綠原酸對小鼠巨噬細胞向M2型活化的促進作用及機制▲

朱智德 王慶高 韓景波 竇維華 蔣志雄 陳 煒,3

(1 廣西中醫藥大學博物館，南寧市 530001，電子郵箱：gxzhuzhide@163.com；2 廣西中醫藥大學第一附屬醫院心血管科，南寧市 530023；3 廣西中醫基礎研究重點實驗室， 南寧市 530200)

病毒性心肌炎是指由病毒感染引起的局限性或彌漫性心肌炎性病變，是目前各種原因引起的心肌炎中發病率最高的類型之一[1]。柯薩奇病毒B3型(Coxsackie virus B3，CVB3)是病毒性心肌炎的主要致病因素[2]。近年研究顯示，替代活化途徑的巨噬細胞又稱M2型巨噬細胞，在巨噬細胞所致的急性炎癥過程中起重要的負向調控作用[3-4]。M2型巨噬細胞在急性感染時期可以減少促炎細胞因子的產生，從而阻止急性炎性損害[5-6]。綠原酸又名咖啡鞣酸，是由咖啡酸與奎尼酸合成的縮酚酸，屬于苯丙素類化合物。現研究已發現綠原酸具有心血管保護、抗誘變及抗癌、抗菌及抗病毒、降脂、抗白血病、免疫調節、降糖等多種藥理學活性，但綠原酸是否能通過調控巨噬細胞活化，起到控制炎癥反應，促進干擾素分泌的作用，仍有待探索。本研究擬通過探索綠原酸對CVB3介導的RAW 264.7小鼠巨噬細胞活化途徑的影響，明確綠原酸激活M2巨噬細胞活化的機制，為進一步開發有效治療急性病毒性心肌炎的藥物提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及試劑 RAW 264.7小鼠巨噬細胞購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫。杜氏改良依格爾培養基(Dulbecco′s modified eagle medium,DMEM)、磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline,PBS)、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸細胞消化液、青/鏈霉素細胞培養添加劑等細胞培養用試劑均購自美國Gibco公司(批號：11965092、10010023、12483020、25200072、15240062)，綠原酸(批號：C3878)等生化試劑均購自美國Sigma公司，β-肌動蛋白(β-actin)(批號：ab8227)，信號傳導及轉錄激活蛋白(signal transducer and activator of transcription,STAT)6及Krüppel樣因子4(Krüppel-like factor 4,KLF4)抗體、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG H&L(二抗)均購自英國Abcam公司(批號：ab32520、ab215036、ab6721)，Fizz1、轉化生長因子β(transforming growth factor β,TGF-β)及血小板衍生生長因子(platelet-derived growth factor，PDGF)的酶聯免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測試劑盒購自江蘇酶免實業有限公司(批號：MM-0837M1、MM-45041M1、MM-0070M1)，細胞計數(cell count kit 8，CCK-8)檢測試劑盒(批號：CA1210)、RNA提取試劑(批號：R1100)、反轉錄試劑(批號：RP1100)、PCR擴增試劑(批號：SR1110)均購自中國Solarbio公司，RIPA蛋白提取試劑(批號：R0010)、ECL電化學發光試劑盒(批號：PE0010)等免疫印跡實驗所使用相關試劑及耗材均購自中國Solarbio公司。CVB3購自北納生物(批號：BNCC170424)。PCR檢測所用引物由上海生工合成。

1.2 細胞活力檢測 將RAW 264.7細胞置于37℃、5% CO2條件下培養，每2 d換液一次，取對數生長期RAW 264.7細胞，消化后將細胞接種于96孔板中，接種密度為5×103個/孔，加入不同濃度(0、12.5、25、50、100、200、400、600、800、1 000 μg/mL)綠原酸，于37℃、5% CO2條件下培養2 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，繼續培養4 h，于酶標儀上讀取A450的A值，依照公式計算各組細胞活力：細胞活力(%)=[A(加藥)-A(空白)]/[A(0加藥)-A(空白)]×100%。

1.3 細胞分組及干預 將RAW 264.7細胞置于37℃、5% CO2條件下培養，每2 d換液一次，細胞生長至對數期后將細胞鋪至12孔板，待細胞匯合度至75%時進行后續干預操作。將細胞分為空白對照組、CVB3刺激組、CVB3刺激+綠原酸低劑量組、CVB3刺激+綠原酸中劑量組、CVB3刺激+綠原酸高劑量組。其中，CVB3感染劑量為107TCID50/L，藥物干預組細胞經CVB3干預24 h后再根據分組給予藥物干預；綠原酸粉末溶于二甲基亞砜，儲液濃度為10 mg/mL，按照實驗濃度要求每組添加相應濃度綠原酸，其中低劑量、中劑量、高劑量分別為25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL。空白對照組加入1%二甲基亞砜作為溶劑對照。藥物干預期間將細胞置于37℃，5% CO2環境下培養，培養72 h后收集細胞上清液及細胞進行后續實驗，實驗重復3次。

1.4 實時PCR檢測 干預72 h后，收集各組細胞，按照RNA提取試劑盒說明書提取各組細胞總RNA，使用反轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA，進行PCR體系配比，反應體系：2×SYBR Green PCR Master Mix 12.5 μL，Primer F(10 μM) 1μL，上下游引物(10 μM)各1 μL，cDNA 2μL，ddH2O 8.5 μL。于ABI 7500熒光定量PCR儀上進行擴增反應(熱啟動95℃，10 min；變性95℃，10 s；退火/延伸60℃，35 s，共40個循環；溶解曲線分析)。獲得實驗數據，以β-肌動蛋白(β-actin)基因為內參，經2-ΔΔCt法計算各基因相對表達量。引物序列如下：β-actin上游引物5′-CCACCATGTACCCAGGCATT，下游引物5′-CGGACTCATCGTACTCCTGC-3′；白細胞介素13 α1受體(interleukin 13 receptor α1,IL-13Rα1)上游引物5′-ACTATTGGAGCACGGCACAA-3′，下游引物5′-TCCCAGCTGCAAGCTGATAC-3′；白細胞介素4α受體(interleukin 4 receptor α,IL-4Rα)上游引物5′-TCTACTATACGGCGCGTGTG-3′，下游引物5′-ATTCCCGTGAGCTCTCCTCA-3′；STAT6上游引物5′-GTGTGAAAGCCTGGTGGAAAT-3′，下游引物5′-GGACTTCATCCAGACGGCTT-3′；KLF4上游引物5′-CGATGAACTGACCAGGCACT-3′，下游引物5′-CCATGATTGTAGCGCTTGCC-3′。

1.5 免疫印跡實驗檢測 干預72 h后，收集各組細胞，依照RIPA蛋白提取試劑盒說明書操作步驟提取細胞總蛋白，并進行變性處理。蛋白定量后進行二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠蛋白電泳，電泳結束后將蛋白轉印至聚偏氟乙烯膜上，經8%脫脂奶粉在24℃下封閉2 h后，置于4℃條件下孵育一抗(STAT6、KLF4、β-actin稀釋比例分別為1 ∶1 000、1 ∶2 000、1 ∶5 000)12 h，經PBST洗脫，再于37℃下孵育對應二抗(稀釋比例1 ∶10 000)2 h，后使用ECL電化學發光試劑盒，于Tanon 5200多功能成像儀(上海天能)上進行曝光成像。使用Image J軟件讀取各組光密度值，目的蛋白光密度值/內參蛋白光密度值即為蛋白相對表達量。

1.6 ELISA檢測 干預72 h后，取細胞上清液，在4℃下經3 000 r/min離心5 min后，根據Fizz1、TGF-β及PDGF的ELISA檢測試劑盒說明書，設置標準曲線、空白對照及樣本檢測孔，經酶聯免疫吸附及抗體結合、化學顯色等步驟，使用FilterMX F5型多功能酶標儀(MD公司)在A450處讀取A值，根據標準曲線計算各組各指標表達量，進行作圖及數據統計分析。

1.7 統計學分析 使用GraphPad Prism軟件進行數據制圖，SPSS 25.00軟件進行數據統計及分析。計量資料以(x±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t法。以P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 綠原酸對RAW 264.7細胞活性的影響 分別使用不同濃度綠原酸干預細胞后，RAW 264.7細胞半數抑制濃度(median inhibition concentration,IC50)為285.2 μg/mL。在≤100 μg/mL的藥物濃度干預下，細胞可保持80%以上活力，藥物濃度>200 μg/mL時，細胞活力顯著降低，見圖1。

圖1 各濃度綠原酸干預下RAW 264.7細胞活性

2.2 綠原酸對RAW 264.7細胞分泌炎癥因子及生長因子的影響 與空白對照組相比，CVB3刺激組和CVB3刺激+綠原酸低劑量組細胞上清液中Fizz1相對表達量降低，TGF-β及PDGF相對表達量升高(均P<0.05)，CVB3刺激+綠原酸中劑量組細胞上清液中TGF-β相對表達量亦升高(P<0.05)，但CVB3刺激+綠原酸高劑量組各因子相對表達量與空白對照組差異無統計學意義(均P>0.05)。與CVB3刺激組相比，CVB3刺激+綠原酸中劑量組、CVB3刺激+綠原酸高劑量組細胞上清液中Fizz1相對表達量升高，且CVB3刺激+綠原酸高劑量組細胞上清液中TGF-β及PDGF相對表達量降低(均P<0.05)。見表1。

表1 5組RAW 264.7細胞上清液Fizz1、TGF-β及PDGF相對表達量對比(x±s)

2.3 綠原酸對RAW264.7細胞替代途徑活化相關因子mRNA及蛋白表達的影響 與空白對照組相比，CVB3刺激組和CVB3刺激+綠原酸低劑量組的IL-13Rα1、IL-4Rα、STAT6、KLF4 mRNA以及STAT6、KLF4蛋白的相對表達水平均降低(均P<0.05)，CVB3刺激+綠原酸中劑量組IL-13Rα1、STAT6、KLF4 mRNA以及KLF4蛋白的相對表達水平亦降低(均P<0.05)。與CVB3刺激組相比，CVB3刺激+綠原酸中劑量組和CVB3刺激+綠原酸高劑量組IL-13Rα1、IL-4Rα、STAT6、KLF4 mRNA以及STAT6、KLF4蛋白的相對表達水平均升高(均P<0.05)，其中除IL-13Rα1 mRNA以及KLF4蛋白的相對表達水平外，CVB3刺激+綠原酸高劑量組其他因子mRNA及STAT6蛋白的相對表達水平與空白對照組比較差異均無統計學意義(均P>0.05)。見表2和圖2。

表2 5組RAW 264.7細胞相關因子mRNA及蛋白表達水平的對比(x±s)

圖2 5組RAW 264.7細胞STAT6及KLF4蛋白表達情況

3 討 論

病毒性心肌炎臨床表現不一，嚴重者出現進行性心臟擴大、心力衰竭等情況，8%～12%的患者會出現猝死[7]，疾病譜的復雜性使其診斷和治療成為臨床上的一大難點。病毒感染引起心肌炎的機制尚不十分明確，目前普遍認為主要的機制為病毒直接損害心肌以及病毒感染后機體自身的免疫反應引起損傷，與機體的過度炎癥反應關系密切[8]。病毒進入心肌細胞后，進行復制的同時表達病毒蛋白并釋放病毒顆粒，而巨噬細胞吞噬病毒顆粒，釋放相關因子并提呈抗原，啟動體液及細胞免疫，在局部釋放出炎性因子(如腫瘤壞死因子、白細胞介素、干擾素等)，故其在清除病毒的同時也加劇心肌的炎癥反應[9]。這種紊亂可能會導致持續性心肌損傷，從而使病情進一步惡化[10]。因此，在病毒性心肌炎的急性進展過程中，控制過強的炎癥反應，是避免心臟組織進行性損害、降低急性期死亡率的一種可行性手段。使用免疫球蛋白和免疫抑制劑等免疫調節劑治療病毒性心肌炎是目前主流的方法[11-12]，但存在價格昂貴、貨源不穩定、藥理作用機制不明確等缺點[13]。因此，臨床迫切需要一種在病毒性心肌炎急性期控制過強免疫反應，但又不會明顯抑制機體免疫功能的藥物。

巨噬細胞可被極化為兩個亞群，分別為經典途徑活化的巨噬細胞(M1型巨噬細胞)和替代途徑活化的巨噬細胞(M2型巨噬細胞)[3]，其中M1型巨噬細胞和經典的炎癥反應密切相關，而M2型巨噬細胞在急性感染時期能減少促炎細胞因子的產生，從而阻止急性炎性損害[4]。因此，如果在病毒感染的早期采用有效的方法調控M2型巨噬細胞，則將能有效控制急性病毒性心肌炎患者心功能的進行性惡化[14-15]。巨噬細胞表面的IL-4Rα/IL-13Rα1復合體可與IL-13結合，啟動巨噬細胞替代活化途徑，促進其下游STAT6表達，抑制STAT1活性，避免巨噬細胞向經典途徑活化，并誘導生成KLF-4等細胞因子，協同抑制NF-κB p50/p65復合體生成，并促進Fizz1表達及膠原沉積，從而阻止過強的炎癥反應產生[16-17]。本研究中，RAW 264.7小鼠巨噬細胞經CVB3刺激后，細胞上清液中Fizz1表達降低而TGF-β、PDGF表達升高，且IL-13Rα1、IL-4Rα、STAT6、KLF4 mRNA以及STAT6、KLF4蛋白的相對表達水平均降低，這表明RAW 264.7細胞呈向M2型分化的趨勢。

綠原酸廣泛存在于植物中，以金銀花、杜仲中的含量較高，具有廣泛的藥理作用。本研究結果表明，在體外培養RAW 264.7細胞過程中添加綠原酸，藥物濃度≤100 μg/mL時細胞活力無顯著降低現象，因此后續實驗的藥物干預濃度均未超過100 μg/mL。經高劑量綠原酸干預后，與CVB3刺激組比較，RAW 264.7細胞上清液中Fizz1相對表達量升高而TGF-β及PDGF相對表達量降低(P<0.05)，且這些細胞因子表達量與空白對照組相比差異均無統計學意義(P>0.05)；此外，替代途徑活化相關因子mRNA及蛋白表達水平均較CVB3刺激組升高(P<0.05)，其中IL-4Rα、STAT6、KLF4 mRNA以及STAT6蛋白與空白對照組相比差異均無統計學意義(P>0.05)。這表明高劑量綠原酸可抑制經典炎癥活化途徑，使得RAW 264.7細胞向M2型分化，并可抑制巨噬細胞分泌炎癥因子。然而，經低劑量的綠原酸干預后RAW 264.7細胞中的外泌細胞因子和替代途徑活化相關因子的表達并無明顯變化，而經中劑量的綠原酸干預后RAW 264.7細胞中的大部分上述因子的表達有所改善，但未達到空白對照組水平，因此100 μg/mL的高劑量綠原酸干預效果較好。

綜上所述，在體外培養RAW 264.7細胞的過程中，100 μg/mL的高劑量綠原酸可逆轉由CVB3介導的巨噬細胞向M2型分化，并抑制炎癥因子的分泌，從而降低炎癥水平。因此推測，綠原酸可抑制病毒性心肌炎引發的體內炎癥反應惡性循環，達到阻斷過強炎癥反應的目的，有望成為抑制病毒性心肌炎急性期免疫反應的臨床藥物。