急性高溫脅迫對大口黑鱸“優鱸3號”肝臟凋亡相關酶活性和基因表達的影響

陸 健，張佳佳，周國勤，王佩佩，慶 輝

(南京市水產科學研究所，南京 210036)

大口黑鱸(Micropterussalmoides)，又名加州鱸，原產于北美洲的淡水河流和湖泊中，目前已在廣東、江蘇和浙江等地大規模養殖，成為中國南方地區淡水人工養殖的主養品種之一[1-3]。已有研究表明大口黑鱸的最適生長溫度為20～30 ℃，且在超過36 ℃的水環境中無法生存[4]。但是近年來，由于全球氣候日益惡化，夏季連續高溫、極端天氣頻有發生，同時常伴有病害發生，這影響了鱸產業的可持續健康發展。據統計，2018年我國鱸的產量由2017年45萬噸減少為42萬噸[5]。大口黑鱸“優鱸3號”是2019 年經全國水產原種和良種審定委員會審定通過的新品種，具有生長速度快、飼料利用率高及適應攝食人工配合飼料等優點[6,7]。大口黑鱸“優鱸3號”作為水產領域的新星，目前已在兩廣和江浙地區廣泛推廣，將來還會迎來更加廣闊的養殖前景。關于大口黑鱸“優鱸3號”的生物學特性以及抗逆性研究鮮有報道，因此有必要加強大口黑鱸“優鱸3號”的生存溫度等相關生物學研究，探究其在高溫脅迫下的生理變化機制，以及在高溫等惡劣環境下的生存狀態。

細胞凋亡(apoptosis)是一種高度調節的程序性細胞死亡[8,9]。研究認為細胞調亡包括內源途徑(線粒體通路、內質網通路)和外源途徑(死亡受體通路)[10-11]。但是所有通路的最終途徑都是半胱氨酸蛋白酶(Caspase)的激活，所以Caspase家族在細胞凋亡中扮演著舉足輕重的角色[12-15]。同時，肝臟是維持生命活動和物質代謝的重要器官，參與魚類體內多種物質的合成、貯存、代謝、轉化和分解[16]。因此，本研究以“優鱸3號”為研究對象，探究了其在極度高溫脅迫下肝臟細胞凋亡相關酶活性和基因表達，旨在為 “優鱸3號”應對高溫脅迫的機制和健康高效養殖提供基礎數據，促進大口黑鱸養殖產業升級。

1 材料與方法

1.1 試驗處理

試驗所用大口黑鱸“優鱸3號”幼魚,體質量(9.87±1.2)g，體長(7.9±0.4) cm,均來自江蘇南京帥豐飼料有限公司，將試驗用魚暫養于有生物過濾水再循環系統(配備有冷卻和加熱功能，流速為5 L/min，光照時間為14 h)的水族箱中。每天投喂兩次(8:00～9:00和20:00～21:00)江蘇南京帥豐飼料有限公司大口黑鱸配合飼料。整個暫養和試驗期間水中溶氧高于5 mg/L，氨氮與亞硝酸鹽低于0.01 mg/L，試驗前禁食24 h，試驗期間不投喂。

將各組幼魚在25 ℃水溫下暫養15 d后，對照組水溫保持在該溫度下恒定。試驗組按水溫31、34、37 ℃設置，每個溫度包括三個平行組，每個平行組30尾幼魚，將暫養幼魚迅速轉入事先預調好水溫的水循環缸中，并于1、3、6、12、24和48 h取6尾幼魚的肝臟組織于液氮中速凍，然后轉移至-80 ℃保存。預實驗結果顯示37 ℃組大口黑鱸“優鱸3號”的死亡率較高，48 h小于50%，則認為37 ℃為極限高溫，測定在37 ℃下細胞凋亡相關酶活性和基因的表達。

1.2 酶活性測定

酶活性測定均采用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒：Caspase-3(批號：G015-1-3)，Caspase-9(批號：G018-1-3)，準確稱取50 mg肝組織，加入50 μL試劑盒中的裂解液，冰水浴條件下機械勻漿，2 500 r/min，離心10 min，取少量樣品用Bradford法測蛋白濃度，之后測定Caspase-3和Caspase-9酶活性，取3次重復實驗平均值。

1.3 組織RNA提取與cDNA合成

組織RNA的提取采用高純總RNA快速抽提試劑盒(北京百泰克生物技術有限公司，RP1202)，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的質量(電壓120 V，電流165 mA，時間25 min)，用Nanodrop 檢測 RNA 的純度(OD260/280)和濃度。根據HiScript?Reverse Transcriptase的說明(Vazyme，R123-01)進行第一鏈cDNA反轉錄。

1.4 熒光定量PCR

參考樊佳佳等[17]以18s基因為內參基因，Caspase-3和Caspase-9引物序列來自Yu等[18]參考斑馬魚(Daniorerio，NCBI：NC_007135.7)、尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus，NCBI：NC_031982.2)、斑點叉尾鮰(Ictaluruspunctatus，NCBI：NC_030438.1)、尖吻鱸(LatesCalcarifer，NCBI：NW_017363888.1)的BCL-2基因的 cDNA 序列，在同源保守區內用Premier 5.0軟件設計基因特異性上下游引物，參考引物序列詳見表1。用SYBR qPCR Master Mix(High ROX Premixed)試劑盒(Vazyme，Q341-02/03)在ABI熒光定量PCR儀擴增。反應體系：2 μL cDNA模板(5 ng/μL)，4 μL的上、下游引物(10 μmol/L)，10 μL 2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix(High ROX Premixed)。擴增條件為95 ℃ 10 min； 40個循環的條件是95 ℃ 10 s，58 ℃ 60 s，熔解曲線60 ℃→95 ℃，每15 s升溫0.3 ℃。每個樣品重復3 次。

表1 引物信息Tab.1 The information of the primers

1.5 數據統計與分析

通過計算OD誘導劑/OD陰性對照的倍數來表示酶的相對活化程度，實時熒光定量PCR分析獲得的實驗結果數據采用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。實驗所得數據均用平均值±標準差的方式表示，所有數據均用 SPSS 19.0進行統計分析。利用單因素方差分析(One-way ANOVA)和LSD多重比較檢驗對數據處理和檢驗分析，P<0.05表示差異顯著(* )，P<0.01表示差異極顯著(**)，用Origin 8.6 繪圖。

2 結果與分析

2.1 極度高溫脅迫對大口黑鱸“優鱸3號”肝臟凋亡相關酶活性的影響

在大口黑鱸“優鱸3號”肝臟中，相較于對照組，37 ℃高溫脅迫后，Caspase3和Caspase9酶活均顯著升高 (圖1和圖2)，且隨著脅迫時間的延長呈升高趨勢，在48 h達到峰值，極顯著高于對照組，Caspase3為對照組的5.05倍，Caspase9為對照組的4.82倍。

圖1 高溫脅迫對大口黑鱸“優鱸3號”肝臟Caspase 3活性的影響Fig.1 The effects of high-temperature stress on Caspase 3 activities in liver of M.salmoides “youlu No.3”

圖2 高溫脅迫對大口黑鱸“優鱸3號”肝臟Caspase 9活性的影響Fig.2 The effects of high-temperature stress on Caspase 9 activities in liver of M.salmoides “youlu No.3”

2.2 極度高溫脅迫對大口黑鱸“優鱸3號”肝臟凋亡相關基因表達的影響

37 ℃高溫脅迫下大口黑鱸“優鱸3號”肝臟Caspase3和Caspase9的表達量相較于對照組均呈現先升高再下降的趨勢(圖3和圖4)。Caspase3從3 h時顯著升高，在6 h的表達量達到峰值，為對照組的23.67倍，隨之下降至24 h依舊顯著高于對照組，48 h與對照組無顯著性差異。Caspase 9的表達量相較于對照組從1 h時顯著升高，在6 h的表達量達到峰值，為對照組的27.88倍,隨之下降至24 h依舊顯著高于對照組，48 h與對照組無顯著性差異。極度高溫脅迫下大口黑鱸“優鱸3號”肝臟BCL-2的表達量1 h達到峰值，顯著高于對照組，之后顯著下降至48 h時BCL-2的表達量僅為對照組的0.04倍 (圖5)。

圖3 溫度脅迫對大口黑鱸“優鱸3號”肝臟Caspase3 mRNA 表達量的影響Fig.3 The effects of high-temperature stress on the relative expression of liver Caspase3 mRNA of M.salmoides “youlu No.3”

圖4 溫度脅迫對大口黑鱸“優鱸3號”肝臟Caspase9 mRNA 表達量的影響Fig.4 The effects of high-temperature stress on the relative expression of liver Caspase9 mRNA of M.salmoides “youlu No.3”

圖5 溫度脅迫對大口黑鱸“優鱸3號”肝臟BCL-2 mRNA 表達量的影響Fig.5 The effects of high-temperature stress on the relative expression of liver BCL-2 mRNA of M.salmoides “youlu No.3”

3 討論

溫度是影響魚類生存的重要環境因子之一，主要對魚類代謝反應起調控作用，進而能夠影響魚類的生理健康[19]。半胱氨酸蛋白酶(Caspase)家族是直接導致凋亡細胞解體的蛋白酶系統，在細胞凋亡機制中居核心地位[14]。本試驗結果顯示，作為凋亡的“起始者”[20]，Caspase9 的表達量和酶活力在37 ℃高溫脅迫后出現增加。作為凋亡的“執行者”[21]，Caspase3在正常條件下是以休眠的酶原形式存在于正常細胞中，當其受到凋亡信號刺激后可以裂解特異性的蛋白質底物導致細胞凋亡，它的活化是凋亡進入不可逆階段的標志[14,22]。本試驗的結果顯示，Caspase3的表達趨勢與 Caspase9幾乎是一致的，只是Caspase3顯著變化的時間稍晚于Caspase9，表明起始子Caspases9 水解激活了處于細胞調亡關鍵地位的Caspase3，而使調亡開啟。同樣的，當斑馬魚[23]在39 ℃高溫脅迫后，Caspase活性增加，相似的情況也在大西洋鮭魚(Salmosalar)[24]、日本牙鲆(Paralichthysolivaceus)[25]、草魚(Ctenopharyngodonidellus)[11]中發現，表明短期的急性升溫應激會導致細胞的細胞膜和蛋白質受到損傷，觸發激活凋亡相關系列基因的變化，從而誘導細胞發生凋亡，清除受損的細胞，來維持機體內環境的穩定[26]。但是隨著脅迫時間的延長Caspase3和Caspase9均出現一定的下降，同時肝臟組織損傷較為明顯，肝細胞排列無序、較多肝細胞均出現空泡化、細胞間界限雜亂模糊、細胞核萎縮，嚴重的甚至出現溶解，表現為細胞壞死[26]，然而草魚腎細胞在連續40高溫脅迫24 h則表現出胞質空泡化、細胞凋亡率持續上升，表明細胞凋亡還在持續進行[11]，造成這種情況的原因可能是連續的高溫刺激致使大口黑鱸肝臟失去自我調節能力，體內平衡被打破，最終導致Caspase表達量降低，造成細胞凋亡的過程中Caspase和ATP的減少，從而發展成為不可逆轉的細胞壞死，最后直至魚體死亡[11]。值得注意的是，在高溫脅迫后Caspase3和Caspase9在mRNA和酶活水平的變化并不一致，原因可能是長時間脅迫后導致總蛋白質濃度下降，從而使得基因表達下調[27]。另一方面，酶活屬于蛋白質的水平，基因從mRNA 水平到蛋白質水平，需要經過轉錄和翻譯兩大程序，期間還有蛋白質的修飾等程序的啟動，因此相對 mRNA 水平，基因在蛋白質水平的表達具有滯后性[28]。

BCL-2是BCL-2蛋白家族中主要的抑制調亡蛋白的代表，可以抑制細胞發生調亡提高細胞的存活率[11]。關于高溫脅迫后魚類BCL-2基因的研究報道較少，而在其他外源性刺激研究報道較多。在低氧4天(0.5 mg/L)的鯉(Cyprinuscarpio)的肝臟中檢測到BCL-2的表達量增加[29]，鎘脅迫后草魚肝臟BCL-2的表達量先升高再下降[30]，我們的試驗結果顯示，BCL-2的表達量在37℃高溫脅迫后1h出現峰值，表明BCL-2在抑制細胞凋亡過程中發揮作用。在脅迫6 h后BCL-2的表達量顯著降低，原因可能是高溫破壞了線粒體膜導致蛋白減少，細胞色素C釋放到胞外激活開啟了依賴于BAX的凋亡通路，使得BAX大量表達，致使BAX-BCL-2 異源二聚體被BAX-BAX同源二聚體取代，誘導細胞發生凋亡[31-32]。前期Caspase3和Caspase9基因表達量上升也可以印證這一點。同樣的，高溫誘導后尼羅羅非魚性腺細胞抑凋亡基因BCL-2持續下調，且在誘導后18天仍然能檢測到下調，說明抑凋亡基因可抑制細胞的凋亡[28]。另一方面，不少學者認為BCL-2可以通過發揮抗氧化作用來抑制凋亡的發生[11,12,33]。確實，我們的實驗結果也表明，在高溫脅迫后短時間內優鱸3號的SOD活力相較于對照組顯著升高[34]，這可能是機體在進行自我調節和自我保護來獲得生存。當脅迫時間延長至48 h時，BCL-2的表達量僅為對照組的0.04倍，原因可能是脅迫時間較長，超過魚體正常自我調節范圍，大量的 ROS 在細胞內堆積，造成細胞氧化損傷最終導致BCL-2表達量顯著降低，同時48 h時37 ℃組的存活率僅為50%也印證了這一點。因此，37 ℃可能已經成為大口黑鱸“優鱸3號”的極限溫度，在日常養殖生產中，需要密切關注池塘溫度的變化，減少溫度應激，增加魚體免疫力，同時做好應對高溫天氣的防護措施。