基于QuEChERS-GC-MS/MS同時測定西紅花中9種有機磷農藥殘留

李福敏，邵 林，楊艷華，吳明江，趙海云，楊麗芬

(1.大理州食品檢驗檢測院，云南 大理 671000；2.昆明學院 化學化工學院，云南 昆明 650214；3.云南警官學院，云南省刑事科學技術重點實驗室，毒品分析及禁毒技術公安部重點實驗室，云南 昆明 650223)

西紅花是一種藥食同源性、傳統的名貴中藥材，具有活血化瘀，涼血解毒、解郁安神之功效，素有“植物黃金”之美譽[1-2].人工種植是其主要來源，為保證西紅花的質量和產量，種植過程中難免的會出現農藥濫用甚至農藥殘留超標的現象，成為西紅花走向世界的瓶頸.為了西紅花產業健康持續發展，建立西紅花中多農藥殘留的快速分析方法顯得尤為重要.

現行《中國藥典》2015版通則2341[3]記載采用氣相色譜串聯質譜法檢測藥材中74種農藥殘留的方法，但檢測的絕大多數農藥為有機氯類和擬除蟲菊酯類，并且分析時間較長，超過 40 min.有學者對近年藥材農藥殘留情況普查發現：花類藥材農藥殘留的檢出率較高、殘留情況較復雜、部分品種屬藥食同源類[4].目前，國內外有關西紅花中有機磷農藥殘留的研究鮮有報道.有機磷農藥殘留檢測以氣相色譜法(gas chromatography, GC)最為常見，但分析復雜樣品時易受雜質和背景噪音的干擾.與GC相比，氣相色譜串聯質譜法(gas chromatography-triple quadrupole tandem mass spectrometric, GC-MS/MS)具有抗干擾能力強、靈敏度高和定量準確等優點，對分析基質復雜的樣品具有一定優勢.

本研究在《中國藥典》2015版通則2341方法的基礎上，優化QuEChERS[5]前處理方法，利用基質匹配標準工作液校準，經GC-MS/MS采取多反應離子監測模式(multiple reaction monitoring, MRM)分析，建立了一種快速、準確、高效檢測西紅花中9種有機磷農藥殘留的方法.

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 7890B-7000C氣相色譜串聯質譜儀，配備7693自動進樣器(美國Agilent公司)；QUINTIX-1CN電子天平(感量 0.1 mg，德國Sartorius公司)；VORTEX 2混勻器(德國IKA公司)；移液器(德國Brand公司)；PURELAB Chorusl Complete 超純水機(英國ELGA公司)；LT-ET氮吹儀(北京LabTech公司)；TGL 1650高速離心機(湖南滬康離心機有限公司)；SB-800DTD超聲波清洗機(寧波新芝生物科技股份有限公司).

丙酮(色譜純，美國Fisher公司)；乙腈(HPLC，德國Merck公司)；冰乙酸與氯化鈉(優級純，國藥集團化學試劑有限公司)；無水硫酸鎂與醋酸鈉(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)；乙二胺-N丙基硅烷(PSA)、石墨化碳(GCB)與十八烷基硅烷(C18)(美國Agilent公司).

馬拉硫磷、特丁硫磷、治螟磷、水胺硫磷、三唑磷和乙拌磷(質量濃度均為 100 μg/mL，天津農業部環境保護科研監測所)；喹硫磷、皮蠅硫磷和溴硫磷(質量濃度均為 100 μg/mL，壇墨質檢-國家標準物質中心).

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液配制

單一農藥標準品溶液：分別移取 1.0 mL 農藥標準品，于 10 mL 容量瓶中，用丙酮定容至刻度，配成質量濃度為 10 μg/mL 單一農藥標準品溶液，避光保存于 -4 ℃ 冰箱中.

混合農藥標準品溶液：分別取 1 mL，10 μg/mL 單一農藥標準品溶液，于 10 mL 容量瓶中，用丙酮定容至刻度，配成質量濃度為 1 μg/mL 混合農藥標準品溶液，避光保存于 -4 ℃ 冰箱中.

西紅花基質匹配標準工作液(現用現配)：取混合農藥標準品溶液，用西紅花空白樣液稀釋成2.0、4.0、6.0、40.0、60.0、100.0 μg/kg，體積為 1 mL 的基質匹配標準工作液.

丙酮溶劑標準工作液：除用丙酮稀釋外，其余操作同西紅花基質匹配標準工作液的配制.

1.2.2 氣相色譜-質譜條件

色譜柱：HP-5 ms UI毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；載氣為He(純度≥99.999%)、流速為 1.0 mL/min；進樣口溫度 280 ℃；進樣體積 1 μL；不分流進樣；升溫程序：50 ℃(保持 1 min)，先以 30 ℃/min 升至 130 ℃，再以 5 ℃/min 升至 245 ℃(保持 2 min).EI離子源；電子能量 70 eV；離子源溫度 300 ℃；傳輸線溫度 280 ℃；溶劑延遲 8.0 min；監測模式為MRM.

1.2.3 樣品前處理

將西紅花樣品粉碎成粉末，稱取 2 g(精確到 0.000 1 g)于 50 mL 聚苯乙烯具塞離心管中，加入 10 mL 含1% HAc的CH3CN溶液，渦旋混勻 30 s.離心管置于冰浴中，加入 1.0 g NaAc、4.0 g 無水MgSO4、0.5 g 無水NaCl及1顆陶瓷均質子，蓋好管蓋，超聲提取 5 min 后，以 8 000 r/min 離心 5 min.向預先裝有 50 mg PSA、 25 mg C18、25 mg GCB和 150 mg MgSO4的 5 mL 聚苯乙烯離心管中加入 1.0 mL 上清液，蓋好管蓋，振蕩 30 s，以 10 000 r/min 離心 5 min，上清液經氮吹濃縮至近干后用丙酮定容至 1 mL，經 0.22 μm 有機系濾頭過濾，待測.

2 結果與討論

2.1 質譜條件優化

正離子模式下，對混合農藥標準品溶液在m/z50～410的范圍內進行全掃描，獲得總離子流色譜圖，結合NIST標準庫檢索，確定各農藥的保留時間與母離子.再使用子離子掃描方式得到子離子，選取豐度較高、干擾較小的2對特征離子(其中豐度較高的一對為定量離子，另一對為定性離子).在2～40 eV碰撞電壓范圍內，利用儀器軟件“設計實驗助手”優化離子對的碰撞能量，利用儀器軟件“分析實驗助手”確定離子對的最佳碰撞能量，建立優化的MRM方法.經優化MRM方法測得農藥的保留時間、定性離子對、定量離子對與碰撞能量結果見表1，混合農藥標準品(0.15 μg/mL)的MRM色譜圖見圖1.

表1 有機磷農藥保留時間、定量離子對、定性離子對、碰撞能量、校準曲線、相關系數(r2)、檢出限、定量限及基質效應

續表1

圖1 西紅花基質中9種有機磷農藥混標MRM色譜圖

2.2 提取溶劑優化

對提取溶劑的種類進行優化，比較了正己烷、丙酮、乙腈和1%HAc-乙腈的提取效果.結果表明：正己烷易揮發且極性較弱，對極性較大農藥的提取效果不佳；丙酮提取液中色素等雜質含量較多，凈化效果差.與其它溶劑相比，乙腈用作提取劑可以更好地避免脂類、蛋白質以及其它成分的干擾、回收率更高、重復性更好[6].基于此，乙腈成為傳統QuEChERS法的提取劑，但用純乙腈對堿敏感的農藥提取時，回收率不令人滿意.使用1%HAc溶液適當地改變乙腈的酸度，能將對堿敏感農藥的回收率提高至滿意的程度.因此，采用1%HAc-乙腈溶液作為提取液，同時用NaAc與HAc配成緩沖溶液以保持pH值為6～7[7].

2.3 超聲提取時間優化

為除去樣品中的水分加入無水MgSO4，為增強鹽析作用加入NaCl.在西紅花樣品中加入1%HAc-乙腈溶液、NaCl及無水MgSO4后，考察不同的超聲提取時間(3、5、15、25、35 min)對提取效果的影響.結果表明：超聲提取時間對提取效果影響不明顯，為了提高效率，選擇超聲提取時間為 5 min.

2.4 吸附劑選擇

西紅花含有色素、糖類、脂肪酸和黃酮類等復雜成分，用單一吸附劑凈化效果不太明顯.

無水MgSO4能吸附溶液中殘留的水分同時降低乙腈萃取物的極性并使某些極性基質共萃取物沉淀[8].在 50 mg PSA、 25 mg C18、25 mg GCB與 40.0 μg/kg 農藥添加水平下，考察75、150、225、300 mg 無水MgSO4對農藥回收率影響.結果表明：當無水MgSO4用量大于 150 mg 時，回收率在70%～110%間的農藥種類不再變化，綜合考慮添加 150 mg 無水MgSO4.

PSA是一種弱陰離子交換劑，能去除有機酸、糖類以及其它能形成氫鍵的成分[6,9].在 150 mg 無水MgSO4、25 mg C18、25 mg GCB與 40.0 μg/kg 農藥添加水平下，考察50、100、150、200 mg PSA對農藥回收率的影響.結果表明：當PSA用量為 50 mg 時，所有農藥的回收率均達到70%以上，隨PSA用量增加，水胺硫磷回收率下降.可能因為PSA用量導致提取液呈堿性，水胺硫磷在堿性環境下不穩定分解.基于此，添加 50 mg PSA.

C18在去除油脂和非極性干擾物方面效果良好[10].在 150 mg 無水MgSO4、50 mg PSA、25 mg GCB與 40.0 μg/kg 農藥添加水平下，考察25、50、75、100 mg C18對農藥回收率的影響.結果表明：C18用量對回收率影響不明顯，為節約成本，添加 25 mg C18.

GCB能除去色素特別是葉綠素但需注意的是其能吸附具有平面結構的農藥而導致回收率降低[11].在 150 mg 無水MgSO4、50 mg PSA、 25 mg C18與 40.0 μg/kg 農藥添加水平下，考察15、25、35、45 mg GCB對農藥回收率的影響.結果表明：隨GCB用量增加，提取液褪色更明顯，但皮蠅硫磷、水胺硫磷、溴硫磷、喹硫磷與三唑磷的回收率降低明顯.綜合考慮回收率與提取液凈化效果，添加 25 mg GCB.

通過實驗優化，選擇 50 mg PSA、25 mg GCB、25 mg C18與 150 mg MgSO4為吸附劑，可以獲得較好的凈化效果.

2.5 線性范圍、檢出限與定量限

在優化的氣相色譜-質譜條件下，對西紅花基質匹配標準工作液測定，以各農藥濃度作為橫坐標，定量離子對峰面積作為縱坐標，繪制標準曲線.結果表明：在2.0～100.0 μg/kg 范圍內，9種農藥線性關系良好，相關系數(r2)≥0.999 6.以信噪比S/N≥3確定檢出限(limit of detection, LOD)，9種農藥的LOD為0.5～1.3 μg/kg，相同農藥的LOD值低于《中國藥典》2015版通則2341第四法中的LOD值.以信噪比S/N≥10確定定量限(limit of quantification, LOQ)，LOQ為2.0～3.2 μg/kg，結果見表1.

2.6 基質效應

質譜分析中，由于基質效應的存在，會對定量分析結果的準確性和重復性造成影響[12].基質效應相對強度(matrix effect, ME,%)=[(基質匹配校準曲線的斜率/溶劑校準曲線的斜率)-1]×100[13]，ME<-50%或者ME>+50%為強基質效應；-20%

2.7 回收率與精密度

在2 g西紅花空白樣品中，添加水平為4.0、40.0、100.0 μg/kg 的農藥混標進行加標回收率實驗，每一添加水平測定6次，方法的準確度以加標回收率表示，方法的精密度以相對標準偏差(relative standard deviation, RSD)表示.農藥的平均加標回收率分別為73.2%～81.1%、81.4%～84.4%和98.9%～103.9%，RSD分別為1.5%～6.1%、0.71%～4.0%和0.64%～1.8%，結果見表2.結果表明：該法的準確度和精密度較好.

表2 西紅花基質中9種有機磷農藥加標回收率及相對標準偏差(n=6) %

2.8 實際樣品測定

對從云南省大理市藥材市場購買的西紅花樣品15批應用建立的方法進行分析，在1批樣品中檢出特丁硫磷，含量為 35.2 μg/kg.

3 結語

本研究改進了QuEChERS樣品前處理方法，以GC-MS/MS采取MRM模式分析，建立了西紅花中9種有機磷農藥殘留的分析方法.與《中國藥典》2015版通則2341第四法相比，本方法優勢明顯：1)方法的LOD值為0.5～1.3 μg/kg，相同農藥的LOD值低于藥典方法，方法的LOQ值為2.0～3.2 μg/kg，能完全滿足西紅花限量分析的要求；2)試劑用量少，前處理效率高，節約成本.西紅花成分復雜，基質效應明顯，為提高定量分析的準確性，采取基質匹配標準工作液校正.本研究建立的方法具有簡單、快捷、成本低、準確度和靈敏度高等優點，適用于西紅花中有機磷農藥多殘留的檢測.