右美托咪定通過α2AR介導的ERK1/2減輕急性肺損傷大鼠肺水腫*

夏明珠， 王 琦， 黃 志， 樂 琴， 姜遠旭△

[1深圳市羅湖醫院集團羅湖區人民醫院，2深圳市人民醫院（南方科技大學第一附屬醫院，暨南大學第二臨床醫學院）麻醉科，3深圳市麻醉醫學工程技術中心，廣東深圳518020]

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是急性呼吸窘 迫 綜 合 征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）的早期形式，肺水腫是ALI 最重要的特征[1]。肺水腫導致的頑固性低氧血癥，常危及患者生命。盡管過去對ALI 的治療作了多種探索，但只有小潮氣量肺保護性通氣及俯臥位通氣收到了比較明確的效果[2]，藥物治療尚未取得突破。因ALI發病機制復雜，雖然在某些方面取得了進展，但ALI 臨床死亡率仍然高達30%～40%[2]，給家庭社會帶來了沉重負擔。因此，尋求有效減輕肺水腫的治療藥物尤為重要。

右美托咪定（dexmedetomidine，Dex）是一種高選擇 性α2腎 上腺素 能受體（α2adrenergic receptors，α2AR）激動劑，具有良好的鎮靜作用[3]。近年的研究發現，Dex 可抑制腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）等炎癥細胞因子而發揮抗炎作用[4-6]，且能減輕不同致病因素所致的ALI 肺水腫[7-8]。在前期研究中，我們發現Dex 減輕肺水腫的作用與上調水通道蛋白（aquaporin，AQP）有關[9]。研究表明，肺泡內水的清除不但與AQP 有關、更與肺泡上皮細胞鈉離子轉運有關[10]，其中鈉鉀ATP 酶（Na+/K+-ATPase）在鈉離子轉運及肺泡液體轉運中扮演重要角色[11-12]。那么，Dex 減輕肺水腫的作用是否與Na+/K+-ATPase 的表達有關，其機制又如何，尚不清楚。因此，本研究致力于觀察Dex 是否通過上調Na+/K+-ATPase 表達而減輕脂多糖誘導的ALI 相關肺水腫，同時進一步探究其機制。

材料和方法

1 材料

1.1 實驗動物 SPF 級Wistar 大鼠24 只，4～6 周齡，體重180～220 g，購于廣東省醫學實驗動物中心，許可證號為SCXK（粵）2019-0035。所有大鼠均在恒溫（25℃），恒濕（50%）條件下飼養，實驗前均經歷至少1個晝夜循環，且禁食12 h，自由飲水。

1.2 藥物和試劑 細菌脂多糖（lipopolysaccharide，LPS；Escherichia coli055：B5）購自Sigma；右美托咪定（江蘇恒瑞醫藥公司）；測定TNF-α、IL-β、IL-6 和IL-10 的ELISA 試劑盒以及測定丙二醛（malonaldehyde，MDA）的和髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）的試劑盒（上海江萊生物科技有限公司）；抗α1Na+/K+-ATPase、β1Na+/K+-ATPase 和細胞外信號調節激 酶1/2（extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK1/2）抗體（Abcam）；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG Ⅱ抗（CST）；抗β-actin抗體（Santa Cruz）。

2 方法

2.1 模型建立和分組 24 只大鼠隨機分為生理鹽水（normal saline，NS）對照組、急性肺損傷模型組（LPS 組）、右美托咪定治療組（LPS+Dex 組）和α2AR抑制劑育亨賓（yohimbine，YHB）和右美托咪定合用治療組（LPS+Dex+YHB 組）。LPS組大鼠經腹腔注射LPS（20 mg/kg）誘導ALI模型；LPS+Dex組大鼠于LPS注射后即刻腹腔注射Dex 100 μg/kg 進行干預；LPS+Dex+YHB 組大鼠腹腔注射0.1 mg/kg YHB，30 min后注射LPS 和Dex；以腹腔注射NS 作為對照。干預完成后8 h，腹腔注射3%戊巴比妥鈉50 mg/kg 麻醉大鼠，頸動脈放血處死動物。

2.2 肺組織病理學檢查 取部分肺組織用10%中性甲醛固定，石蠟包埋及切片，HE 染色。采用半定量評分系統評價肺損傷，包括肺泡充血、肺泡出血、中性粒細胞浸潤和肺泡壁厚度。評分標準如下：0分為無損傷，1 分為輕度損傷（25%），2 分為中度損傷（50%），3 分為重度損傷（75%），4 分為極重度損傷（100%）。各項評定分數相加為肺損傷總評分。

2.3 動脈血氧分壓（PaO2）及氧合指數（PaO2/FiO2）的檢測 大鼠處死前，用肝素注射器經頸動脈抽取動脈血0.5 mL 進行血氣分析，測PaO2，依據吸入氧濃度計算PaO2/FiO2。

2.4 肺指數及肺組織濕/干重比（W/D）的測定 大鼠處死后，立即剖胸，取出全肺，稱重。以全肺濕重除以體重得出的數值為肺指數。取出右肺上葉，精確稱重后（濕重），置75 ℃恒溫烤箱中，烘烤24 h 至恒重后稱重（干重），計算W/D 值。

2.5 支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）的獲取及其中TNF-α、IL-β、IL-6 和IL-10 濃度的檢測 大鼠處死后，立即剖胸，暴露心肺，分離左右主支氣管，結扎右支氣管。自制導管插入主支氣管。然后，將2 mL 冷磷酸鹽緩沖生理鹽水注入左肺，并來回抽取3 次。收取支氣管肺泡灌洗液，采用ELISA 法測定TNF-α、IL-β、IL-6 和IL-10 濃度，嚴格按照說明書操作。

2.6 肺組織中MDA 濃度及MPO 活性的檢測 取肺組織100 mg解凍，制備肺組織勻漿用于測定MDA 濃度和MPO活性，嚴格按說明書操作。

2.7 Western blot 檢測肺組織α1Na+/K+-ATPase、β1Na+/K+-ATPase 和p-ERK1/2 的蛋白水平 分別取適量的肺組織，加入蛋白裂解液冰上勻漿，離心收取上清液，提取總蛋白并定量。應用10% SDS-PAGE 分離后，電轉移至PVDF 膜上。脫脂奶粉溶液封閉1.5 h；洗 膜 后 加 入 抗α1Na+/K+-ATPase、β1Na+/K+-ATPase、p-ERK1/2 和β-actin 抗體，4℃孵育過夜；洗膜后加入Ⅱ抗，室溫下孵育2 h，洗膜后加入化學發光增強劑，自顯影。采用圖像分析處理系統對蛋白條帶掃描分析，測得的目的蛋白吸光度值與β-actin吸光度值的比值表示各蛋白的相對表達量。

3 統計學處理

計量資料以均數±標準差（mean±SD）表示。采用SPSS 13.0 統計軟件行單因素方差分析（one-way AONVA）和SNK-q檢驗，ALI 評分采用Kruskal-Wallis檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

1 肺組織病理學檢查

肺組織HE 染色顯示，NS 對照組肺組織結構基本正常；LPS 組肺組織間隔增厚，肺血管充血，有大量炎癥細胞浸潤；Dex 治療組肺組織病理變化減輕，見圖1A。肺損傷分數比較顯示，與NS 組相比，LPS組肺損傷分數升高（P＜0.01）；Dex 治療組肺損傷分數低于LPS 組（P＜0.01），而α2AR 抑制劑育亨賓部分逆轉了Dex 的作用，肺損傷分數升高（P＜0.01），見圖1B。

2 各組大鼠PaO2及PaO2/FiO2的變化

與NS對照組相比，LPS組PaO2及PaO2/FiO2降低（P＜0.01）；Dex 治療組PaO2及PaO2/FiO2高于LPS 組（P＜0.01），而α2AR 抑制劑育亨賓部分逆轉了Dex 的作用（P＜0.05），見圖2。

3 各組大鼠肺指數和W/D的變化

與NS 對照組相比，LPS 組肺指數和W/D 增加（P＜0.01）；Dex 治療組肺指數和W/D 低于LPS 組（P＜0.01），而α2AR 抑制劑育亨賓部分逆轉了Dex 的作用（P＜0.01），見圖3。

4 各組大鼠支氣管肺泡灌洗液中TNF-α、IL-β、IL-6和IL-10濃度的變化

與NS 對照組相比，LPS 組TNF-α、IL-β 和IL-6 及IL-10 濃度升高（P＜0.01）；與LPS 組比較，Dex 治療組TNF-α、IL-β 和IL-6 濃度降低，IL-10 濃度進一步升高（P＜0.01），而α2AR 抑制劑育亨賓部分逆轉了Dex 的作用（P＜0.01），見圖4。

5 肺組織MDA濃度及MPO活性的變化

與NS 對照組相比，LPS 組MDA 的濃度及MPO的活性升高（P＜0.01）；與LPS 組比較，Dex 治療組MDA 的濃度及MPO 的活性降低（P＜0.01），而α2AR抑制劑育亨賓部分逆轉了Dex 的作用（P＜0.05），見圖5。

6 各組大鼠α1 Na+/K+-ATPase和β1 Na+/K+-ATPase蛋白水平的變化

與NS 對照組相比，LPS 組α1Na+/K+-ATPase 和β1Na+/K+-ATPase 的蛋白水平降低（P＜0.01）；與LPS 組比較，Dex 治療組的α1Na+/K+-ATPase、β1Na+/K+-ATPase 蛋白水平升高（P＜0.01），而α2AR 抑制劑育亨賓部分逆轉了Dex的作用（P＜0.01）），見圖6。

7 各組大鼠p-ERK1/2蛋白水平的變化

與NS 對照組相比，LPS 組p-ERK1/2 的蛋白水平降低（P＜0.01）；與LPS組比較，Dex治療組p-ERK1/2的蛋白水平升高（P＜0.01），而α2AR 抑制劑育亨賓部分逆轉了Dex的作用（P＜0.01），見圖7。

討論

LPS是革蘭氏陰性桿菌細胞壁的主要成分，常用來誘導ALI 模型[13]。我們的研究結果清楚地表明，LPS 導致ALI 大鼠肺指數和W/D 比值明顯升高，而Dex 降低了肺指數和W/D 比值，說明Dex 減輕了LPS誘導的ALI 大鼠肺水腫。此外，肺組織病理學的檢查發現，在ALI 模型組，肺泡間隔增厚，肺泡充血，炎癥細胞浸潤，而Dex治療則明顯改善了LPS導致的肺組織病理學改變。與這些研究結果一致，LPS 導致PaO2和PaO2/FiO2顯著降低，給予Dex 治療后，PaO2和PaO2/FiO2上升，表明肺水腫的消除可有效改善氧合功能，從而有利于ALI患者的轉歸。

Figure 1. Pathological changes and injury scores of lung tissues（HE staining，×200）. Mean±SD. n=6. **P＜0.01 vs NS group；##P＜0.01 vs LPS group；&&P＜0.01 vs LPS+Dex group圖1 HE染色觀察右美托咪定對各組大鼠肺組織病理學改變及肺損傷分數的影響

Figure 2. Effects of Dex on PaO2 and PaO2/FiO2 in rats with LPS-induced ALI. Mean±SD. n=6. **P＜0.01 vs NS group；##P＜0.01 vs LPS group；&P＜0.05 vs LPS+Dex group.圖2 右美托咪定對各組大鼠PaO2及PaO2/FiO2的影響

肺水腫的消除不僅依賴于肺泡內液生成的減少，更依賴于肺泡內液體的清除。研究發現，Na+/K+-ATPase在肺泡上皮細胞膜上表達增加或其活性增強能夠促進肺泡液體清除[14]。相反，Na+/K+-ATPase 在肺泡上皮細胞膜上低表達或活性被抑制則導致肺泡內液體清除降低[15-17]。近年來的研究表明：不同致病因素導致的ALI 肺組織Na+/K+-ATPase 表達降低，肺泡內液體清除也降低[18-20]，提示維持肺泡上皮細胞Na+/K+-ATPase 正常表達，有利于促進肺泡內液體清除及減輕肺水腫。在本研究中，我們觀察到LPS 可導致肺組織α1Na+/K+-ATPase 和β1Na+/K+-ATPase 的表達降低，Dex 治療明顯上調α1Na+/K+-ATPase 和β1Na+/K+-ATPase 的表達。這些結果提示，Dex 減輕肺水腫的作用與促進Na+/K+-ATPase的表達有關。

Figure 3. Effects of Dex on W/D ratio（A）and lung index（B）in the rats with LPS-induced ALI. Mean±SD. n=6. **P＜0.01 vs NS group；##P＜0.01 vs LPS group；&&P＜0.01 vs LPS+Dex group.圖3 右美托咪定對各組大鼠W/D和肺指數的影響

Figure 4. Effects of Dex on TNF-α（A），IL-β（B），IL-6（C）and IL-10（D）in BALF in rats with LPS-induced ALI. Mean±SD. n=6. **P＜0.01 vs NS group；##P＜0.01 vs LPS group；&&P＜0.01 vs LPS+Dex group.圖4 右美托咪定對各組大鼠肺泡灌洗液中TNF-α、IL-β、IL-6和IL-10濃度的影響

Figure 5. Effects of Dex on MPO activity（A）and MDA level（B）in the rats with LPS-induced ALI. Mean±SD. n=6. **P＜0.01 vs NS group；##P＜0.01 vs LPS group；&P＜0.05，&&P＜0.01 vs LPS+Dex group.圖5 右美托咪定對各組大鼠肺組織MPO活性和MDA水平的影響

Figure 6. Effects of Dex on expression of Na+/K+-ATPase in the rats with LPS-induced ALI. Mean±SD. n=3. **P＜0.01 vs NS group；##P＜0.01 vs LPS group；&&P＜0.01 vs LPS+Dex group.圖6 Western blot觀察右美托咪定對各組大鼠Na+/K+-ATPase表達的影響

Figure 7. Effects of Dex on protein level of p-ERK1/2 in rats with LPS-induced ALI. Mean±SD. n=3. **P＜0.01 vs NS group；##P＜0.01 vs LPS group；&&P＜0.01 vs LPS+Dex group.圖7 Western blot觀察右美托咪定對各組大鼠p-ERK1/2蛋白水平的影響

LPS 能夠激活中性粒細胞和肺泡巨噬細胞等炎癥細胞，釋放TNF-α、IL-1β 和IL-6 等大量炎性細胞因子，而IL-10 等抑制性炎癥細胞因子分泌不足，最終導致全身瀑布樣炎癥反應，而肺部最先受到打擊。以往，我們過多關注炎癥反應對毛細血管內皮細胞損傷的影響，而對肺泡上皮細胞的影響重視不夠。最近研究發現：TNF-α、IL-1β和IL-6等炎癥細胞因子能夠抑制肺泡上皮細胞Na+/K+-ATPase 的表達[21-23]。與這些研究結果一致，我們的研究顯示，LPS 導致肺組織大量中性粒細胞浸潤，且BALF中促炎癥細胞因子TNF-α、IL-1β 和IL-6 明顯增加，雖然抑制性炎癥細胞因子IL-10 分泌增加，但不足以抵抗促炎反應，而Dex 減少了BALF 中TNF-α、IL-1β 和IL-6 的濃度，同時增加了IL-10 的濃度。以上研究結果提示，在LPS 誘導的ALI 模型中，Dex 上調Na+/K+-ATPase 表達可能與抑制炎癥反應相關。

近年來，國內外對引起Na+/K+-ATPase 表達和活性變化的相關信號通路進行了相關研究。ERK1/2是絲裂原激活的蛋白激酶信號家族中的重要成員，調節細胞的增殖和分化，并與某些基因的轉錄與表達密切相關。以往的研究表明，ERK1/2 在調控Na+/K+-ATPase 中扮演重要的角色[24]，研究發現：甲狀腺激素通過激活ERK1/2 增加鼠肺泡上皮細胞Na+/K+-ATPase 的活性[25-26]，多巴胺通過激活ERK1/2 提高肺泡上皮細胞Na+/K+-ATPase的活性[27]。在人骨骼肌細胞上，Na+/K+-ATPase 的活性也依賴于ERK1/2 的激活[28]。我們的研究發現，LPS 抑制p-ERK1/2 的水平，而Dex 治療極大的增加了p-ERK1/2 的蛋白水平，以上這些研究結果提示在LPS誘導的ALI大鼠模型中，Dex 上調Na+/K+-ATPase 表達可能與ERK1/2 的激活有關。近年來的研究發現，Dex 可激活ERK1/2 減輕腦缺血再灌注損傷及心臟缺血再灌注損傷，而給予α2AR 抑制劑后會消除Dex 的保護作用[29-30]，提示Dex可能通過α2AR 介導ERK1/2 的激活而發揮器官保護作用。我們的研究也得出了類似的結果，在Dex 和α2AR 抑制劑育亨賓同時干預后，Dex 單獨干預時其抑制肺部炎癥反應，上調Na+/K+-ATPase 表達及減輕肺水腫的作用被部分逆轉。

綜上所述，Dex 可通過上調Na+/K+-ATPase 的表達減輕LPS誘導的ALI相關肺水腫，其機制可能與大鼠α2AR介導的ERK1/2激活有關。