MPB64免疫膠體金法在新發肺結核患者中的應用

戴小麗 許燕燕 劉濤 侯彥強

1上海市松江區中心醫院檢驗科 201600；2上海市松江區中心醫院病理科 201600通信作者：許燕燕，Email：274371867@qq.com

肺結核病目前仍然是嚴重危害人類健康的全球性公共衛生問題，尤其新發肺結核患者的診斷和治療方案很大程度上依賴于結核分支桿菌的實驗室檢查。疑似新發肺結核病患者初次痰菌抗酸涂片檢測、培養以及鑒定對結核病的診治有重要的臨床價值。傳統的痰涂片抗酸染色陽性率較低，L-J 固體培養法耗時較長，液體分枝桿菌培養法不能區分結核分枝桿菌與非結核分枝桿菌。三者均不是較為理想的結核分枝桿菌實驗室檢測方法。為了滿足臨床需求，尋找一種適用于基層單位的簡單快速的結核分枝桿菌檢測鑒定方法顯得十分迫切。

結核分枝桿菌培養物濾液蛋白64（MPB64）是對人致病的人結核分枝桿菌、牛結核分枝桿菌和非洲結核分枝桿菌等結核分枝桿菌復合群在菌群培養過程中分泌到菌體外的分子量為24 kDa 的特異性蛋白質，它是在牛結核分枝桿菌弱毒株BCG 中的培養液中首次分離的，而在非結核分枝桿菌復合群（NTM）中不形成MPB64［1］。本次研究利用結核分枝桿菌免疫膠體金法對該菌分泌的MPB64 蛋白進行檢測，探討MPB64免疫膠體金檢測法在肺結核早期診斷中的應用價值。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 標本來源 收集2018年9月至2019年8月本院肺結核門診和住院的經MGIT 960 液體分枝桿菌培養儀培養陽性的疑似新發肺結核患者210 例（所有收集標本均經過患者知情同意），所有培陽標本均經抗酸染色確認為抗酸性菌。其中，男147例，女63例，年齡最大83歲，最小16歲，平均年齡38.45歲。本地人口65例，流動人口145例。肺結核病根據衛生部發布的WS288.2017《肺結核診斷標準》［2］中臨床癥狀、體征以及胸部影像學檢查等確診。

1.1.2 試劑和儀器 抗酸染液購自珠海BASO 生物技術有限公司，結核分枝桿菌抗原檢測試劑盒（膠體金法）由杭州創新生物檢控技術有限公司生產，液體分枝桿菌培養基、培養添加劑以及消化液均為美國BD 公司生產，固體中性羅氏培養基為上海疾控生物科技有限公司生產，以上試劑均由上海市疾病預防控制中心提供。液體分枝桿菌快速全自動培養儀為BD BACTEC MGIT 960，離心機型號為Heal Force Neofuge 1600。

1.2 方法

1.2.1 標本留取 患者留取即時痰、夜間痰和次日晨痰共3 次，涂片染色操作和質控方法參照《結核病診斷實驗室檢驗規程》［3］進行。

1.2.2 標本培養 無菌取痰標本2.0 ml，加入事先準 備 好 的1～2 倍 體 積 的2% NALC-NaOH（N- 乙酰-L-半胱氨酸-NaOH）標本前處理液，強力旋渦振蕩20 s 后室溫靜置15～20 min。然后加入pH 值6.8 磷酸鹽緩沖液（PBS）至50.0 ml，3 000 g 離心15 min 后，再棄上清液，沉淀中加入1.0 ml pH 6.8的PBS制備成懸濁液。處理后取0.5 ml 標本接種至MGIT 960 培養管進行液體培養，接種完成后培養管上機檢測。標本接種前，在MGIT 7.0 ml 培養管中事先加入0.8 ml 以Growth Supplement（生長添加劑）溶解后的PANTA（雜菌抑制劑）。

1.2.3 膠體金法檢測 將液體培陽的標本全部進行涂片抗酸染色鏡檢，取確定為抗酸桿菌的標本0.1 ml 滴加入MPB64 免疫膠體金法檢測板的加樣區，15 min 后觀察檢測板的判定部，只有當檢測線和質控線雙方都確認出現紫紅色條帶方判定結果為陽性。在控制區出現紫紅色條帶，而在檢測區未出現則為陰性結果。如果控制區未出現任何條帶則需重新檢測。

1.2.4 菌種鑒定 取液體培陽并經抗酸染色鏡檢確認為抗酸桿菌的培養液0.1 ml 接種到固體中性羅氏培養基中，210 例標本在固體培養基上均生長良好，待菌落生長占固體培養基斜面面積1/2以上時，將其送至上海市疾病預防控制中心結核病防治科進行PNB 法、TCH 法和28℃培養試驗，并以其鑒定結果作為標準。

1.2.5 質量控制 抗酸染色質控涂片由上海市臨床檢驗中心提供，室內質評為每周進行平行檢測抗酸染色陰陽性質控片，結果均合格。室間質評（EQA）為定期隨機涂片抽樣送至上海市疾病預防控制中心參加盲法復檢評估，各指標均合格。

1.3 統計學方法 采用SPSS 19.0 醫學統計軟件包進行χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。以上海市疾病預防控制中心菌群鑒定結果為標準，計算MPB64 膠體金法敏感性和特異性。敏感性（%）=MPB64 膠體金法檢測出的MTC 感染例數/上海市疾病預防控制中心菌群鑒定的MTC感染例數×100%；特異度（%）=MPB64 膠體金法檢測出的非MTC 感染例數/上海市疾病預防控制中心菌群鑒定的非MTC感染例數×100%。

2 結 果

210例液體培陽的標本經膠體金法檢測后，檢測結果與原患者痰直接涂片抗酸染色法結果對比見表1。涂片法的陽性率為48.57%（102/210），膠體金法的陽性率為90.00%（189/210），膠體金法與涂片法的陽性率差異有統計學意義，膠體金法的敏感性明顯高于涂片法。

表1 膠體金法與痰涂片法比較（n=210）

將210 例液體培陽標本送至上海市疾病預防控制中心進行菌種鑒定，結果見表2。由表2 可見，經鑒定確診為MTC 感染者有187 例，占比89.05%（187/210），非MTC 感染者23 例，占比10.95%（23/210）。膠體金法在初篩結核分枝桿菌復合群中的敏感性為97.86%（183/187），特異性為73.91%（17/23），準確度為95.24%（200/210），陽性預測值為96.83%（183/189），陰性預測值為80.95%（17/21）。

表2 膠體金法與金標準比較（例）

3 討 論

肺結核是由結核分枝桿菌復合群引起的疾病，而非肺結核分枝桿菌病由于其臨床表現與肺結核擁有相似的全身中毒癥狀和局部損害，經常被誤診為結核病而耽誤疾病的診療［4］。肺結核的早發現、早確診成為了當下結核病研究的熱點之一。MPB64是結核分枝桿菌復合群分泌到菌體外的特異性蛋白質。本研究發現，在新發培陽的患者中，MPB64 膠 體 金 法 的 陽 性 率 為90.00%，高 于 張 濤 等［5］的83.25%（169/203），明顯高于痰涂片直接抗酸染色法的48.57%。膠體金法陽性率之所以較高，考慮原因如下：作為結核分枝桿菌復合群分泌的特異性蛋白，MPB64 不論是在液體還是固體培養基中，或是在患者的痰液以及肺排泄物中都有存在的可能，且能指示分枝桿菌的早期生長［6］。本研究中，患者的標本已經經過了MGIT 960 液體分枝桿菌培養儀一定時間的培養，更是增加了MPB64 在液體培養物中的分泌量，從而提高了檢出率。痰直接涂片抗酸染色鏡檢陽性率之所以較低考慮原因如下：陽性率和患者標本的留取質量有關，來自肺深部的干酪樣痰、血痰、黏液痰等合格標本的檢出率較高；每毫升痰標本中需要至少5 000～10 000 個抗酸桿菌才能檢出；抗酸桿菌在患者體內不是連續性排出而是間隔性排出，也成為痰涂片法檢出率不高的原因之一。

雖然膠體金法相較于痰涂片抗酸染色法在診斷肺結核方面陽性率高，但目前關于MPB64 的研究主要集中于其對結核分枝桿菌復合群菌種的鑒定。將液體培陽患者的標本進行膠體金法檢測和上海市疾病預防控制中心菌種鑒定結果比較發現，MPB64 膠體金法在鑒別MTC 方面的敏感度為97.86%（183/187），和張濤等［5］將MGIT 960 液體培養得到的203 例分枝桿菌陽性菌株進行MPB64 抗原檢測，免疫膠體金法97.70%（169/173）的敏感度相似，高于周剛等［7］在162例結核分枝桿菌陽性的臨床標本的檢測中，MPB64抗原檢出率為95.70%的敏感度。但是，本研究中膠體金法的特異度為73.91%（17/23），相較于而張濤等［5］研究中100.00%的特異度偏低。本研究中4例MTC經MPB64膠體金法檢測為陰性的可能原因如下：結核菌中mycobacterium bovis BCG的幾個亞株（copenhagen 株、glaxo株、pasteur株、tice株）不產生MPB64［7］，所以判定為陰性；結核分枝桿菌培養物濾液蛋白64編碼基因發生突變［5］，產生TGA 終止碼，部分C末端區域缺失［8］，故而無法檢測到MPB64；液體培養基出現陽性信號時，分支桿菌分泌的MPB64蛋白釋放量不足［9］，尚未達到膠體金法的檢出線。6 例診斷為非結核分枝桿菌復合群的菌株中膠體金法鑒定為陽性，可能是膠體金法為假陽性，也可能標本中存在微量結核分支桿菌，具體什么原因導致陽性有待進一步探討。總體看來，MPB64 免疫膠體金法鑒定MTC時的準確度為95.24%（200/210）。

綜上所述，在新發肺結核患者的診斷中，MPB64免疫膠體金法有較高的敏感性、特異性和準確度，膠體金法不僅僅可以明顯提高抗酸桿菌的檢出率，而且能夠較為快速地鑒別結核分枝桿菌復合群，可彌補BACTEC MGIT 960 液體培養系統尚不能進行菌種鑒定的不足。MPB64免疫膠體金法已有成品試劑盒，15 min 可出檢測報告，具有操作方便、快速、無須特殊儀器投入等多種優點，在結核分枝桿菌的快速檢測方面擁有較好的應用前景，適合于各基層試驗應用于肺結核病的早期臨床診斷。

利益沖突：作者已申明文章無相關利益沖突。