高溫脅迫對(duì)哲羅魚血液指標(biāo)和熱休克蛋白基因的影響

佟廣香，唐國(guó)盤，董 樂，張慶漁，張永泉，匡友誼

(1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江省冷水性魚類種質(zhì)資源及增養(yǎng)殖重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150070；2.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，鄭州 450046；3.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306)

哲羅魚(Huchotaimen)屬鮭形目鮭科哲羅魚屬，是鮭科魚類中生長(zhǎng)最快的冷水性魚類，其肉質(zhì)細(xì)嫩，味道鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富[1]。目前哲羅魚的野生資源十分匱乏，已被IUCN列為瀕危物種紅色名錄，處于易危狀態(tài)[2,3]。魚類生長(zhǎng)與水溫密切相關(guān)，低于或高于魚類的適宜生長(zhǎng)水溫時(shí)，就會(huì)妨礙魚類的正常生長(zhǎng)發(fā)育[4]。超出適宜生長(zhǎng)溫度可使魚類的攝食量[5]、飼料報(bào)酬[6]、抗病力[7]和繁殖率[8]等生產(chǎn)指標(biāo)顯著降低，甚至導(dǎo)致魚類大量死亡。哲羅魚是典型的冷水性魚類，對(duì)溫度變化敏感，最適生長(zhǎng)水溫為15.0～18.0 ℃，當(dāng)水溫在12.0～18.0 ℃時(shí)，哲羅魚生長(zhǎng)速度隨水溫的升高而加快，18.0 ℃時(shí)達(dá)到頂峰[9]；水溫超過18.0 ℃時(shí)，哲羅魚生長(zhǎng)速度隨水溫的升高而降低，甚至死亡。由于水溫的限制，在集約化網(wǎng)箱養(yǎng)殖過程中，夏季高溫極易引起哲羅魚應(yīng)激反應(yīng)，造成減產(chǎn)，甚至全部死亡[10]；水溫限制也使哲羅魚的養(yǎng)殖區(qū)域僅分布在我國(guó)東北和西北地區(qū)[11]，而我國(guó)北方水資源并不豐富，且冰封期較長(zhǎng)、生長(zhǎng)期短等因素導(dǎo)致哲羅魚的養(yǎng)殖周期較長(zhǎng)，生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)不明顯。選擇高溫耐受的哲羅魚新品種能夠在南方推廣養(yǎng)殖，延長(zhǎng)生長(zhǎng)期，縮短養(yǎng)殖周期，已成為哲羅魚養(yǎng)殖面臨的一個(gè)難題。目前哲羅魚的馴化養(yǎng)殖及人工繁育已經(jīng)取得成功[12,13]，溫度對(duì)哲羅魚幼魚生長(zhǎng)及攝食效率的影響也有報(bào)道[14]，但未有高溫脅迫的相關(guān)研究。本實(shí)驗(yàn)?zāi)M自然狀態(tài)下哲羅魚的生存環(huán)境，采取緩慢升溫的方式將水溫升至26.0 ℃并保持96 h，探討哲羅魚在26.0 ℃時(shí)血細(xì)胞組成、血清生化指標(biāo)及相關(guān)熱應(yīng)激蛋白基因的變化規(guī)律，弄清哲羅魚處于高溫時(shí)的生理變化，以期為哲羅魚高溫耐受相關(guān)研究提供理論參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試哲羅魚由中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所渤海冷水性魚試驗(yàn)站提供，隨機(jī)選取健康的2齡哲羅魚50尾，平均體重(128.0±12.0) g。將試驗(yàn)魚移入控溫魚缸，每天投喂2次，水溫(18.0±0.2) ℃，暫養(yǎng)20 d，待試驗(yàn)魚適應(yīng)環(huán)境后開始升溫，每24 h升高1.0 ℃，升至(26.0±0.2) ℃維持96 h。分別于18.0 ℃和26.0 ℃的 0、24、48、96 h采樣。取樣前將試驗(yàn)魚麻醉，每組取10尾，抽取2 mL血液，用于血細(xì)胞組成分析和血清分離；采集肝臟、心臟和血液RNA樣本儲(chǔ)存-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 血細(xì)胞組成及血清生化指標(biāo)的測(cè)定

用動(dòng)物血液細(xì)胞分析儀(邁瑞B(yǎng)C-2800Vet)測(cè)定白細(xì)胞總數(shù)、紅細(xì)胞數(shù)、淋巴細(xì)胞數(shù)、中性粒細(xì)胞數(shù)、單核細(xì)胞數(shù)、血紅蛋白含量和血小板數(shù)。用全自動(dòng)血液生化指標(biāo)分析儀(邁瑞B(yǎng)S200)測(cè)定肝功能相關(guān)指標(biāo)：總膽紅素(T-bil-V)、白蛋白(ALB)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(又稱谷草轉(zhuǎn)氨酶,AST)、堿性磷酸酶(ALP)和總蛋白(TP)；血脂類：總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)；腎功能相關(guān)指標(biāo)：肌酐(CREA-S)和二氧化碳(CO2)；心臟功能：肌酸激酶(CK)。

1.3 RNA提取及qPCR擴(kuò)增

Trizol法提取總RNA，并用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成第一鏈cDNA。本實(shí)驗(yàn)室對(duì)目前常用的10個(gè)內(nèi)參基因(28SrRNA、gapdh、arbpr、18SrRNA、rps29、rpl13、rpl19、sdha、α-tublin和β-actin) 穩(wěn)定性分析發(fā)現(xiàn)，在哲羅魚的血液、心、腦和肝組織內(nèi)，rpl13、rpl19和rps29均表現(xiàn)很好的穩(wěn)定性，可以做RT-qPCR的內(nèi)參基因(未發(fā)表)，本實(shí)驗(yàn)選擇rpl19基因作為內(nèi)參基因。利用primer 5.0設(shè)計(jì)hsp60、hsp70、hsp90和rpl19基因特異性擴(kuò)增引物(表1)。反應(yīng)體系為10 μL，包括SYBR Green Mix 5 μL，c DNA 1 μL，10 pmol/μL的上下游引物各1 μL，ddH2O 2 μL。擴(kuò)增程序?yàn)?95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃ 15 s，60.5 ℃ 20 s，40個(gè)循環(huán)；95 ℃ 15 s，60.5 ℃ 1 min，95 ℃ 1 min。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 血細(xì)胞組成

血細(xì)胞數(shù)量的變化見表2，由表2可知白細(xì)胞和血小板的數(shù)量未發(fā)生顯著性變化；紅細(xì)胞數(shù)均顯著高于對(duì)照組，并隨著時(shí)間的增加而增加，96 h達(dá)極顯著水平；淋巴細(xì)胞數(shù)在0、24和48 h時(shí)顯著高于對(duì)照組，96 h極顯著高于對(duì)照組；中性粒細(xì)胞數(shù)均顯著低于對(duì)照組；單核細(xì)胞表現(xiàn)出下降趨勢(shì)，在96 h顯著低于對(duì)照組；血紅蛋白在24 h的含量極顯著高于對(duì)照組，在48 h與96 h顯著高于對(duì)照組。此外值得注意的是在溫度升至26.0 ℃后，隨著時(shí)間的增加，淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和血紅蛋白在26.0 ℃不同時(shí)間點(diǎn)無(wú)顯著性差異。

表2 高溫脅迫下哲羅魚血細(xì)胞數(shù)目Tab.2 Blood cell count of H.taimen under high temperature stress

2.2 血清生化指標(biāo)變化

血清生化指標(biāo)變化見表3，肝功能相關(guān)指標(biāo)：總膽紅素(T-bil-V)和白蛋白(ALB)與對(duì)照組無(wú)顯著性差異；總蛋白(TP)呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，96 h顯著高于對(duì)照組；谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)先下降后上升，0 h極顯著低于對(duì)照組，其余組別與對(duì)照組無(wú)顯著差異；堿性磷酸酶(ALP)先上升后下降，0～48 h顯著高于對(duì)照組，96 h下降至與對(duì)照組無(wú)顯著差異。血脂類：低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)與對(duì)照組無(wú)顯著性差異；總膽固醇(TC)呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，96 h顯著高于對(duì)照組。腎功相關(guān)指標(biāo)：肌酐(CREA-S)先下降、后上升、再下降，0 h顯著低于對(duì)照組，24 h與對(duì)照組無(wú)顯著差異，48 h時(shí)顯著高于對(duì)照組；二氧化碳(CO2)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，96 h時(shí)顯著低于對(duì)照組。心臟功能：肌酸激酶(CK)先下降、后上升，均顯著低于對(duì)照組。

表3 高溫脅迫下哲羅魚血清生化指標(biāo)Tab.3 Serum biochemical indexes of H.taimen under high temperature stress

2.3 相關(guān)基因的表達(dá)

血液中hsp70和hsp90基因表達(dá)量與對(duì)照組無(wú)顯著差異，hsp60基因呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，24～96顯著高于對(duì)照組。心臟和腦組織中hsp70與對(duì)照組無(wú)顯著差異，hsp60和hsp90基因表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)，24 h和96 h極顯著高于對(duì)照組。肝臟中hsp60基因表達(dá)與對(duì)照組無(wú)顯著差異，hsp70和hsp90基因低于對(duì)照組，部分時(shí)間點(diǎn)達(dá)到顯著水平，hsp90基因在肝臟中最先表現(xiàn)出極顯著差異具體見圖1。

3 討論

紅細(xì)胞和血紅蛋白與魚體內(nèi)氧的供應(yīng)直接相關(guān)[15]，哲羅魚在水溫升至26.0 ℃時(shí)，紅細(xì)胞即發(fā)生顯著性增加，且隨時(shí)間的延長(zhǎng)紅細(xì)胞數(shù)目持續(xù)顯著增加，這是由于溫度升高時(shí)，水中溶解氧含量降低，哲羅魚活動(dòng)性增強(qiáng)，魚體耗氧量增加，需要改變呼吸頻率來(lái)增加氧攝入，同時(shí)增加紅細(xì)胞的數(shù)量和血紅蛋白的含量，相應(yīng)提升結(jié)合氧能力[16]，來(lái)維持機(jī)體的耗氧。哲羅魚用增加紅細(xì)胞數(shù)目和血紅蛋白含量來(lái)維持高溫下魚體耗氧，這與羅非魚(Oreochromsmossambcus)、丁(Tincatinca)的研究結(jié)果一致[17]。除了紅細(xì)胞和血紅蛋白發(fā)生變化外，淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞也發(fā)生了變化。淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞均是與魚體的免疫相關(guān)的細(xì)胞，魚類處于系統(tǒng)發(fā)育較低階段，淋巴細(xì)胞主要具有吞噬細(xì)菌、病毒的作用；中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞屬于非特異免疫系統(tǒng)，中性粒細(xì)胞具趨化作用、吞噬作用和殺菌作用；單核細(xì)胞能吞噬、清除受傷、衰老的細(xì)胞及其碎片，非特異性免疫系統(tǒng)在抵抗病原生物入侵時(shí)發(fā)揮著重要作用。有研究表明，應(yīng)激對(duì)魚類吞噬細(xì)胞的數(shù)量有顯著影響，各種功能受到抑制[18]。本試驗(yàn)高溫脅迫過程中，淋巴細(xì)胞含量均顯著高于對(duì)照組，中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞低于對(duì)照組與文獻(xiàn)報(bào)道一致[18]，說(shuō)明以淋巴細(xì)胞為主的免疫系統(tǒng)正在積極的發(fā)揮作用，而非特異免疫功能受到抑制，這些免疫相關(guān)的細(xì)胞發(fā)生變化，說(shuō)明26.0 ℃水溫超出魚體適應(yīng)范圍，魚體極其不適應(yīng)，魚體處于感染狀態(tài)。

圖1 哲羅魚熱應(yīng)激蛋白相關(guān)基因的表達(dá)Fig.1 Expression of heat shock protein genes of H.taimen

T-bil-V反映肝臟的分泌和排泄功能，TP和ALB反應(yīng)肝臟合成儲(chǔ)存功能，肝臟也是合成和存儲(chǔ)總膽固醇(TC)的主要器官，本實(shí)驗(yàn)中T-bil-V和ALB與對(duì)照無(wú)顯著差異，TP和TC呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，說(shuō)明肝臟的合成和儲(chǔ)存功能未受到影響。肝臟AST和ALP能夠反映肝細(xì)胞損傷，當(dāng)肝臟受到損傷時(shí)引起AST和ALP升高，已有研究報(bào)道松浦鏡鯉(songpumirrorcarp)體內(nèi)ALP的含量也隨溫度的升高而增加[19]。本試驗(yàn)中48 h和96 h AST高于對(duì)照組，而ALP均顯著高于對(duì)照組，說(shuō)明溫度升高造成哲羅魚肝損傷，影響部分肝功能。CREA-S是多數(shù)魚類嘌呤代謝的終產(chǎn)物，常被用來(lái)評(píng)估魚類鰓和腎臟的功能[20]。血清CREA-S的濃度變化主要由腎小球的濾過能力(腎小球?yàn)V過率)來(lái)決定，可在一定程度上準(zhǔn)確反映腎小球?yàn)V過功能的損害程度，腎功能正常時(shí)，CREA-S排出率恒定，當(dāng)腎實(shí)質(zhì)受到損害時(shí)，腎小球的濾過率就會(huì)降低，CREA-S濃度升高。本試驗(yàn)中CREA-S含量表現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)，0 h顯著低于對(duì)照組，24 h與對(duì)照組無(wú)顯著差異，48 h時(shí)顯著高于對(duì)照組，說(shuō)明高溫脅迫對(duì)哲羅魚腎臟造成了損傷。同時(shí)魚體內(nèi)代謝產(chǎn)物CO2在血漿中富集會(huì)導(dǎo)致血漿酸化，降低血液的攜氧能力和血紅蛋白對(duì)氧氣的親和力[21,22]，因此實(shí)驗(yàn)過程中CO2呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，以增加血液的攜氧能力和血紅蛋白對(duì)氧氣的親和力，保證魚體供氧。CK和AST是心臟功能的重要檢測(cè)指標(biāo)，CK主要存在于細(xì)胞質(zhì)和線粒體中，是一個(gè)與細(xì)胞內(nèi)能量運(yùn)轉(zhuǎn)、肌肉收縮、ATP再生有直接關(guān)系的重要激酶[23]。CK下降說(shuō)明甲狀腺功能亢進(jìn)，是由于甲狀腺合成釋放過多的甲狀腺激素，造成機(jī)體代謝亢進(jìn)和交感神經(jīng)興奮。AST主要分布在心肌，其次是肝臟、骨骼肌和腎臟等組織中[24]。正常狀態(tài)下血清中的AST含量較低，但相應(yīng)細(xì)胞受損時(shí)，細(xì)胞膜通透性增加，胞漿內(nèi)的AST釋放后進(jìn)入血液，導(dǎo)致血清濃度升高。大黃魚的CK和AST在32.0 ℃高溫下持續(xù)7 d后的含量顯著高于適溫組，顯示高溫造成大黃魚心功能障礙[25]。本試驗(yàn)中，當(dāng)溫度升至26.0 ℃時(shí)，CK和AST均顯著性降低，CK先下降、后上升，均顯著低于對(duì)照組，持續(xù)熱刺激48 h開始回升，但不回升到正常水平；AST在48 h回升至正常水平，表明溫度升至26.0 ℃對(duì)哲羅魚心臟造成損傷，但隨著時(shí)間增加損傷程度沒有加劇且逐漸恢復(fù)，可見哲羅魚在26.0 ℃高溫脅迫過程中心臟具有一定的適應(yīng)能力。

熱休克蛋白(heat shock proteins,HSPs)是由機(jī)體受傷、紫外線暴露、受寒、組織修復(fù)等各種應(yīng)激誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白[26]，是動(dòng)物體處于應(yīng)激狀態(tài)時(shí)所誘導(dǎo)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)分子伴侶，具有阻止蛋白質(zhì)發(fā)生錯(cuò)誤折疊和聚集，穩(wěn)定胞內(nèi)蛋白構(gòu)象，介導(dǎo)蛋白質(zhì)到達(dá)目標(biāo)細(xì)胞器的功能[26]。有研究報(bào)道生物體在受到外界寒冷和高溫等刺激時(shí)，各組織細(xì)胞的熱休克蛋白的表達(dá)都有不同程度的增加[27]，大量表達(dá)的hsp60、hsp70和hsp90可增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)熱應(yīng)激的耐受性，提高細(xì)胞的存活率，保護(hù)機(jī)體不受或少受損害[28]。因此在受到高溫脅迫時(shí)理論上哲羅魚各組織hsp60、hsp70和hsp90的表達(dá)量均應(yīng)上升，但綜合各組織表達(dá)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高溫脅迫時(shí)在哲羅魚的血液、心臟和腦中hsp60和hsp90基因較hsp70基因變化明顯，二者均有部分時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組；而在肝臟中hsp60未有顯著變化，hsp70和hsp90卻顯著低于對(duì)照組，推測(cè)高溫脅迫肝臟先受到損傷，26 ℃已經(jīng)超出了哲羅魚的耐受能力，解剖發(fā)現(xiàn)肝臟發(fā)白，血清中ALP升高，說(shuō)明高溫使哲羅魚肝臟受到嚴(yán)重?fù)p傷，失去了相應(yīng)的調(diào)節(jié)功能，這與肝功能指標(biāo)結(jié)果一致；此時(shí)血液、心臟和腦hsp60和hsp90表達(dá)量增加，做出相應(yīng)的調(diào)節(jié)，以緩解魚體對(duì)溫度的不適。

本研究發(fā)現(xiàn)哲羅魚在26.0 ℃維持不同時(shí)間血液生理生化指標(biāo)變化過程及相關(guān)熱應(yīng)激蛋白基因在血液、心、腦和肝臟組織中的表達(dá)情況。高溫時(shí)哲羅魚體內(nèi)供氧相關(guān)的紅細(xì)胞和血紅蛋白增加，維持魚體耗氧；淋巴細(xì)胞上升，魚體處于免疫狀態(tài)，但非特異免疫的中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞功能受到抑制。肝功能指標(biāo)顯示ALP增高，腎功相關(guān)CREA-S含量表現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)，心臟功能的CK先下降、后上升，說(shuō)明肝功能和腎功能在一定程度上受到一定損傷，心功能在26.0 ℃持續(xù)一段時(shí)間后得到恢復(fù)。由于肝受到損傷，已經(jīng)失去了熱休克蛋白調(diào)節(jié)功能，血液、心臟和腦中部分熱應(yīng)激蛋白表達(dá)量增加以緩解魚體不適。本研究為哲羅魚熱應(yīng)激機(jī)制相關(guān)研究及耐高溫新品種培育提供理論依據(jù)。