miR-424-5p在結直腸癌中的表達及其對預后的價值

黃志勇 林智遠 陳淑賢

結直腸癌是常見的消化道腫瘤之一，全球每年約有50 多萬人死于此病[1]，僅次于乳腺癌、前列腺癌和肺癌[2]。腫瘤患者通常確診時平均年齡69 歲，其中大于65 歲占60%，大于75 歲占36%[3]。結直腸癌的發展與飲食習慣和生活方式有關。在這些危險因素中，肥胖[4]、吸煙[5]、酗酒以及高脂肪和低膳食纖維的食物[6]起主導作用。結直腸癌早期臨床癥狀很不明顯，因此患者被確診時一般都處于腫瘤中晚期，已錯過最佳治療期[7]。用于檢測的腫瘤標志物，也稱為生物標志物，是由癌細胞或身體其他細胞產生的物質對癌癥的反應。癌胚抗原（CEA）是結直腸癌最常用的腫瘤標志物，其次是CA125、CA19-9[8]，但CEA、CA125、CA19-9 敏感性均較低，無法早期診斷結直腸癌[9，10]。目前，尚無有效的早期生物標志物用于診斷結直腸癌，因此我們需要尋找結直腸癌早期診斷的生物標志物，以期達到早期診斷。

miRNA 是小的非編碼RNA 序列，通過與mRNA結合而誘導基因降解或翻譯受阻，從而抑制基因表達，在很多腫瘤的發生發展中發揮作用[11]。miRNA作為臨床生物標志物的潛在用途成為近年來的研究熱點，其穩定性高和相對容易的檢測使其成為快速、無創診斷的理想指標[12]。miRNA 微陣列可以同時識別同一樣本中幾百個基因的表達，為檢測miRNA 的表達提供了一種穩健的方法[13]。這些高通量陣列的廣泛和全面使用使miRNA 表達的量化和其在物種內和物種間的鑒定成為可能[14]。目前有很多研究已經指出多種miRNA 對腫瘤的診斷和預后具有較高價值，例如計算Delta 循環閾值法比較Ct miR-503 與Ct miR-511 之間的差異，對腎上腺皮質癌與良性腺瘤的診斷具有高度的敏感性和特異性[15]；miR-451 表達下調與胃癌預后不良相關[16]；慢性淋巴細胞性白血病中miR-34a 低表達，可以作為其預后不良的標志[17]等。miRNA 在結直腸癌的診斷中也發揮了重要作用，結直腸癌患者血清外泌體中的某些特定的miRNA（miR-638、miR-5787、miR-8075、miR-6869-5p 和miR-548c-5p）可以作為結直腸癌的生物標志物[18]。研究顯示，miR-424-5p 在結直腸癌組織和正常組織中也存在顯著差異，且可以通過靶向CCNE1 抑制結直腸癌細胞的惡性發展[19]。

本研究通過檢測并比較89 例結直腸癌患者的結直腸癌組織及配對的癌旁正常組織中miR-424-5p 的表達水平，繪制ROC 曲線研究其在結直腸癌中的診斷意義。同時對這89 例患者隨訪，探究miR-424-5p 表達對結直腸癌的預后價值。

1 材料與方法

1.1 一般資料本研究選擇2016年7月～2019年3月我院收治的89 例結直腸癌患者，均通過病理確診為結直腸癌。其中男45 例，平均年齡（63.4±9.2）歲，女44 例，平均年齡（60.3±12.7）歲。患者術前均未接受任何放化療或免疫治療，臨床病理資料完整，患者及其家屬知情且簽署知情同意書。在手術期間獲得患者結直腸癌組織樣本及配對癌旁正常組織樣本（距離腫瘤組織2cm），樣本切除后均于液氮中快速冷凍。樣本的腫瘤組織學均經過資深病理醫生認證，樣本獲取過程符合我院倫理委員會的要求。

1.2 檢測方法通過實時定量熒光PCR（qRT-PCR）對患者的結直腸癌組織和癌旁正常組織中的miR-424-5p 的表達水平進行檢測。使用mirVana 試劑盒（Life Technologies）操作說明分離miRNA。然后使用Superscript Ⅱ試劑盒（Invitrogen）將總RNA 反轉錄。根據SYBR Premix Ex Taq 試劑盒（TaKaRa，Dalian，China）說明操作，在Applied Biosystems 7500 序列檢測系統（Applied Biosystem）上進行qRT-PCR，反應程序設置為：95℃ 30s（變性）；95℃ 5s（復性），60℃ 34s（延伸），40 個循環，每個反應樣本設置3個復孔。引物設計：has-miR-424-5p：正向特異性引物：5'-CAGCAGCAATTCATGT-3'，反向特異性引物：5'-TGGTGTCGGAGTCG-3'；U6 內參基因：正向特異性引物：5'-CTCGCTTCGGCACGACA-3'，反向特異性引物：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。用2-ΔΔCt值計算miR-424-5p 的表達水平。

1.3 統計學方法統計過程在GraphPad Prism 軟件（8.0 版，GraphPad software, Inc.， La Jolla, CA，USA）和SPSS 軟件（26.0 版，SPSS Inc.， Chicago，IL）進行。采用Kaplan-Meier 曲線分析結直腸癌患者的總生存期。利用ROC 曲線檢測miR-424-5p 在結直腸癌中的診斷能力。通過SPSS 26.0 繪制ROC 曲線，使用秩和檢驗計算曲線下面積（AUC）。面積越大，判斷值越高。

1.4 隨訪89 例患者均至少隨訪1 次。總生存期（OS）是指從手術后第1 天到死亡或最后一次隨訪的持續時間，無進展生存期（DFS）是指患者從手術第1 天開始到復發轉移前的生存時間。隨訪期從患者接受治療的第1 天開始，截至2019年11月31日，89 例患者隨訪8～30 個月，中位數為11.7 個月。整個過程中無失訪，隨訪率為100%。

2 結果

2.1 miR-424-5p 在結直腸癌組織中的表達情況結直腸癌組織中的miR-424-5p 表達水平為0.899±0.197，顯著低于正常組織的1.296±0.241，根據結直腸癌組織和正常組織中的miR-424-5p 表達量差異繪制ROC 曲線（見圖1）。可知曲線下面積（AUC）：0.899，特異性：89.9%，靈敏度：76.4%，約登指數：66.3%，cut-off 值：1.0915。提示miR-424-5p在結直腸癌中具有較高的診斷價值，且具有很好的靈敏度和特異性。

2.2 miR-424-5p 低表達與結直腸癌患者預后的關系生存分析顯示，在結直腸癌中，miR-424-5p 低表達結直腸患者的總生存期明顯比高表達的短,低表達的miR-424-5p 提示了結直腸癌患者較低的總生存率（見圖2A）。DFS 曲線顯示miR-424-5p高表達的結直腸癌患者的無進展生存期明顯長于miR-424-5p 低表達。提示miR-424-5p 低表達代表了較短的無進展生存期（見圖2B）。miR-424-5p在結直腸癌患者總生存率中的預后價值ROC 曲線顯示AUC：0.703，cut-off 值：1.1875，靈敏度68.9%，特異性77.3%（見圖2C）；miR-424-5p 在結直腸癌患者無進展生存期中的預后價值ROC 曲線顯示AUC：0.716，cut-off 值：1.0125，靈敏度67.1%，特異性68.4%（見圖2D）。提示miR-424-5p 低表達與結直腸癌患者預后不良相關，AUC 值提示miR-424-5p 表達在結直腸癌中具有較好的預后價值，但靈敏度和特異性相對不高。

圖1 miR-424-5p 在正常組織和結直腸癌中表達水平及診斷價值

圖2 miR-424-5p 總生存率和無進展生存期及對應的預后價值

3 討論

2010年歐洲已經發現結直腸癌是第三常見的惡性腫瘤[20]。盡管與某些腫瘤相比，結直腸癌的死亡率較低，但是結直腸癌的臨床管理常因多種相關合并癥而變得復雜，進而對健康經濟產生負面影響[21]。而且我們了解到，結直腸癌治療的主要問題包括術后腫瘤的高復發率以及在隨訪期間頻繁的侵入性診斷檢測。因為結腸鏡檢查的高成本和其不便利使得患者依從性很低[22]，所以發現更優異更容易接受的診斷手段和診斷標志物成為結直腸癌治療過程中亟需解決的問題。

研究顯示miRNA 可從不同的生物樣品中提取（不局限于組織），包括血清、唾液[23]、糞便[24]。有研究發現miRNA 在腫瘤早期就具有高特異性和靈敏度[25]。本實驗選擇miRNA 作為結直腸癌診斷及預后標志物進行實驗。有研究表明，miR-424-5p 在結直腸癌組織和正常組織中表達水平存在顯著差異[19]。我們的檢測結果則證實，根據組織中miR-424-5p 的表達水平差異，可以將其作為結直腸癌的診斷標志物。ROC 分析結果顯示，miR-424-5p 低表達對結直腸癌具有較高的診斷價值，其靈敏度和特異性也較高；生存分析結果顯示，miR-424-5p 低表達時結直腸癌患者的總生存期和無進展生存期均更短，ROC 分析結果同樣提示miR-424-5p 低表達與結直腸癌患者預后不良相關。

本研究檢測組織中miRNA 的表達水平發現其可以作為結直腸癌診斷和預后的標志物。今后還需進一步大樣本研究，以進一步證實以上結論。