 規定為100 mg/kg[6]，美國規定為150 mg/kg[7]，而中國目前尚未制定其在葉用萵苣中的MRL 值。

關于氟吡菌胺殘留的檢測方法有氣相色譜(GC)和氣相色譜-串聯質譜（GC-MS/MS），涉及黃瓜[8]、番茄[2-3]、葡萄[9]等作物；關于霜霉威殘留的檢測方法主要有液相色譜 (LC)、液相色譜-串聯質譜 (LC-MS/MS)和GC-MS/MS，涉及人參[10]、番茄[2-3,11]、馬鈴薯[12-13]和黃瓜[8]等作物。已有學者開展了氟吡菌胺 · 霜霉威在番茄上的殘留行為研究，但尚未見其在葉用萵苣中殘留消解評價和膳食風險評估的研究。鑒于此，本研究通過改良的QuEChERS 方法，采用高效液相色譜-串聯質譜法測定葉用萵苣中霜霉威、氟吡菌胺及其代謝物(2,6-二氯苯甲酰胺) 殘留量，并通過田間試驗分析了其消解動態，旨在為制定其在葉用萵苣中的MRL 值和安全使用方法提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

高效液相色譜-串聯質譜儀 (LC-8040 電噴霧離子源，日本Shimadzu 公司)；MX-F 渦動混合器 (中國Dragonlab 公司)；5415D 離心機 (Eppendorf 公司)。

氟吡菌胺 (fluopicolide，純度93.31%)、2,6-二氯苯甲酰胺 (2,6-dichlorobenzamide，純度99.43%)和霜霉威 (propamocarb，1 000 mg/L，溶劑為丙酮) 標準品，均為北京振翔科技有限公司產品；687.5 g/L 氟菌 · 霜霉威懸浮劑 (SC，含氟吡菌胺62.5 g/L，霜霉威鹽酸鹽625 g/L)，拜耳作物科學(中國) 有限公司。

乙腈和甲醇 (色譜純)，美國Merck 公司；甲酸和乙酸銨 (色譜純)，上海安譜實驗科技股份有限公司；氯化鈉 (分析純)，上海化學試劑公司。

十八烷基鍵合硅膠 (C18)、乙二胺-N-丙基硅烷(PSA) 和石墨化碳黑 (GCB)，日本Shimadzu 公司)；多壁碳納米管 (MWCNTs)，南京先豐納米材料科技有限公司。

1.2 田間試驗

按照《農作物中農藥殘留試驗準則》[14]要求，于2019 年分別在上海市松江區和奉賢區溫室內開展田間試驗。供試藥劑為687.5 g/L 氟菌 · 霜霉威懸浮劑，施藥劑量為有效成分928.13 g/hm2，施藥間隔期為7 d，噴霧施藥3 次，每小區100 m2，同時設空白對照。分別于末次施藥后2 h 及1、3、5、7、10 d 采樣。隨機采集兩個獨立的葉用萵苣樣本，每個樣本不少于12 株。剪取土表以上的整個個體，去除腐壞和萎蔫部分莖葉，留樣至少1 kg。

1.3 檢測條件

色譜條件：Shimadzu InertSustainSwift C18色譜柱 (2.1 mm × 50 mm，3 μm)；流速0.50 mL/min；柱溫40 ℃；進樣量2 μL。流動相A 相為甲醇，B 相為5 mmol/L 醋酸銨 (含0.1%甲酸水溶液)，梯度洗脫程序：0～1 min (10% A)；＞1～2.5 min(10% A～90% A)；＞2.5～4.5 min (90% A)；＞4.5～5.0 min (90% A～10% A)；＞5.0～6.0 min (10% A)。

質譜條件：電噴霧離子源正離子掃描 (ESI+)；多反應監測 (MRM) 模式；離子源接口電壓3.5 kV；脫除溶劑管 (DL 管) 溫度250 ℃；加熱塊溫度400 ℃；霧化氣流速3.0 L/min (N2，純度99.999%)；干燥氣流速15 L/min (N2，純度99.999%)。質譜參數見表1。

表1 霜霉威、氟吡菌胺和2,6-二氯苯甲酰胺質譜條件參數Table1 Mass spectrometry parameters for propamocarb, fluopicolide and 2,6-dichlorobenzamide

1.4 樣品前處理

樣品用食品粉碎機碎粉，勻漿，稱取5.0 g 于50 mL 聚乙烯離心管中，加入20 mL 乙腈，渦旋提取10 min，加入4 g 氯化鈉，再次渦旋30 s，于4 000 r/min 下離心5 min；取上清液1 mL 至盛有7.5 mg 多壁碳納米管的2 mL 離心管中，渦旋1.5 min 后，于10 000 r/min 下離心2 min；取上清液，過0.22 μm 有機微孔濾膜，待測定。

1.5 方法驗證

按照《農作物中農藥殘留試驗準則》[14]和歐盟SANTE/11 813/2017[15]準則要求，通過標準曲線、添加回收試驗開展殘留分析方法驗證。

1.5.1 標準溶液配制及標準曲線繪制 分別準確稱取一定量的氟吡菌胺和2,6-二氯苯甲酰胺標準品，用乙腈溶解，配制成1 000 mg/L 標準儲備溶液，于 -18 ℃保存。

分別取1 000 mg/L 氟吡菌胺、2,6-二氯苯甲酰胺儲備溶液和1 000 mg/L 霜霉威標準溶液，用乙腈稀釋，配制成10 mg/L 的混合標準工作溶液，再用葉用萵苣空白基質溶液稀釋，配制成0.005、0.05、0.1、0.5、1 mg/L 的系列基質匹配標準溶液，按1.3 節條件測定，以化合物的質量濃度為橫坐標、對應的離子峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。

1.5.2 基質效應 對于串聯質譜，由于干擾或共同洗脫的基質部分影響電噴霧接口的離子化效率，從而引起離子抑制或離子增強導致出現假陰性或假陽性或不精確的定量，因此基質效應是串聯質譜分析方法驗證的重要參數[16-17]。分別用乙腈和空白基質配制標準溶液 (0.1 mg/L)，按照公式(1) 計算基質效應 (Me)。當Me小于20%時，認為可以忽略基質效應；反之，則說明存在明顯的基質增強或減弱效應[17]。

式中，Am表示基質溶液中化合物的峰面積，As表示溶劑中化合物的峰面積，Me表示化合物基質效應。

1.5.3 添加回收試驗 向空白葉用萵苣樣品中分別添加0.02、0.2、2 和100 mg/kg 4 個水平的霜霉威、氟吡菌胺和2,6-二氯苯甲酰胺標準溶液，每個水平重復5 次。添加混勻靜置30 min 后，按1.3節條件測定，計算添加回收率及相對標準偏差。若上機濃度超過線性范圍，則用空白基質稀釋。

2 結果與討論

2.1 方法前處理優化

2.1.1 提取溶劑優化 分別比較了添加不同量的甲酸或氨水的乙腈溶液和純乙腈作為提取溶劑時對霜霉威、氟吡菌胺和2,6-二氯苯甲酰胺提取效率的影響。分別用10 mL 的0.1%甲酸-乙腈、0.2%甲酸-乙腈、乙腈、0.1%氨水-乙腈和0.2%氨水-乙腈提取目標化合物。結果顯示 (圖1)，在0.1 mg/kg添加水平 (n = 3) 下，雖然5 種溶劑回收率均在71%～108%之間，但以0.1%甲酸-乙腈或0.2%氨水-乙腈作為提取溶劑時，霜霉威的平均回收率最高，在83%～84%之間，結合流動相中含有甲酸，最終選擇以10 mL 的0.1% 甲酸-乙腈作為提取溶液。

2.1.2 吸附材料篩選 取0.1 mg/L 基質匹配混合溶液 (n = 3)，分別用50 mg C18、50 mg PSA、50 mg GCB 和5 mg 的MWCNTs 進行分散固相萃取凈化。結果 (圖2A) 顯示，除當使用GCB 時氟吡菌胺的回收率偏低 (75%) 外，其余3 種材料的回收在89%～118%之間，均符合《農作物中農藥殘留試驗準則》要求[14]。在分析蔬菜樣品中的農藥殘留時，色素是最常見的雜質，通過外觀鑒別不同凈化劑對色素的凈化效果 (圖2C) 發現，使用MWCNTs 處理后的樣本顏色最淺，色素凈化效果最好。在此基礎上進一步考察其用量對凈化效果的影響發現，當MWCNTs 添加量分別為2.5、5、7.5 和15 mg 時，氟吡菌胺、2,6-二氯苯甲酰胺和霜霉威的回收率在86%～103%之間，相對標準偏差 (RSD) 在1%～8%之間 (圖2B)，均符合農藥殘留分析的要求[14]。但當其用量增加到7.5 mg 后，凈化后樣品的外觀不再發生明顯變化 (圖2D)。綜合考慮，最終選用7.5 mg MWCNTs 為主要吸附材料以及200 mg 無水硫酸鎂作為分散固相萃取凈化材料。

2.2 方法驗證結果

在0.005～1 mg/L 范圍內，霜霉威、氟吡菌胺和2,6-二氯苯甲酰胺的質量濃度與對應的響應值間呈良好線性關系，R2在0.999～1.000 之間 (表2)，其基質效應分別為4.3%、21%和64%，需要采用基質匹配標準溶液進行校正定量分析。

通過添加回收試驗結果顯示 (表2)，氟吡菌胺、2,6-二氯苯甲酰胺、霜霉威在葉用萵苣中的平均回收率在85%～106%之間，RSD 在1%～18%之間，均符合中國和歐盟殘留分析試驗準則[14-15]要求。

表2 霜霉威、氟吡菌胺和2,6-二氯苯甲酰胺在葉用萵苣中的添加回收率及相對標準偏差Table2 The recoveries and RSDs of propamocarb, fluopicolide and 2,6-dichlorobenzamide in leaf lettuce

2.3 殘留消解動態和最終殘留量測定結果

2.3.1 殘留消解動態 結果 (表3) 顯示，隨著施藥后時間增加，葉用萵苣中目標化合物的殘留量呈明顯下降趨勢，符合一級反應動力學方程[18]。其中，2,6-二氯苯甲酰胺的殘留量低于定量限(0.02 mg/kg)，與前人在黃瓜上的研究結果一致[8]。于末次施藥后10 d，氟吡菌胺和霜霉威消解率分別為81%～84%和73%～78%。氟吡菌胺在葉用萵苣中的半衰期為3.9～4.2 d，與前人在番茄 (2～4 d)[3]和黃瓜 (2～3.3 d)[8]上的研究結果類似；本研究中霜霉威的半衰期為4.8～4.9 d，與其在番茄、馬鈴薯、黃瓜、人參和煙草上的半衰期 (1.29～11.46 d)[2-3,10,12-13,19]差別較大，可能與試驗時的氣候、作物等因素有關。

表3 霜霉威、氟吡菌胺在葉用萵苣中的消解動態Table3 Dissipation dynamic of propamocarb, fluopicolide in leaf lettuce

2.3.2 最終殘留量 由表4 可知：當采收間隔期為5 d 時，葉用萵苣上氟吡菌胺和霜霉威的殘留量分別為4.88～8.51 和13.6～33.1 mg/kg。而2,6-二氯苯甲酰胺在葉用萵苣中的殘留量均低于定量限(0.02 mg/kg)。中國國家標準中規定氟吡菌胺在葉菜類蔬菜上的最大殘留限量 (MRL) 為30 mg/kg，但尚未制定霜霉威在葉用萵苣或相關葉菜上的MRL 值。CAC 規定葉用萵苣上霜霉威的MRL 值為100 mg/kg。參照以上數據，結合葉用萵苣的生長特點和消費習慣，推薦687.5 g/L 氟菌 · 霜霉威懸浮劑在葉用萵苣上的采收間隔期為5 d。

表4 霜霉威、氟吡菌胺和2,6-二氯苯甲酰胺在葉用萵苣中的最終殘留量Table4 Terminal residue of propamocarb, fluopicolide and 2,6-dichlorobenzamide in leaf lettuce

3 結論

建立了采用QuEChERS-高效液相色譜-串聯質譜同時測定葉用萵苣中氟吡菌胺、2,6-二氯苯甲酰胺和霜霉威殘留量的分析方法，比較了不同酸堿度提取體系對氟吡菌胺、2,6-二氯苯甲酰胺和霜霉威提取回收率的影響，考察了分散固相萃取吸附劑種類 (C18、PSA、GCB 和MWCNTs) 及其用量對凈化效果的影響，優化了前處理提取和凈化的過程。該方法簡單、高效、準確。通過以多壁碳納米管為吸附材料的分散固相萃取，有效地實現了樣品凈化，通過基質匹配標準溶液外標法定量，方法驗證結果符合中國《農作物中殘留試驗準則》要求。運用所建立的方法檢測上海地區溫室條件下葉用萵苣中氟吡菌胺、2,6-二氯苯甲酰胺和霜霉威的殘留量。結果表明，氟吡菌胺和霜霉威在葉用萵苣中的消解趨勢符合一級反應動力學方程，半衰期分別為3.9～4.2 和4.8～4.9 d。當樣品采收間隔期為5 d 時，葉用萵苣中氟吡菌胺和霜霉威的殘留量分別為4.88～8.51 和13.6～31.1 mg/kg。其中氟吡菌胺的最終殘留量低于中國制定的其在葉菜類上的MRL 值 (30 mg/kg)；霜霉威在葉用萵苣的最終殘留量低于CAC 制定的其在葉菜類上的MRL 值 (100 mg/kg)，而2,6-二氯苯甲酰胺在葉用萵苣中的的殘留量均低于定量限 (0.02 mg/kg)。