土施納米氧化鋅對(duì)蚯蚓生理和黃瓜幼苗生長(zhǎng)的影響

楊靜雅，符倩，張皓月，彭晴晴，鐘民正，毛暉*

（1.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部西北植物營(yíng)養(yǎng)與農(nóng)業(yè)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 楊凌 712100；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

鋅參與人體內(nèi)200 多種酶和蛋白質(zhì)的組成，作為許多酶的催化劑，是人體必需的微量元素。目前，世界人口鋅缺乏是一個(gè)全球性的健康問(wèn)題，主要原因是鋅攝取量低。因此，越來(lái)越多研究致力于食品增鋅，希望通過(guò)增加作物鋅含量來(lái)提高人體對(duì)鋅的攝入量。施用鋅肥作為一種普遍應(yīng)用的方法，可在短期內(nèi)有效增加作物鋅含量，同時(shí)也可以增加土壤有效鋅含量，為生物強(qiáng)化奠定基礎(chǔ)。近年來(lái)，作為生產(chǎn)量位居世界第三的金屬納米材料，納米氧化鋅（Zinc oxide nanoparticles，ZnO NPs）在農(nóng)業(yè)方面的應(yīng)用越來(lái)越受到重視，且增鋅效果已初見(jiàn)成效[1-3]。然而，廣泛大規(guī)模的使用，在給人類帶來(lái)巨大利益的同時(shí)也存在著潛在風(fēng)險(xiǎn)。ZnO NPs 的生產(chǎn)、使用和處置，使其最終不可避免地進(jìn)入環(huán)境中，影響生態(tài)環(huán)境及生物健康。尤其是在土壤環(huán)境中，ZnO NPs 作為鋅肥和殺蟲(chóng)劑廣泛使用[4-5]，其生物安全性及潛在影響已不容忽視。

近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明，ZnO NPs 的獨(dú)特性質(zhì)會(huì)使其毒性增加。Xiang 等[6]研究發(fā)現(xiàn)1～80 mg·L-1的ZnO NPs 溶液明顯抑制了白菜根的伸長(zhǎng)。Hira等[7]證實(shí)了NPs 對(duì)黑菜萌發(fā)和莖部生長(zhǎng)的影響。He等[8]研究了ZnO NPs 在線蚓中的動(dòng)態(tài)積累和毒性效應(yīng)，通過(guò)計(jì)算ZnO NPs 懸浮液中的Zn2+濃度，發(fā)現(xiàn)懸浮液中以 NPs 顆粒為主，而不是 Zn2+。?wi?tek 等[9]發(fā)現(xiàn)在暴露于ZnO NPs 污染土壤中48 h后，蚯蚓腸道上皮受到一定程度的損傷。Alves 等[10]研究發(fā)現(xiàn)，ZnO NPs 超過(guò)400 mg·kg-1時(shí)會(huì)對(duì)蚯蚓的繁殖率產(chǎn)生毒性影響，而濃度大于4 000 mg·kg-1時(shí)會(huì)對(duì)彈尾蟲(chóng)的繁殖率產(chǎn)生顯著影響。因此，研究ZnO NPs 對(duì)土壤生態(tài)環(huán)境的毒理效應(yīng)是一個(gè)越來(lái)越受到科學(xué)關(guān)注的重要課題，可以為評(píng)估ZnO NPs 對(duì)土壤帶來(lái)的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)提供依據(jù)。

黃瓜是一種富含多種營(yíng)養(yǎng)元素的蔬菜，具有生長(zhǎng)速度快、對(duì)鋅濃度的響應(yīng)較好的特點(diǎn)[11]。黃瓜葉片面積較大，蒸騰速率高，比其他糧食作物的需水量大，這意味著黃瓜幼苗可能對(duì)納米顆粒的吸收更大，導(dǎo)致ZnO NPs 顆粒可能通過(guò)食物鏈對(duì)人體帶來(lái)健康風(fēng)險(xiǎn)。作為一種重要的土壤動(dòng)物，蚯蚓約占土壤動(dòng)物生物總量的60%～80%[12]，參與土壤有機(jī)質(zhì)的分解、養(yǎng)分循環(huán)利用，且能促進(jìn)微生物的生命活動(dòng)[13]。有研究表明，蚯蚓具有體積大、生物量高等特征，且相比其他土壤無(wú)脊椎動(dòng)物更易受到金屬污染影響，適宜作為反映土壤質(zhì)量的生物指示物，廣泛用于重金屬污染和食物鏈傳遞的生態(tài)毒理學(xué)研究[14]，其存活率、抗氧化酶活性、抗氧化物質(zhì)含量等是重要的生物標(biāo)志物，可以有效地反映土壤的健康和安全狀況[12]。赤子愛(ài)勝蚓繁殖率高、適應(yīng)性強(qiáng)，是國(guó)際上蚯蚓毒性試驗(yàn)常用的品種。現(xiàn)有的研究發(fā)現(xiàn)，蚯蚓能有效降低土壤環(huán)境中污染物的毒性作用，促進(jìn)作物的生長(zhǎng)。Jiang 等[15]研究指出，蚯蚓能抵抗納米顆粒對(duì)番茄植株產(chǎn)生毒性，通過(guò)增強(qiáng)植物的抗逆性來(lái)幫助植物應(yīng)對(duì)納米顆粒的脅迫。Mkhinini 等[16]也發(fā)現(xiàn)，蚯蚓能夠顯著促進(jìn)廢水灌溉后的蠶豆植株的生長(zhǎng)，保護(hù)作物抵抗氧化應(yīng)激。

目前，有關(guān)ZnO NPs 對(duì)蚯蚓的毒性效應(yīng)已有相關(guān)報(bào)道，但大部分研究都采用非天然土壤介質(zhì)[17]或單一的培養(yǎng)體系[14]，忽略了土壤系統(tǒng)中植物的存在，這種做法可能導(dǎo)致與自然環(huán)境條件下所觀察到的毒性作用明顯不同。土壤是一個(gè)非常復(fù)雜的系統(tǒng)，具有多種生物種群。土壤性質(zhì)和系統(tǒng)多樣性在很大程度上決定著ZnO NPs 的環(huán)境行為、土壤中的鋅形態(tài)及其生物利用度，因此無(wú)法正確、全面地評(píng)估ZnO Nps 的生態(tài)毒性。此外，有關(guān)ZnO NPs 在自然種植系統(tǒng)中的毒性研究未見(jiàn)報(bào)道。綜上所述，本研究采用盆栽試驗(yàn)，評(píng)估ZnO NPs 作為新型肥料，在自然土壤中對(duì)黃瓜幼苗生長(zhǎng)、蚯蚓生理的影響，以期為評(píng)價(jià)ZnO NPs對(duì)土壤環(huán)境中的作物生長(zhǎng)及動(dòng)物安全的影響提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)試劑

試驗(yàn)所用試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所，納米氧化鋅（ZnO NPs，粒徑70±10 nm，純度＞99.6%）購(gòu)自山東宏升材料科技有限公司。

1.1.2 供試動(dòng)物

赤子愛(ài)勝蚓（Eisenia fetida）購(gòu)于河北石家莊某養(yǎng)殖場(chǎng)，在試驗(yàn)開(kāi)始前馴化一周，選取體型飽滿、色澤鮮艷、環(huán)帶發(fā)育健康的蚯蚓進(jìn)行試驗(yàn)。

1.1.3 供試作物

供試作物品種為對(duì)鋅敏感的蔬菜黃瓜（亮優(yōu)106）。在試驗(yàn)開(kāi)始前先進(jìn)行發(fā)芽，4 d后移栽，發(fā)芽期不做任何處理。

1.1.4 供試土壤

供試土壤采自陜西省咸陽(yáng)市永壽縣御駕宮鎮(zhèn)御中村農(nóng)田耕作層（北緯34°49′，東經(jīng)108°11′，海拔1 127 m），年平均降雨量為610 mm，平均氣溫為10.2 ℃，無(wú)霜期210 d。隨機(jī)采集表層土壤（15～20 cm），自然風(fēng)干后過(guò)2 mm 網(wǎng)篩。土壤基本理化性質(zhì)如表1所示。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本研究以盆栽試驗(yàn)的形式進(jìn)行。在整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中，平均日溫度為25 ℃，平均夜溫度為20 ℃，平均每日光照時(shí)間為16 h，相對(duì)濕度為65%，土壤濕度約為田間最大持水量的60%。

現(xiàn)階段，預(yù)測(cè)環(huán)境中工程納米顆粒（ENP）的濃度仍然存在許多阻礙問(wèn)題。根據(jù) Jos′ko[18]和 Sun 等[19]的研究表明，土壤和污泥中ZnO NPs 的濃度分別為10～100、17～110 mg·kg-1，且自然土壤中ZnO NPs 的含量每年以0.06 μg·kg-1的速度逐漸增加[19]。雖然該預(yù)估值遠(yuǎn)小于現(xiàn)有研究得出的對(duì)土壤環(huán)境產(chǎn)生毒性效應(yīng)的濃度，但隨著納米技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，ZnO NPs 的環(huán)境濃度會(huì)快速增加，當(dāng)其累計(jì)到一定程度就會(huì)對(duì)土壤環(huán)境造成威脅。基于此，本試驗(yàn)選擇了更高的濃度來(lái)預(yù)測(cè)其在土壤環(huán)境中的毒性效應(yīng)，試驗(yàn)共設(shè)置4個(gè)濃度梯度（mg·kg-1）：0（CK）、50（Z50）、500（Z500）、1 000（Z1000），以純鋅計(jì)量。按N 46 mg·kg-1、P2O539 mg·kg-1、K2O 93 mg·kg-1作為基肥施入，與土壤充分混勻。每組濃度設(shè)置16 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)加入2 kg 供試土壤，移栽3 株幼苗。其中，8 個(gè)重復(fù)加蚯蚓（SE），蚯蚓添加量為每盆20 條，另8 個(gè)處理不加蚯蚓（S）。培養(yǎng)28 d后將蚯蚓和黃瓜幼苗取出，用超純水將蚯蚓沖洗干凈，放于25 ℃培養(yǎng)箱中過(guò)夜吐泥，備用。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.3.1 蚯蚓的分析方法

準(zhǔn)確稱取待測(cè)組織的質(zhì)量，按質(zhì)量（g）∶體積（mL）=1∶9 的比例加入 9 倍體積的生理鹽水，冰水浴條件機(jī)械勻漿，2 500 r·min-1離心10 min，取上清液，即為10%的組織勻漿，用于蛋白定量（TP）、超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、過(guò)氧化物酶（POD）、丙二醛（MDA）的測(cè)定。具體測(cè)定方法和步驟按照相應(yīng)的試劑盒進(jìn)行。其中，SOD 測(cè)定采用羥胺法，CAT 測(cè)定采用紫外法，POD 測(cè)定采用比色法，MDA測(cè)定采用TBA法，TP測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法。

用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為68%的濃HNO3對(duì)干燥的蚯蚓樣品進(jìn)行微波消解，AAS測(cè)定鋅含量。

1.3.2 黃瓜的分析方法

黃瓜幼苗收獲后，分別稱取地上部和地下部的鮮質(zhì)量，并計(jì)算總生物量。根部用0.01 mol·L-1HNO3清洗，再用去離子水沖洗3 次后吸干表面水分。根系活力測(cè)定采用氯化三苯基四氮唑（TTC）法，SOD 測(cè)定采用NBT 光還原法，POD 測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚比色法，CAT 測(cè)定采用紫外法，MDA 測(cè)定采用 TBA 法，鋅含量采用AAS進(jìn)行分析測(cè)定。

1.4 質(zhì)量控制與質(zhì)量保證

本研究中使用的化學(xué)試劑均為優(yōu)級(jí)純?cè)噭２捎媒?jīng)認(rèn)證的標(biāo)準(zhǔn)參考材料[GBW10046（GSB-24）]驗(yàn)證分析過(guò)程的準(zhǔn)確性，平均回收率為93%。在分析過(guò)程中，每測(cè)定20個(gè)樣品進(jìn)1次標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行質(zhì)量控制。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理采用SPSS 19.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用LSD法進(jìn)行多重比較，顯著性水平為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 ZnO NPs對(duì)蚯蚓的影響

2.1.1 對(duì)存活率的影響

從表2 可以看出，在28 d 的培養(yǎng)周期中，不同濃度的ZnO NPs 處理均未對(duì)蚯蚓的存活率產(chǎn)生顯著影響，且存活率均大于87%，表明蚯蚓對(duì)ZnO NPs 具有較強(qiáng)的耐受性。

表1 基地土壤基本理化性質(zhì)Table 1 Basic physical and chemical properties of base soil

表2 ZnO NPs對(duì)蚯蚓存活率的影響Table 2 Effects of ZnO NPs on earthworm survival rate

2.1.2 對(duì)抗氧化酶活性和MDA含量的影響

SOD 是一種天然的氧自由基清除劑，在整個(gè)酶促防御系統(tǒng)中占有重要地位。從圖1（A）可以看出，與對(duì)照組相比，SOD 活性有增加的趨勢(shì)，尤其是50、1 000 mg·kg-1處理組，分別較對(duì)照提高了16.6%、16.5%，但未達(dá)到顯著水平。在圖1（B）中，與對(duì)照相比，不同濃度 ZnO NPs 處理中，CAT 活性在 50、500 mg·kg-1略微降低，在高濃度逐漸恢復(fù)至超過(guò)對(duì)照水平，較對(duì)照增加了25.7%，但仍未達(dá)到顯著水平。如圖1（C）所示，在不同濃度 ZnO NPs 處理下，POD 活性變化差異顯著。在50、500 mg·kg-1時(shí)分別較對(duì)照顯著降低了29.7%、21.9%，但在高濃度時(shí)逐漸恢復(fù)至對(duì)照水平，這與CAT 活性變化趨勢(shì)相似，表明POD 和CAT具有協(xié)同清除H2O2的作用[20]。

MDA 是自由基引發(fā)的脂質(zhì)過(guò)氧化作用的最終分解產(chǎn)物，其含量的多少可間接反映ROS 對(duì)機(jī)體的損傷程度。本試驗(yàn)中，隨著處理濃度增加，MDA 含量有增加的趨勢(shì)，在濃度為1 000 mg·kg-1時(shí)變化顯著，達(dá)到3.22 nmol·mg-1，較對(duì)照提高了19.2%。

2.1.3 對(duì)組織鋅含量的影響

鋅是蚯蚓生長(zhǎng)、成熟和繁殖所必需的基本元素，因此代謝過(guò)程中需要一定水平的鋅元素。從表3 可以看出，與對(duì)照相比，隨著ZnO NPs處理濃度增加，蚯蚓體內(nèi)的鋅含量有增加的趨勢(shì)，但沒(méi)有顯著差異，總體維持在201.91～212.26 mg·kg-1的水平。

2.2 對(duì)黃瓜的影響

2.2.1 對(duì)幼苗生長(zhǎng)的影響

從表4 可以看出，不同濃度ZnO NPs 處理下，黃瓜的生物量發(fā)生了顯著變化。在未添加蚯蚓的處理中，隨著ZnO NPs 濃度的增加，黃瓜的生物量先增加后降低。50 mg·kg-1處理顯著促進(jìn)了幼苗生長(zhǎng)，此時(shí)生物量最大，為15.81 g，相比對(duì)照增加了33.1%；在500 mg·kg-1和1 000 mg·kg-1處理中，生物量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，但與對(duì)照相比未達(dá)到顯著水平。同樣，黃瓜幼苗的根系活力也呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)。在ZnO NPs濃度為50 mg·kg-1時(shí)，根系活力顯著增加，高達(dá) 25.50 mg·g-1·h-1，是對(duì)照的 2.1 倍。隨著處理濃度的增加，根系活力又降低至對(duì)照水平，其變化趨勢(shì)與生物量一致。

表3 ZnO NPs對(duì)蚯蚓組織鋅含量的影響Table 3 Effects of ZnO NPs on Zn content in earthworm tissues

表4 ZnO NPs對(duì)黃瓜幼苗生物量及根系活力的影響Table 4 Effects of ZnO NPs on biomass and root activity of cucumber seedlings

觀察同濃度ZnO NPs 處理下蚯蚓對(duì)黃瓜幼苗生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)作用，發(fā)現(xiàn)在添加蚯蚓后，生物量和根系活性均顯著提高。其中，生物量分別是未添加蚯蚓時(shí)的1.99、1.35、2.47、2.65 倍，根系活力是未添加蚯蚓時(shí)的3.68、1.37、3.04、3.56 倍，說(shuō)明蚯蚓極大地促進(jìn)了黃瓜幼苗的生長(zhǎng)。

2.2.2 對(duì)抗氧化酶活性和MDA含量的影響

當(dāng)受到環(huán)境污染物等非生物脅迫時(shí)，植物體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生過(guò)多的ROS，從而激活細(xì)胞中去除ROS 的抗氧化機(jī)制，防止ROS 的潛在毒性危害。SOD、CAT、POD等能清除代謝過(guò)程中產(chǎn)生的ROS，使其處于一個(gè)較為穩(wěn)定的水平。

圖2 是ZnO NPs 對(duì)黃瓜幼苗的抗氧化酶活性及MDA 含量的影響。在未加蚯蚓的處理中，如圖2（A）所示，隨著ZnO NPs 濃度的增加，SOD 活性先增加后降低，均顯著高于對(duì)照組。在500 mg·kg-1ZnO NPs處理中，SOD 活性最大，為 3.22 U-1·g-1·min-1，是對(duì)照組的3.7倍；50 mg·kg-1和1 000 mg·kg-1分別是對(duì)照組的2.45、1.83 倍。在圖2（B）中，隨著ZnO NPs 處理濃度的增加，CAT 活性逐漸增加，但低濃度處理未達(dá)到顯著水平；500 mg·kg-1和1 000 mg·kg-1分別較對(duì)照增加了131.1%、127.0%。圖2（C）中，與對(duì)照相比，在50、500 mg·kg-1處理中，POD 活性均未發(fā)現(xiàn)明顯變化，但1 000 mg·kg-1處理組的 POD 活性顯著增加，達(dá)2 854.58 U-1·g-1·min-1，比對(duì)照增加了22.4%。如圖2所示，研究同濃度ZnO NPs 處理中是否添加蚯蚓對(duì)黃瓜幼苗抗氧化酶活性的影響，結(jié)果表明在添加蚯蚓后，除對(duì)照外，SOD活性在低、中、高濃度中均降低，在500 mg·kg-1和1 000 mg·kg-1處理中，SOD 活性變化顯著，不加蚯蚓處理組的SOD 活性是添加蚯蚓的4.29、2.74倍。在對(duì)照組和低濃度處理下，添加蚯蚓可使黃瓜幼苗的CAT 活性增加，且低濃度處理組差異顯著，是不加蚯蚓的1.77倍；但在中、高濃度下，添加蚯蚓對(duì)CAT 活性影響較小。對(duì)于植株P(guān)OD 活性來(lái)說(shuō)，在對(duì)照組和所有ZnO NPs 處理組中，添加蚯蚓后均未對(duì)POD活性造成顯著影響。

ZnO NPs 對(duì)黃瓜幼苗 MDA 含量的影響如圖2（D）所示。在不加蚯蚓的處理中，隨著ZnO NPs 濃度的增加，MDA 含量有增加的趨勢(shì)，1 000 mg·kg-1處理組增加達(dá)到顯著水平，相比對(duì)照增加了34.1%。在同濃度ZnO NPs 處理中，500 mg·kg-1和 1 000 mg·kg-1濃度下，添加蚯蚓后的MDA 含量較未添加蚯蚓時(shí)有降低的趨勢(shì)，在1 000 mg·kg-1處理中達(dá)到顯著水平，僅為不加蚯蚓處理的76.3%。

2.2.3 對(duì)鋅含量的影響

圖3 為黃瓜幼苗地上部和地下部的鋅含量。在不加蚯蚓的處理中，隨著ZnO NPs 處理濃度增加，地上部和地下部的鋅含量顯著增加。其中，地上部鋅含量分別是對(duì)照的2.79、6.38、8.30 倍，地下部分別是對(duì)照的1.31、3.72、6.19 倍。同一濃度的兩種處理中，在添加蚯蚓后，不管是地上部還是地下部鋅含量均有降低的趨勢(shì)，說(shuō)明蚯蚓可能會(huì)影響黃瓜幼苗對(duì)ZnO NPs的吸收。

3 討論

3.1 對(duì)蚯蚓生理的影響

本研究結(jié)果表明，即使在1 000 mg·kg-1ZnO NPs處理中，蚯蚓的存活率也大于87%。同樣，在García-Gómez 等[21]的研究中，觀察到蚯蚓在 1 000 mg·kg-1ZnO NPs 處理中培養(yǎng)28 d 后未發(fā)生死亡現(xiàn)象。Alves等[10]也發(fā)現(xiàn)，ZnO NPs濃度達(dá)到4 000 mg·kg-1，蚯蚓在土壤中的存活率大于90%。以往的研究表明在自然土壤中，ZnO NPs 對(duì)蚯蚓的死亡率沒(méi)有顯著影響，證實(shí)了其生長(zhǎng)狀況和死亡率不受土壤中分散的NPs 的影響[14]。這可能是因?yàn)轵球灸軌蜃晕倚迯?fù)，對(duì)ZnO NPs有一定的耐受機(jī)制。這說(shuō)明在本研究中，以存活率為指標(biāo)來(lái)表征ZnO NPs 的毒性有限。這種毒害作用可能不會(huì)直接造成蚯蚓死亡，但會(huì)導(dǎo)致生物體的紊亂和疾病[10]。因此，還需關(guān)注其他生理指標(biāo)，如抗氧化酶和MDA含量的變化等。

生物對(duì)環(huán)境脅迫的生物化學(xué)反應(yīng)被認(rèn)為是環(huán)境污染的早期警告指數(shù)，許多酶活性已被認(rèn)為是環(huán)境污染的生物標(biāo)志物。暴露于環(huán)境污染物的生物體中會(huì)產(chǎn)生活性氧（ROS），過(guò)量ROS 能氧化誘導(dǎo)破壞脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸，從而干擾細(xì)胞的正常功能。氧化應(yīng)激在NPs誘導(dǎo)的毒性影響中起著關(guān)鍵性的作用，可激活抗氧化酶活性，如SOD、CAT、POD 等。在本試驗(yàn)中，隨著ZnO NPs 處理濃度的增加，與對(duì)照相比，蚯蚓的SOD、CAT 和POD 活性大多未發(fā)生顯著性變化，但呈現(xiàn)出不同的變化趨勢(shì)。Bao 等[22]研究了ZnO NPs 對(duì)蚯蚓的影響，發(fā)現(xiàn)在400 mg·kg-1處理下，其SOD 活性與對(duì)照無(wú)顯著差異，這與本試驗(yàn)結(jié)果一致，表明高濃度處理雖未對(duì)蚯蚓產(chǎn)生明顯毒害作用，但在一定程度上誘導(dǎo)了ROS 的產(chǎn)生，激活SOD 作為抵抗氧化應(yīng)激的機(jī)制。分析原因可能與供試土壤呈堿性有關(guān)。在堿性條件下，ZnO NPs 不易水解，即產(chǎn)生的Zn2+較少，而Zn2+是造成納米毒性的主要原因[23]，并且土壤的pH 值隨ZnO NPs 處理濃度的增加而升高，導(dǎo)致NPs 更易聚集成微米級(jí)別顆粒，從而降低影響。胡長(zhǎng)偉等[24]采用濾紙法研究了ZnO NPs 對(duì)蚯蚓的毒性效應(yīng)，結(jié)果表明隨著處理濃度的增加，CAT 活性均接近對(duì)照組，CAT反應(yīng)不敏感，這與本試驗(yàn)結(jié)果相似。在50 mg·kg-1和500 mg·kg-1處理下，CAT活性有降低的趨勢(shì)可能是因?yàn)轵球倔w內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)的介入，快速消除了ROS，故CAT活性并未增強(qiáng)。有研究表明重金屬可以占據(jù)CAT 活性位點(diǎn)，抑制底物的吸附，從而降低酶的活性，導(dǎo)致其活性比對(duì)照組低[25]。隨著ZnO NPs 處理濃度不斷增加，蚯蚓受到氧化脅迫，CAT 活性逐漸升高，在1 000 mg·kg-1處理下達(dá)到42.11 U·g-1prot。這可能是因?yàn)镃AT 的作用底物為H2O2，是SOD 的產(chǎn)物，此時(shí)蚯蚓體內(nèi)SOD 活性的增加會(huì)引起H2O2的積累，從而促進(jìn)CAT 活性的增強(qiáng)，使蚯蚓適應(yīng)環(huán)境變化，平衡ROS[26]。在Liu 等[27]的研究中，當(dāng)蚯蚓暴露于不同濃度的甲霜靈后，體內(nèi)的POD 活性沒(méi)有明顯變化，說(shuō)明在該試驗(yàn)中，CAT 在清除過(guò)量H2O2時(shí)發(fā)揮了主要作用，從而降低了POD 的負(fù)擔(dān)，使POD 活性變化不顯著。Hu 等[12]的研究結(jié)果表明當(dāng)ZnO NPs 濃度大于0.1 g·kg-1時(shí)，與對(duì)照相比，蚯蚓體內(nèi)的MDA 含量開(kāi)始顯著增加，但在濃度大于0.5 g·kg-1時(shí)，該趨勢(shì)減小。曹圣來(lái)[28]的研究發(fā)現(xiàn)，在水稻土中，1 000 mg·kg-1的ZnO NPs處理下，蚯蚓的MDA含量顯著升高。這些結(jié)果都表明在高濃度ZnO NPs 處理下，蚯蚓受到的損傷不能完全被抗氧化酶中和，最終引起細(xì)胞損傷。然而，Bao等[22]的研究結(jié)果表明在400 mg·kg-1的ZnO NPs處理下，蚯蚓的MDA 有降低的趨勢(shì)，作者認(rèn)為在其試驗(yàn)中ZnO NPs 有保護(hù)蚯蚓不受氧化損傷的作用，也有部分研究同樣提出了該觀點(diǎn)[29-30]，但作用機(jī)理還需進(jìn)一步探究。大部分研究指出，不同的試驗(yàn)條件對(duì)ZnO NPs 的毒性影響較大，包括土壤的基本理化性質(zhì)、暴露時(shí)間以及NPs 顆粒本身的影響等，這也可能是造成MDA變化不一致的主要原因。

3.2 對(duì)蚯蚓組織鋅含量的影響

在本試驗(yàn)中，不同濃度的ZnO NPs 處理雖然對(duì)蚯蚓的生理造成了一定的影響，但蚯蚓體內(nèi)的鋅含量變化均未達(dá)到顯著水平，鋅含量變化范圍為201.91～212.26 mg·kg-1。有研究表明，當(dāng)土壤中ZnO NPs濃度達(dá)到1 000 mg·kg-1時(shí)，蚯蚓體內(nèi)的鋅濃度基本維持在100～200 mg·kg-1，這與本試驗(yàn)結(jié)果一致[21，31]。同樣地，?wi?tek 等[32]對(duì)蚯蚓進(jìn)行毒代動(dòng)力學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)ZnO NPs 濃度達(dá)到 500、1 000 mg·kg-1時(shí)，蚯蚓能有效調(diào)節(jié)體內(nèi)的鋅濃度。以往有研究表明許多無(wú)脊椎動(dòng)物對(duì)鋅有非常高的排泄率，這說(shuō)明在無(wú)脊椎動(dòng)物體內(nèi)，鋅的解毒途徑主要是通過(guò)排泄作用[33]。由此推測(cè)在本試驗(yàn)中，造成蚯蚓體內(nèi)鋅含量變化不顯著的主要原因可能是蚯蚓對(duì)鋅的排泄率較高。也有研究提出，當(dāng)NPs顆粒通過(guò)攝食途徑被蚯蚓攝入時(shí)，它們很有可能停留在蚯蚓的消化道而不能被吸收[34]。Lapied等[35]的試驗(yàn)表明當(dāng)TiO2NPs濃度在0～100 mg·kg-1時(shí)，蚯蚓在添加馬糞的土壤中暴露2～8周后，沒(méi)有發(fā)生生物積累，作者認(rèn)為可能是由于TiO2NPs沒(méi)有穿過(guò)蚯蚓的腸道上皮或角質(zhì)層屏障。Richardson等[36]通過(guò)研究鎘對(duì)蚯蚓上角質(zhì)層的影響發(fā)現(xiàn)，在受到污染物影響時(shí)，蚯蚓的上角質(zhì)層加厚，增加鎘進(jìn)入蚯蚓體內(nèi)的阻力，降低蚯蚓對(duì)鎘的吸收，這可能是蚯蚓受到毒性影響的一種自身適應(yīng)機(jī)制。蚯蚓能夠調(diào)節(jié)其組織中的基本金屬元素（如銅和鋅）的濃度達(dá)到平衡，加之ZnO NPs的粒徑、濃度等均能影響其生物有效性，所以這也可能造成鋅含量變化不顯著。García-Gómez 等[37]提出，土壤pH 每增加一個(gè)單位，土壤中鋅的溶解度就降低100 倍，堿性土壤的黏土含量高于酸性土壤，有助于鋅的保留，從而降低蚯蚓對(duì)鋅的可利用性，導(dǎo)致蚯蚓組織鋅含量變化未達(dá)到顯著水平。這也從側(cè)面證實(shí)了蚯蚓對(duì)ZnO NPs 的耐受性，故蚯蚓能在高濃度的ZnO NPs 處理中保持較高的存活率。

3.3 對(duì)黃瓜幼苗生長(zhǎng)的影響

本試驗(yàn)的研究結(jié)果表明，在不加蚯蚓的處理中，隨著ZnO NPs濃度的增加，黃瓜幼苗的生物量和根系活力均呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，說(shuō)明低濃度ZnO NPs 可顯著促進(jìn)幼苗的生長(zhǎng)，中、高濃度下這種促進(jìn)作用減弱，甚至開(kāi)始出現(xiàn)抑制生長(zhǎng)的現(xiàn)象。高濃度ZnO NPs對(duì)植物根系的抑制作用可能表現(xiàn)為破壞植物的根部細(xì)胞。Amooaghaie 等[38]在小麥的盆栽試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，50 mg·L-1的ZnO NPs 顯著增加了莖和根的鮮質(zhì)量，但當(dāng)ZnO NPs 濃度增加到大于100 mg·L-1時(shí)，其莖和根鮮質(zhì)量均受到抑制。有試驗(yàn)表明，以200 mg·kg-1為臨界濃度，ZnO NPs 處理下的玉米的根、莖干質(zhì)量呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢(shì)，最高濃度（3 200 mg·kg-1）處理組小于對(duì)照組[39]，這與本試驗(yàn)結(jié)果一致。Zhao 等[40]通過(guò)試驗(yàn)表明，在 400 mg·kg-1和 800 mg·kg-1ZnO NPs處理下，黃瓜根系干生物量分別增加10.5%和63%，這與本試驗(yàn)結(jié)果相反，分析原因可能也與供試土壤有關(guān)，該研究認(rèn)為在有機(jī)土壤中，ZnO NPs 不會(huì)影響黃瓜幼苗的生長(zhǎng)。有研究指出，ZnO NPs 可通過(guò)影響植物生長(zhǎng)的根際細(xì)菌抑制吲哚乙酸的產(chǎn)生[41]。這說(shuō)明在本試驗(yàn)條件下，當(dāng)濃度大于50 mg·kg-1時(shí)，ZnO NPs可能抑制了黃瓜幼苗分泌吲哚乙酸，從而使其生物量和根系活力呈現(xiàn)出降低的趨勢(shì)。

在同濃度的ZnO NPs 處理下，添加蚯蚓的盆栽中，黃瓜幼苗的生物量和根系活力較未添加時(shí)顯著增加。這說(shuō)明蚯蚓極大地促進(jìn)了植物生長(zhǎng)，對(duì)作物發(fā)育有積極作用[42]。作為一種非常重要的土壤動(dòng)物，蚯蚓可以通過(guò)掘穴、消化、排泄等活動(dòng)改變土壤結(jié)構(gòu)，改善土壤理化性質(zhì)，改變微生物活性等[13，43]。在蚯蚓的生命活動(dòng)過(guò)程中，土壤的疏松度增加，有利于氣體交換，改變了土壤的水特性，有機(jī)物加速分解，從而增加植物生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)成分。此外，蚯蚓還在碳、氮、磷循環(huán)中發(fā)揮重要作用，為土壤表面提供食物網(wǎng)，最終使黃瓜幼苗的生物量和根系活力顯著提高。Puga-Freitas 等[44]通過(guò)研究指出蚯蚓能夠通過(guò)影響植物的根系直接影響生態(tài)系統(tǒng)的功能，通過(guò)糞便釋放礦物質(zhì)營(yíng)養(yǎng)素和植物激素支持作物生長(zhǎng)。Banerjee 等[45]研究發(fā)現(xiàn)，蚯蚓的腸道細(xì)菌能調(diào)節(jié)吲哚乙酸、赤霉酸和銨離子的產(chǎn)生，增強(qiáng)1-氨基環(huán)丙烷羧酸脫氨酶活性以及磷酸鹽溶解能力，進(jìn)而促進(jìn)植物生長(zhǎng)和修復(fù)有毒微量元素的毒害作用。這種調(diào)節(jié)作用可能強(qiáng)于ZnO NPs對(duì)吲哚乙酸的抑制作用，從而促進(jìn)幼苗生長(zhǎng)。

3.4 對(duì)黃瓜幼苗抗氧化酶和MDA含量的影響

在環(huán)境脅迫下，SOD 是抵御ROS 損傷的第一道屏障，分布廣泛，可通過(guò)歧化反應(yīng)將O2-轉(zhuǎn)化為H2O2，再通過(guò)其他酶類將其分解為H2O。這說(shuō)明在本試驗(yàn)條件下，隨著濃度的增加，ZnO NPs 對(duì)黃瓜幼苗的脅迫作用逐漸增大，植物體內(nèi)產(chǎn)生的ROS 越來(lái)越多，從而使SOD 活性不斷上升。當(dāng)濃度超過(guò)500 mg·kg-1時(shí)，由于ROS 含量不斷增加，大量SOD 被植物消耗，并且高濃度處理中，由ROS 積累所引起的氧化脅迫可能超過(guò)了SOD 的抗氧化作用，抑制了SOD 活性，導(dǎo)致SOD 活性顯著下降，體內(nèi)ROS 的產(chǎn)生和清除達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡。Kim 等[46]在黃瓜幼苗的水培試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)隨著ZnO NPs處理濃度的增加（0～1 000 mg·L-1），CAT活性顯著增加，這與本試驗(yàn)結(jié)果類似。由于CAT 和POD 均能清除H2O2，但POD 活性在低、中濃度處理組中變化不顯著，說(shuō)明黃瓜植株受到氧化損傷后，CAT在清除H2O2的過(guò)程中占主導(dǎo)地位。在添加蚯蚓的處理組中，由于隨著ZnO NPs 濃度的增加，蚯蚓體內(nèi)的SOD 活性有增加的趨勢(shì)，說(shuō)明蚯蚓可能抵御了部分ZnO NPs 產(chǎn)生的毒性，使黃瓜幼苗受到的脅迫降低，從而使SOD 活性與未加蚯蚓處理相比有降低的趨勢(shì)。近來(lái)也有試驗(yàn)證明蚯蚓的存在能夠顯著降低暴露于污染物的植物SOD 活性[15]。SOD 活性的下降可能與幼苗體內(nèi)的O2-減少有關(guān)，使其氧化應(yīng)激下調(diào)。對(duì)于幼苗的POD 活性，雖然蚯蚓的存在削弱了ZnO NPs對(duì)黃瓜幼苗的氧化脅迫，降低了SOD 的活性，但是即使是在這種情況下，植株體內(nèi)本身還維持在較高的氧化應(yīng)激水平，仍然需要大量CAT和POD保持在較為活躍的狀態(tài)，以清除體內(nèi)產(chǎn)生的H2O2。這說(shuō)明蚯蚓在某種程度上可以緩解ZnO NPs 對(duì)植株造成的氧化應(yīng)激，抑制或穩(wěn)定其抗氧化酶的活性。

ROS 可干擾細(xì)胞膜，促進(jìn)脂質(zhì)過(guò)氧化，導(dǎo)致MDA的釋放。因此，ROS的濃度直接反映了細(xì)胞對(duì)這種脅迫的響應(yīng)程度。在低、中濃度下，由于氧化應(yīng)激的作用，SOD 等抗氧化酶活性增加，在清除ROS 的同時(shí)對(duì)細(xì)胞起到了保護(hù)作用[28]，故植株MDA 含量變化不顯著。然而，在高濃度處理下，植株受到的損傷不能完全被抗氧化酶中和，導(dǎo)致MDA 含量顯著上升。在本試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)MDA 含量的增加與幼苗生長(zhǎng)參數(shù)的降低有關(guān)，生物量和根系活力越小，MDA含量越高，這與Mkhinini 等[16]的試驗(yàn)結(jié)論一致。添加蚯蚓后，MDA 含量呈現(xiàn)出降低的趨勢(shì)，且與SOD 活性變化趨勢(shì)一致，進(jìn)一步說(shuō)明了蚯蚓能抑制一部分由ZnO NPs產(chǎn)生的毒害作用，使幼苗的脂質(zhì)過(guò)氧化程度降低，證實(shí)了蚯蚓對(duì)植株生長(zhǎng)的促進(jìn)作用。

3.5 對(duì)黃瓜幼苗鋅含量的影響

作為一種新型肥料，ZnO NPs 能顯著提高黃瓜幼苗地上部和地下部的鋅含量，這與現(xiàn)有研究結(jié)果一致。Zhang 等[1]在其研究中證明了ZnO NPs 對(duì)小麥的鋅強(qiáng)化能力高于普通鋅肥，在乳熟期噴施ZnO NPs，收獲后小麥籽粒鋅含量相比對(duì)照提升了44.02%。Du等[3]發(fā)現(xiàn)在盆栽試驗(yàn)中，ZnO NPs 濃度超過(guò)20 mg·kg-1時(shí)能顯著提高小麥各組織鋅的含量，當(dāng)濃度達(dá)到1 000 mg·kg-1時(shí)，籽粒鋅含量是對(duì)照組的3.3倍。然而，在加入蚯蚓后，鋅含量均有所降低。近年來(lái)，有研究提出蚯蚓不僅可以通過(guò)掘穴活動(dòng)極大地減少真菌生物量，還可以加速細(xì)菌代謝的不穩(wěn)定有機(jī)底物的釋放，從而使細(xì)菌比例升高，有利于形成以細(xì)菌為主導(dǎo)地位的微生物群落[47]。蚯蚓對(duì)黃瓜幼苗吸收鋅的影響是否與此種特殊的微生物群落相關(guān)，還需進(jìn)一步研究說(shuō)明。

4 結(jié)論

（1）隨ZnO NPs 處理濃度的增加，蚯蚓組織的鋅含量未產(chǎn)生顯著變化。高濃度處理中，蚯蚓MDA 含量顯著升高，SOD、POD 和CAT 均無(wú)顯著差異。表明蚯蚓對(duì)ZnO NPs 的響應(yīng)較低，對(duì)高濃度處理耐受性較強(qiáng)。

（2）與對(duì)照相比，以500 mg·kg-1為臨界濃度，土施ZnO NPs 對(duì)黃瓜幼苗的生長(zhǎng)具有低濃度促進(jìn)、高濃度抑制的效應(yīng)。當(dāng)處理濃度高于臨界濃度時(shí)，黃瓜幼苗受到氧化損傷。ZnO NPs 能顯著提高植株地上和地下部的鋅含量。

（3）蚯蚓的加入能顯著促進(jìn)黃瓜幼苗的生長(zhǎng)，能在一定程度上抑制或緩解ZnO NPs 對(duì)植株的損傷，中、高濃度處理組的MDA 含量表現(xiàn)尤為明顯。總體上，ZnO NPs 作為一種新型肥料，能顯著促進(jìn)幼苗生長(zhǎng)，且不會(huì)對(duì)蚯蚓造成影響。