宏基因組測序技術在兒童急性淋巴細胞白血病化療后感染病原體檢測中的應用

黎巧茹 李麗羽 賴文英 林春燕 朱藹欣 陳瓊 黃春輝

中山市人民醫院普通兒科 528400

白血病是臨床上常見造血系統惡性腫瘤，該病主要是由于白血病細胞在造血干細胞中異常增生，嚴重影響造血系統的正常運行，最終導致機體各組織和器官損傷［1］。兒童急性淋巴細胞白血病（ALL）是兒童白血病的主要類型，化療是治療該病的主要手段，但化療藥物對腫瘤細胞及人體內的正常細胞均有殺傷作用，導致體內白細胞急劇下降，易發感染，臨床主要采用廣譜抗生素來預防和治療感染［2］。為了提高療效，為骨髓移植爭取時間，降低感染相關的病死率，及時有效地檢測病原體極為重要。培養法是病原體檢測的金標準，但分離培養周期長。隨著高通量測序技術的發展，宏基因組測序技術逐漸用于病原體檢測［3］。目前，國內主要采取的宏基因組測序技術二代測序對感染性病原體進行篩查。本文評價宏基因組測序技術檢測ALL患者化療后感染病原體的效果，結果如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取本院2018 年4 月至2019 年12 月間收治的120 例急性淋巴細胞白血病化療后進入骨髓抑制期發熱的患兒作為研究對象，男58 例，女62 例，年齡（5.2±1.4）歲（6 個月～13 歲）。本研究經本院醫學倫理委員會批準。納入標準：經GD-2008 ALL 診斷標準確診為急性淋巴細胞白血病；經過常規化療藥物治療；化療后進入骨髓抑制期，有發熱癥狀；患兒家屬知情同意，并簽署知情同意書。排除標準：合并心肺腎等功能障礙性疾病者；無法配合研究者；合并精神功能障礙者。

1.2 方法 所有患兒取肘靜脈血，抽取10 ml 外周血，置于離心管中，3 000 r/min 離心10 min，取上清液置于無菌試管中，采用宏基因測序檢測和培養法檢測感染病原體。宏基因測序檢測方法［4］：（1）核酸提取：取2 ml上清液，-80℃冷藏經武漢康圣達醫學檢驗公司（武漢康圣達醫學檢驗公司）提取核酸。（2）16SrDNA擴增：上游引物2 μl，Master 25 μl，DNA 模板2 μl，ddH2O 補至50 μl，進行預變性-變性-退火-延伸（30個循環）及電泳純化。

另取上述2 ml上清液進行血培養檢測［5］：將上清液置于全自動血培養儀孵育檢測，儀器判讀結果采用革蘭氏染色法，紫色為革蘭陽性菌，紅色為革蘭陰性菌，必要時將菌種接種在固體培養基上根據菌落的形態借助顯微鏡進行判斷。

1.3 統計學方法 采用SPSS17.0統計分析軟件對研究數據進行統計分析，計數資料以［n（%）］表示，再行χ2檢驗；計量資料比較使用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 宏基因組測序技術對病原體的檢出率 培養法60例檢出病原體，檢出率50.0%，宏基因組測序技術76例檢出病原體，檢出率63.3%，宏基因組測序技術對病原體的檢出率高于培養法，差異具有統計學意義（P＜0.05）。兩種方法對細菌、真菌的檢出率差異均無統計學意義（均P＞0.05），但宏基因組測序技術對病毒的檢出率高于培養法，差異具有統計學意義（P＜0.05），見表1。

2.2 宏基因組測序技術檢出病原體分布情況 培養法和宏基因組測序技術檢出的病原體類型完全一致，但檢出的病原體分布存在差異，宏基因組測序技術測得病原體分布高于培養法，但差異無統計學意義（P＞0.05），具體見表2。

表1 不同檢測方法病原體檢出情況比較[n（%）]

表2 不同檢測方法檢測出病原體分類情況（n）

3 討 論

臨床上急性淋巴細胞白血病患兒化療后常發生感染，據報道急性白血病醫院感染發生率為38%～80%，因感染死亡的概率達到4%，患兒的體液免疫及細胞免疫均受損［6-7］。所以誘導階段感染率最高，嚴重威脅患兒的生命安全和生活質量，因此減少與感染有關的病死率對改善白血病預后水平有至關重要的作用［8］。而明確病原體感染類型，根據不同的感染病原菌選擇合理的抗感染方案，縮短抗感染的療程是提升臨床療效的有效手段，分離培養、免疫學抗原抗體反應等是目前臨床上較為常用的檢查病原菌的方法［3］。但這些方法存在陽性率低、周期長、對操作人員的技術水平要求比較高等缺陷，不被臨床所推廣，加之近年來隨著病原體的變異、進化，抗生素的濫用等原因［9］，許多新型細菌和疑難感染病例不斷增多，傳統的檢測方法已經無法滿足目前的臨床需要，因此高效的病原體檢測方法對預防和治療兒童急性淋巴白血病化療后感染非常重要［10］。

近年來隨著醫學技術的不斷發展，宏基因組測序技術越來越多的應用于醫學研究和臨床診斷中［11］，隨著高通量測序技術的發展，眾多感染性疾病的病原譜逐漸被公布，人們對病原體有了更多的認知［12］。本研究中宏基因組測序技術對病原體的檢出率高于培養法（P＜0.05），其中對病毒的檢出率顯著高于培養法（P＜0.05），對細菌和真菌的檢出率與培養法比較無統計學差異（P＞0.05），可見宏基因測序技術在檢測出病原體的種類及數目方面均占顯著優勢，尤其是在病毒方面。Munang"andu HM 等［13］通過宏基因測序技術檢測出204 例成年急性肝衰竭患者血清，出現8 例新病毒，同時鑒定出一些之前未被檢測出的多重感染病例，表明宏基因組二代測序能夠較好地檢出低豐度的多重感染病原體，與本文研究結果相似。分析原因可能是培養法雖是鑒定病原體最直接的方法，但實際上很多細菌是培養不出來的［14］，而宏遠測序是直接對樣本的基因組進行測序，從而能迅速準確地對病原體進行鑒定［15］。Long Y 等［16］對78例ICU患者進行血漿宏基因組測序，并同時送檢外周血培養，結果宏基因組測序方法的病原體檢出率為30.77%，而血培養法僅為12.82%，與本文的研究結果相似。在病原體分型方面，培養法和宏基因組測序技術檢出的病原體類型完全一致，表明不同類型的細菌、病毒和真菌，培養法和宏基因組測序均能有效檢出，但檢出能力不同。本研究中，宏基因組測序技術測得病原體分布高于培養法，但差異無統計學意義（P＞0.05），表明培養法無法檢出的病原體，宏基因組測序技術能夠檢出，具有更高的檢出效率。另外，本研究中，病原體分布統計的病例數高于檢出例數，是因為部分患者合并多種病原體感染所致。

雖然宏基因組測序技術在臨床上得到了廣泛的應用［17］，但因為臨床標本可能因為交叉感染而產生假陽性結果，高通量測序數據庫不完善，數據分析過程復雜等多方面原因［18］，宏基因組測序技術在臨床應用仍要面臨很多問題，相信未來宏基因組測序技術將逐漸克服這些難題，進一步推動感染病學的發展［19］。

綜上所述，相對于傳統的病原學檢測方法，宏基因組測序技術可提高病原菌的檢出率，從而改善患者的預后，值得臨床推廣。

利益沖突：作者已申明文章無相關利益沖突。