納米硫對鉛脅迫下油菜幼苗生長和鉛積累的影響

原海燕，劉清泉，張永俠，符佳豪，王銀杰，孫玉明，佟海英

（江蘇省中國科學院植物研究所（南京中山植物園），南京 210014）

隨著工農業的迅猛發展，環境重金屬污染給農業生產以及人類健康帶來的負面影響日益凸顯。據2014 年《全國土壤污染狀況調查公報》首次對全國土壤污染狀況調查顯示，全國土壤污染總超標率為16.1%，其中鉛（Pb）是我國土壤耕地主要重金屬污染和重點監控與防治的六種重金屬之一[1-2]。Pb 毒害抑制植物根系生長，阻礙植物對土壤養分元素的吸收，并引起植物體內一系列生理代謝紊亂，最終導致作物減產、品質下降[3-5]。土壤重金屬污染修復方法包括物理、化學以及生物修復等各種措施，其修復原理主要是通過物理、化學或生物的手段從污染的土壤或水體環境中移除重金屬或將重金屬固定在環境中降低其移動性和生物有效性從而降低其毒性[6-7]。鑒于污染農田土壤多屬于輕度污染以及我國人口多、耕地少的實際情況，選用操作簡單、成本低、見效快的原位鈍化生態修復技術降低植物對重金屬的吸收以及在食用部位的積累而進行邊修復邊生產具有重要的現實意義[8]。

納米顆粒（Nanoparticles，NPs）是特征尺寸在納米數量級（1～100 nm）的極細顆粒，因自身巨大的比表面積、強的催化和吸附等物化特性使其在環境重金屬污染修復領域的應用備受關注，在改善環境方面已被美國納米技術行動列為8 個交叉領域之一[9]，我國“十三五”規劃綱要中也明確提出大力發展納米功能材料。近年來，國內外一些學者研究表明納米顆粒還有益于植物的生長并可以緩解重金屬[10]、鹽[11]等非生物脅迫對植物造成的毒害，如，硅納米顆?？梢酝ㄟ^減少水稻鎘（Cd）、Pb 吸收和豌豆鉻（Cr）吸收而緩解重金屬對植物的傷害[12-13]。然而目前利用納米材料輔助植物修復方始起步，相關文獻報道較少,而尋求環境友好型的納米材料高效修復劑對于降低農作物重金屬積累、增加糧食安全具有重要的意義。

硫（S）是植物生長必需的大量營養元素，然而其在土壤中生物有效性較低。納米硫（SNPs）作為一種新興納米材料，因其具備的納米材料屬性使其較普通硫肥在農藥、醫藥、纖維工業等方面具有更廣泛的應用，也是農業上病蟲害防治的重要殺蟲劑和殺菌劑[14-15]。然而目前SNPs 對植物的效應評價國內外僅見Salem 等[16-18]采用葉片噴施SNPs 可顯著促進番茄和西葫蘆生長的相關報道，SNPs 對其他植物的影響或在重金屬污染修復領域的研究國內外鮮有報道。油菜（Brassica napusL.）為世界第二大油料作物，也是我國播種面積最大、分布最廣泛的經濟作物。因此，本文以油菜為研究材料，采用培養基培養試驗，研究Pb 脅迫下SNPs 對油菜生長、生物量、Pb 含量以及膜脂過氧化產物和抗氧化酶活性的影響，首次評估Pb 污染環境下SNPs 的生物效應和環境效應，為今后SNPs 在農業和農業環境領域的研究與應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

SNPs（99.99%，47 nm），購自美國納米材料研究公司；油菜種子（秦油10 號），購于江蘇省農業科學院。丙二醛（MDA）含量和抗氧化酶（超氧化物歧化酶SOD、過氧化氫酶CAT、過氧化物酶POD、抗壞血酸過氧化物酶APX）活性檢測試劑購于南京壽德試劑公司。

1.2 試驗設計

1.2.1 SNPs懸浮液的配制

無菌條件下稱取0.144 g SNPs 置于提前滅菌的裝有80 mL 去離子水的三角瓶中配制成母液，在超聲水浴鍋（KQ2200B，100 W，40 kHz，昆山超聲儀器公司）內超聲分散60 min形成穩定的納米懸浮液備用。

1.2.2 Pb溶液的配制

根據試驗所需Pb 質量分數，在無菌環境下準確稱取Pb（NO3）2倒入提前滅菌的裝有1.2 mL 去離子水的離心管中混勻備用。

1.2.3 含Pb和SNPs的1/2 MS培養基的配制

1/2 MS培養基滅菌后置于超凈工作臺中冷卻，待培養基凝固前迅速將一定體積SNPs 懸浮液和Pb 溶液加入到培養基中，快速搖勻分裝，每培養盒（220 mL）倒入60 mL 1/2 MS 培養基。Pb 濃度篩選試驗保證培養基中Pb濃度為0、0.6、1.2、1.5 mmol·L-1，共4個處理，分別記作Pb0、Pb0.6、Pb1.2、Pb1.5；Pb+SNPs 試驗共3 個處理，分別為CK（Pb 0，SNPs 0）、Pb（Pb 1.2 mmol·L-1）、Pb+SNPs（Pb 1.2 mmol·L-1+SNPs 300 mg·L-1）。以上處理均設置4次重復。

1.2.4 油菜種子的消毒和接種

將油菜種子依次用70%酒精消毒5 min，0.1%HgCl2消毒10 min，30%的次氯酸鈉溶液消毒20 min，滅菌的去離子水（DI H2O）清洗4～5 次，每次1 min，然后接種到1/2 MS培養基，每盒接種12 粒。

1.2.5 油菜的培養

將接種好的培養盒移至人工氣候箱中，在晝夜溫度24 ℃/21 ℃，光暗時間14 h/10 h，光強42 000 lx的條件下培養，生長10 d后收獲分析測定各指標。

1.2.6 不同形態S對油菜幼苗鮮質量和Pb積累的影響

為比較Pb 脅迫下大顆粒硫（SBPs）和硫酸鹽與SNPs 對油菜幼苗生長和Pb 積累的影響差異，設置Pb+不同 S 試驗，共 5 組處理，分別為 CK、Pb（Pb 1.2 mmol·L-1）、Pb+SNPs（Pb 1.2 mmol·L-1+SNPs 300 mg·L-1）、Pb+SBPs（Pb 1.2 mmol·L-1+SBPs 300 mg·L-1）、Pb+硫酸鹽（Pb 1.2 mmol·L-1+MgSO4·7H2O 300 mg·L-1），每處理 4 次重復。種子處理、SNPs 和 SBPs 的超聲懸浮、培養基配制、接種、培養均同上，10 d 后收獲分析測定植株鮮質量和Pb含量。

1.3 測定方法

1.3.1 生長指標測定

幼苗從培養基中取出后，仔細清洗掉根部培養基，并分別用自來水和去離子水沖洗4～5次，株高、根長使用直尺直接測量，然后將根系和地上部分開，一部分用液氮冷凍研成粉末后置于-80 ℃超低溫冰箱用于酶活測定，一部分置于烘箱內70 ℃連續干燥72 h烘至恒質量，測定干質量和Pb含量。

1.3.2 Pb含量測定

分別稱取約0.1 g根系和地上部干樣粉末，添加5 mL 硝酸采用兩步微波消解法消煮（Milestone ETHOS A，Italy）：1 000 W 升溫至 180 ℃約 10 min，1 000 W保持20 min，然后冷卻至50 ℃以下后取出消煮模塊，用去離子水定容至40 mL，用ICP-OES（PerkinElmer Optima 8000）測定Pb含量。

1.3.3 MDA和酶活測定

MDA 含量參照Tang 等[19]的硫代巴比妥酸（TBA）法測定；SOD 活性參照Beyer 等[20]的氮藍四唑（NBT）光化還原法測定；POD 活性參照 Jing 等[21]的愈創木酚法測定；CAT 活性參照Aebi[22]的紫外吸收法測定；APX 活性參照Nakano 等[23]的分光光度計法測定。

1.4 數據分析

采用Office 2007 和SPSS 11.5 軟件進行數據分析及差異顯著性檢驗，數據間的顯著性檢驗用單因素方差分析中的Duncan 方法，P＜0.05 表示差異顯著。所有數據均采用平均值±標準偏差來表示，采用Sigma-Plot 13.0進行數據繪圖。

2 結果與分析

2.1 Pb對油菜種子發芽和幼苗生長的影響

不同濃度Pb 對油菜種子萌發和幼苗生長的影響見圖1。從圖1A 可以看出，0～1.2 mmol·L-1Pb 對種子萌發沒有影響，種子萌發率均為100%，但是1.5 mmol·L-1高濃度Pb 脅迫下種子萌發率僅為67.3%。另外，高濃度Pb 對幼苗生長也產生了嚴重的抑制作用（圖1B），對不同Pb 濃度下油菜鮮質量的分析表明，0.6～1.5 mmol·L-1Pb 均顯著降低了油菜的鮮質量（P＜0.05），其中，1.2 mmol·L-1Pb 濃度下幼苗整株鮮質量較CK顯著降低38.9%。

2.2 Pb脅迫下SNPs對油菜生長的影響

Pb 脅迫及Pb 脅迫下SNPs 對油菜生長的影響見圖2。由圖2A 和圖2B 可以看出，1.2 mmol·L-1Pb 顯著抑制了根系和地上部的生長，尤其根系的伸長生長嚴重受抑（P＜0.05），株高和根長分別較 CK 下降50.4%和90.2%，地上部和根系干質量分別下降40.7%和31.7%。添加SNPs后Pb對油菜幼苗的毒性被極大緩解，株高、根長幾乎接近CK 水平，地上部和根系干質量分別較Pb 單一處理增加70.7%和26.1%，根系較CK 僅下降13.9%（P＞0.05），地上部略高于CK（圖2C和圖2D）。

2.3 SNPs對油菜不同部位Pb含量的影響

SNPs 對油菜根系和地上部Pb 含量和Pb 積累量的影響如圖3 所示。相較于Pb 單一處理，1.2 mmol·L-1Pb 脅迫下添加300 mg·L-1SNPs 可顯著降低油菜根系和地上部的Pb含量和Pb積累量。Pb+SNPs共處理下油菜地上部和根系Pb 含量分別僅為Pb 單一處理下相應部位Pb 含量的5.7%和29.5%；單株Pb 積累量分別僅為Pb 單一處理下相應部位Pb 積累量的9.7%和36.4%。

2.4 Pb脅迫下SNPs對油菜MDA含量的影響

Pb脅迫下SNPs對油菜不同部位膜脂過氧化產物MDA含量的影響見圖4。由圖4可知，1.2 mmol·L-1Pb對油菜幼苗的脅迫效應非常顯著，脅迫造成嚴重的膜脂過氧化，其產物MDA 含量顯著增加，地上部和根系MDA含量分別為CK的3.7倍和2.5倍（P＜0.05）。而添加外源SNPs 可顯著緩解Pb 對油菜幼苗造成的脅迫，Pb+SNPs 共處理下油菜地上部和根系MDA 含量分別為CK的1.8倍和1.6倍，較單一Pb處理顯著下降，僅為單一Pb處理下的51.2%和65.8%（P＜0.05），SNPs有效緩解了Pb對油菜細胞膜脂造成的氧化脅迫傷害。

2.5 Pb脅迫下SNPs對油菜抗氧化酶活性的影響

Pb 脅迫下 SNPs 對油菜抗氧化酶SOD、POD、CAT和APX 活性的影響如圖5 所示。由圖5 可以看出，1.2 mmol·L-1Pb 單一脅迫誘導油菜根系和地上部SOD、POD、CAT 和APX 活性均不同程度增加，其中地上 部 SOD、POD、CAT 和 APX 活 性 顯 著 高 于 CK 59.2%、305.3%、69.2%和86.9%（P＜0.05），根系POD、APX 活性較 CK 也顯著增加 55.8% 和 51.2%，SOD 和CAT 活性增加不顯著。與Pb 單一處理不同，Pb 脅迫下添加SNPs 后根系和地上部SOD、POD、CAT 和APX活性均低于Pb 單一處理下相應酶活，地上部SOD、POD、CAT 和APX 活性分別較Pb 單一處理分別顯著（POD 除外）降低30.4%、31.5%、30.6%和31.0%，根系中4種酶活下降1.2%～13.5%，下降程度不顯著。

2.6 Pb脅迫下不同S對油菜生長和Pb積累的影響

Pb 脅迫下SNPs、SBPs 以及硫酸鹽對油菜生長和Pb 積累的影響見圖6。由圖6A 和圖6B 可知，與單一Pb 脅迫相比，Pb 脅迫下添加不同形態S 均顯著促進了油菜的生長。但與SNPs 相比，Pb 脅迫下添加同濃度的SBPs 和硫酸鹽對油菜生長的促進作用相對較弱，植株鮮質量分別較單一Pb 脅迫增加65.5%和94.6%，而添加SNPs 植株鮮質量較單一Pb 脅迫增加145.5%，分別是同濃度SBPs 和硫酸鹽處理下幼苗鮮質量的1.48 倍和1.26 倍。對Pb 脅迫下添加SBPs 以及硫酸鹽處理后幼苗地上部和根系Pb含量的分析表明，與單一Pb 脅迫相比，Pb 脅迫下添加不同形態S 均顯著降低了油菜對Pb 的吸收，Pb 脅迫下添加同濃度的SBPs 和硫酸鹽使油菜幼苗地上部Pb 含量分別下降28.6%和44.1%，根系Pb 含量分別下降73.5%和53.5%，但不同組織Pb含量水平顯著高于添加同濃度SNPs處理下相應組織Pb含量（圖6C）。

3 討論

已有大量研究表明，環境中過量的重金屬會對植物水分代謝、礦質營養平衡、光合作用、形態建成等造成不可逆的生理毒害[24-26]。本研究也表明，培養基中高濃度Pb顯著抑制了油菜種子萌發以及根系和地上部的生長，其中根系生長受抑制程度較地上部更為明顯，1.2 mmol·L-1Pb 脅迫下根長較CK 下降約 90%，根系伸長生長幾乎完全受抑。根系作為植物與環境直接接觸的界面，是感受逆境信號最直接的器官，進入細胞內的Pb 可與酶活性中心或蛋白質中的巰基結合，取代金屬蛋白中的必需金屬離子，從而導致蛋白質大分子構象改變、酶活性喪失、干擾細胞的正常生理代謝[27]。本研究中1.2 mmol·L-1Pb 脅迫下油菜地上部和根系Pb 含量分別達1 006、25 628 μg·g-1，遠超過報道中普通植物承受Pb濃度的閾值，因此，油菜體內高Pb累積是造成其生長受阻的直接原因。

MDA 是植物細胞膜脂過氧化的重要產物，也是評價細胞損傷程度的重要指標。如秦建橋等[28]報道，隨著Pb 處理濃度的增加，五節芒葉片中MDA 含量大幅度升高；Khan 等[29]也報道 100～500 μmol·L-1Pb 處理導致蓖麻體內MDA 含量顯著升高。本研究也表明1.2 mmol·L-1Pb 脅迫10 d 導致油菜地上部和根系MDA 含量增加，為 CK 的 3.7 倍和 2.5 倍，這可能是由于Pb 脅迫下油菜體內Pb 的大量積累導致植物體內產生的自由基未能及時清除而造成細胞膜脂嚴重氧化和細胞受損。植物防御重金屬毒害由不同的機制和過程組成，其中抗氧化酶類在植物抵御氧化脅迫、限制活性氧自由基產生中發揮著重要作用。本研究中，Pb 單一脅迫誘導油菜根系和地上部SOD、POD、CAT 和APX 抗氧化酶活性均不同程度增加，其中地上部 SOD、POD、CAT 和 APX 活性均顯著高于 CK。Singh 等[30]對印度次藻（Najas indica）的研究表明，Pb脅迫導致MDA 含量的增加，伴隨著氧化損傷的增強，同時植物自身抗氧化防御機制抗氧化酶活明顯提高，與本研究報道結果一致。

納米材料因特殊的理化性質被應用于重金屬污染廢水處理的研究已見諸多報道。但目前利用納米材料輔助植物修復重金屬污染土壤的研究甚少。S是植物生長必需的大量元素，目前國內外尚無利用S納米顆粒輔助植物修復的相關研究報道。本研究表明，Pb脅迫下添加SNPs后油菜地上部和根系Pb含量僅為Pb 單一處理下相應部位Pb 含量的5.7% 和29.5%；單株Pb 積累量僅為Pb 單一處理下相應部位Pb 積累量的9.7%和36.4%，SNPs 可大幅降低油菜對Pb 的吸收和向地上部的轉運。同時，SNPs 在降低Pb積累的同時使地上部和根系生物量大幅提高，株高、根長幾乎接近于CK 水平。Ali 等[31]對小麥的研究表明，Cd 脅迫下小麥幼苗葉片噴施Si 納米顆粒使地上部、根系、籽粒Cd 含量分別較對照下降16%～58%、19%～64%和20%～82%，同時干質量分別增加24%～69%、14%～59%和31%～96%。Li 等[32]研究表明不同濃度α-MnO2納米顆粒處理可有效降低水稻對生物有效態As 的吸收和向地上部的轉運。Huang 等[33]和Hussain 等[34]學者最近也報道了納米Fe3O4和納米Fe有效降低植物吸收重金屬并促進植物生長的相關研究結果。

SNPs 極大地緩解了Pb 對油菜的毒害，就目前研究結果其解毒機制主要與植物體內重金屬積累量和膜脂過氧化程度密切相關。本研究中，Pb+SNPs共處理下地上部和根系Pb 含量大幅下降，尤其地上部Pb含量和積累量不足單一Pb 脅迫的10%。另外，Pb+SNPs 共處理下油菜地上部和根系膜脂過氧化產物MDA 含量僅為單一Pb 處理下的51.2%和65.8%。Castiglionea 等[35]對蠶豆（Vicia faba）的研究表明，與對照相比，TiO2顯著增加了H2O2積累，而TiO2NPs 處理下H2O2積累水平明顯下降，H2O2含量比對照降低44.3%，同時抗氧化酶POD 和CAT 活性也低于對照，尤其CAT 活性低于對照47.5%，且粒徑越小，膜脂過氧化程度越低，可能由于納米顆粒TiO2粒徑越小，比表面積越大，清除自由基的能力越強。本研究中，Pb脅迫下添加SNPs 后根系和地上部SOD、POD、CAT 和APX 活性也均低于Pb 單一處理誘導的相應酶活，這可能是由于Pb+SNPs 共處理下油菜對Pb 的吸收積累以及Pb 積累造成的細胞氧化損傷遠低于Pb 單一處理，與有關學者對水稻[36]、龍葵[37]、蠶豆[38]等不同作物的研究結果相似。

另外，通過研究比較不同形態S 對油菜Pb 積累的影響表明，3 種不同形態S 均顯著降低了油菜對Pb的吸收和Pb 對植物的毒害。關于S 降低植物吸收重金屬和促進植物生長已有大量文獻報道，如劉家豪等[39]對水稻Cd 吸收的研究表明，水稻葉面噴施Na2S可以將水稻產量提高6%～30%，水稻籽粒中Cd 含量降低28%～50%。Yang等[40]在S對水稻Pb吸收的影響研究中也表明，30 mg·kg-1S（Na2SO4）顯著降低了水稻地上部莖稈和籽粒中的Pb 含量，其機理可能是充足的S 供應增加了水稻根系鐵膜的形成，從而降低了土壤中Pb 的生物有效性，進而減少了Pb 在植物體內的積累。但也有文獻報道外源施加S 可增加重金屬的生物活性從而提高植物修復效率，如Wang 等[41]研究表明土壤中施加S 可顯著提高土壤中可溶性銅（Cu）和鋅（Zn）的比例，增加Cu 超積累植物海州香薷根系和地上部Cu 的積累。本研究中，不同形態S 均具有降低油菜Pb 吸收的作用，但SNPs 效果最顯著，其機制一方面可能是SNPs 可與Pb 離子形成PbS 而降低Pb 的生物活性，另一方面SNPs 大的比表面積和強的吸附能力較普通大顆粒硫和硫酸鹽更容易吸附固定介質中的Pb 離子，從而降低根系對自由態Pb 離子的吸收。

4 結論

（1）單一Pb脅迫下油菜幼苗株高、根長、生物量均大幅降低，膜脂過氧化產物MDA 含量急劇增加，抗氧化酶SOD、POD、CAT和APX活性不同程度增加，Pb脅迫對油菜生理代謝和生長均造成了較大的負面影響。

（2）Pb 脅迫下添加SNPs 大幅降低了油菜根系對Pb 的吸收以及向地上部的轉移，并極大地緩解了Pb對油菜幼苗的毒害。與單一Pb 脅迫相比，MDA 含量顯著下降，株高、根長和生物量等生長參數均顯著增加。較普通大顆粒硫和硫酸鹽相比，SNPs 具有更強的Pb阻控效果。