巨大芽孢桿菌與檸檬酸聯合強化青葙修復鎘污染土壤研究

張冰，劉杰，2*，蔣萍萍*，蔣旭升，丁志凡，程艷，雷玲

（1.桂林理工大學環境污染控制理論與技術廣西重點實驗室，廣西 桂林 541004；2.自然資源部南方石山地區礦山地質環境修復工程技術創新中心，廣西 桂林 541004）

隨著我國工業化腳步的不斷加快，土壤重金屬污染問題也日益突出。被重金屬污染的土壤中Cd的點位超標率為7.0%，是所有無機污染物中最高的，并且Cd 是自然環境中生物毒性和遷移性最強的重金屬元素之一，極易通過食物鏈被人體吸收，危害人類身體健康[1-3]。土壤中的重金屬具有長期性、隱蔽性和不可逆性，這些特性加大了重金屬污染土壤的治理難度，因此，土壤Cd污染的治理已迫在眉睫[4-5]。

植物提取修復技術因其具有不破壞土壤結構、可用于大面積污染土壤修復、后期處理簡單等諸多優點，被認為是一種很有前途的原位修復方法[6-7]。近年來，植物修復已成為農業和環境科學領域研究和開發的熱點[8-9]。但由于受到重金屬生物有效性低、超富集植物生物量小等因素的制約，植物修復往往效率不太高[3]。

檸檬酸是一種有機螯合劑，生物降解性好，對土壤環境沒有污染[10]。檸檬酸能夠溶解土壤中的重金屬，使之進入土壤液相中，提高生物可利用性，可以促進重金屬在植物根際的擴散，增強植物對其的吸收、轉運和富集[11-13]。巨大芽孢桿菌已經被證實是一種解磷菌，它可以通過釋放土壤中的難溶磷元素，分泌IAA（生長素）、產鐵載體來促進植物的生長，并在一定程度上提高重金屬的生物有效性[14]。大量研究表明檸檬酸和巨大芽孢桿菌能提高植物的修復效率，但是試驗得到的最佳添加量卻不盡相同。姚詩音[15]研究證明向Cd污染土壤中添加5 mmol·kg-1檸檬酸效果最佳，可使青葙葉片Cd含量較對照增加2.72倍；而許偉偉等[16]試驗表明添加1 mmol·kg-1檸檬酸時油菜對Cd 的去除效率提高效果最好，提高2.1%。王小敏等[17]研究發現，添加2×109cfu·kg-1巨大芽孢桿菌時最大程度提高印度芥菜Cd 積累量，提高96.9%；而紀宏偉等[18]試驗證明接種1010cfu·kg-1巨大芽孢桿菌和膠凍樣類芽孢桿菌混合液效果最好，使印度芥菜Cd 的積累量提高60.4%。檸檬酸和巨大芽孢桿菌雖然都能提高植物修復效率，但是在實際修復過程中還有許多局限性。檸檬酸雖然可以提高土壤重金屬的生物可利用性，但是對提高植物生物量效果并不明顯，甚至可能因為有效態濃度的急劇增加而對植物產生毒害作用；巨大芽孢桿菌雖然可以釋放植物需要的營養元素，分泌促生激素IAA、產鐵載體來促進植物生長，但是對吸收、轉運及富集重金屬的影響并不明顯[19]。因此，本文以超富集植物青葙（Celosia argenteaLinn）為供試植物，通過添加不同濃度的檸檬酸和巨大芽孢桿菌，研究檸檬酸和巨大芽孢桿菌聯合強化作用對青葙修復Cd 污染土壤的影響，為青葙修復Cd 污染土壤提供指導和技術支持[3]。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試植物

供試植物為青葙，莧科青葙屬一年生草本植物，具有結籽量多、喜陽耐旱、易于人工種植等特點[20]。本課題組前期工作發現青葙是一種重金屬Mn 和Cd的超富集植物[21]。青葙種子2019 年5 月1 日采集于廣西桂林市陽朔縣興坪鎮思的村，選取顆粒飽滿的青葙種子播種于育苗盤中，置于桂林理工大學重金屬污染植物修復試驗基地溫室培養，溫室溫度恒定在20～35 ℃。種子萌發后（3 d），每日澆水，一周后每周用20%的Hoagland′s 營養液澆灌一次。待幼苗長出4～6片真葉，高度約為5～6 cm時，移栽進行盆栽試驗[3]。

1.1.2 供試土壤

供試土壤采自廣西桂林市某地Cd 污染農田0～20 cm 表層土壤。將采集的土壤置于陰涼處自然風干，剔除石子和枯葉等雜物，壓碎后過5 目篩，備用[22]。土壤基本理化性質為：pH 6.06（H2O），有機質50.1 g·kg-1，銨態氮16.0 mg·kg-1，速效磷49.2 mg·kg-1，速效鉀145 mg·kg-1，總Cd含量為4.90 mg·kg-1。

1.1.3 巨大芽孢桿菌懸浮液

將巨大芽孢桿菌菌株接種于LB 液體培養基中，在溫度為30 ℃、轉速為180 r·min-1的條件下培養48 h，將得到的菌懸液10 000 r·min-1離心10 min，倒掉上層溶液，然后用無菌水沖洗菌體，再次離心，重復3次[23]，添加適量無菌水制備成濃度為1010cfu·mL-1的細菌懸浮液備用。

1.2 試驗方案

2019 年5 月至7 月于桂林理工大學重金屬污染植物修復試驗基地進行盆栽試驗。準確稱取1 kg 的土壤裝于規格為2 L（高15.5 cm，底直徑14 cm，上口直徑19.7 cm）的塑料桶內。育苗當天將檸檬酸以溶液形式加入土壤中，混勻后平衡15 d（平衡期間要定時翻動）。平衡結束后，選取生長一致的青葙幼苗移入盆中，每盆1 株。半個月后，向巨大芽孢桿菌懸浮液中加入適量去離子水，制備成 0、108、109cfu·50 mL-1及1010cfu·50 mL-1懸濁液，取 50 mL 直接澆于植物根部（即0、108、109cfu·kg-1及1010cfu·kg-1）。生長期間，使土壤含水量保持在田間持水量的80%左右。3 個月后收獲植物。試驗共設20 個處理，3 次重復。添加物情況見表1。

1.3 植物及土壤樣品的采集、處理及分析方法

收獲的青葙分為根、莖、葉3 部分，根系洗凈后用10 mmol·L-1的EDTA（乙二胺四乙酸）溶液浸泡 30 min，以洗去吸附在根系表面的重金屬，然后超聲波清洗儀清洗10 min，再用去離子水沖洗干凈[24]；莖和葉先用流水沖洗掉表面的塵土，再用去離子水沖洗干凈。洗凈的植物樣品在105 ℃下殺青30 min，70 ℃下烘干至恒質量（48 h）并測定其干質量（生物量以干質量計），粉碎，備用[3]。稱取粉碎的植物樣品（約0.200 0 g）用HNO3-H2O2法消解，樣品Cd 含量用電感耦合等離子體發射光譜儀測定。

植物收獲時，先去除根部大塊土壤，抖落黏附在根系表面1～4 mm 范圍內的松散土壤作為根際土[25]，置于陰涼處自然風干，壓碎后過5、10 目及200 目篩，備用[3]。土壤樣品pH 值采用pH 計測定，浸提劑為去離子水，按照土水比1∶2.5 測定[26]。有效磷含量采用氟化銨-鹽酸浸提劑提取，鉬銻抗顯色劑顯色，紫外可見分光光度計測定[27]。全Cd 采用HNO3-H2O2法消解；有效態Cd采用DTPA（二乙烯三胺五乙酸）浸提法浸提，樣品Cd 含量均用電感耦合等離子體發射光譜儀（PerkinElmer Optima 7000 DV）測定。分析過程中所用試劑均為優級純，采用國家一級標準參比物質[GBW 07602（GSV-2）]和平行空白樣進行植物及土壤樣品消解及質量控制，樣品回收率控制在95%～105%[3]。

1.4 數據處理分析

富集系數（BCF）=植物葉Cd含量/土壤Cd含量

地上部Cd積累量=葉生物量×葉Cd含量+莖生物量×莖Cd含量

地上部生物量=葉生物量+莖生物量

地上部Cd 含量=地上部Cd 積累量/地上部生物量

采用SPSS 23 中的單因素方差（ANOVA）和最小顯著差數法（LSD）對數據進行分析和顯著性檢驗（P＜0.05），并用Origin 2018制圖。

2 結果與分析

2.1 不同處理方式對根際土pH的影響

處理方式的不同對根際土pH 的影響見圖1。添加不同濃度的巨大芽孢桿菌和檸檬酸后，與對照處理（B0-C0）相比，所有處理pH 值均顯著下降，且都小于6.50。單獨添加檸檬酸時，根際土pH 值平均下降0.38個單位；單獨添加巨大芽孢桿菌時，根際土pH 值平均下降0.21個單位；檸檬酸和巨大芽孢桿菌聯合處理時，pH 值下降 0.12～0.79 個單位，平均下降 0.58 個單位，其中B10-C10 處理下降幅度最大，下降了0.79個單位。檸檬酸對土壤的酸化作用強于巨大芽孢桿菌，而巨大芽孢桿菌和檸檬酸聯合添加時pH 值下降幅度大于兩者單獨添加時。

2.2 不同處理方式對根際土有效態Cd含量的影響

處理方式的不同對根際土有效態Cd含量的影響見圖2。添加不同濃度的巨大芽孢桿菌和檸檬酸后，與對照處理相比，所有處理根際土有效態Cd 含量均顯著提高。單獨添加巨大芽孢桿菌時，有效態Cd 含量提高了1.05%～3.56%，平均提高2.13%；單獨施加檸檬酸時，有效態Cd 含量提高了5.10%～8.76%，平均提高6.30%；檸檬酸和巨大芽孢桿菌聯合處理時，有效態Cd 含量提高了3.03%～16.0%，平均提高8.76%，其中B9-C5 處理活化效果最好，比對照提高了16.0%。檸檬酸對Cd的活化效果優于巨大芽孢桿菌，而兩者聯合處理時對Cd的活化效果更好。

表1 土壤的不同處理方式Table 1 Treatments in soils

2.3 不同處理方式對根際土有效磷含量的影響

處理方式的不同對根際土有效磷含量的影響見圖3。添加不同濃度的巨大芽孢桿菌和檸檬酸后，與對照處理相比，除B0-C10外，所有處理均顯著提高了土壤有效磷含量。單獨添加檸檬酸時，提高了5.91%～45.6%，平均提高了26.5%；單獨添加巨大芽孢桿菌時，提高了75.1%～101%，平均提高了87.4%。檸檬酸和巨大芽孢桿菌聯合處理時，提高了79.6%～159%，平均提高111%，其中B9-C5 處理效果最好，比對照提高了159%。添加巨大芽孢桿菌對土壤有效磷含量的提高效果優于添加檸檬酸，而兩者聯合處理時效果更好。

2.4 不同處理方式對青葙各部分生物量的影響

處理方式的不同對青葙各部分生物量的影響如圖4所示。可看出向土壤中添加巨大芽孢桿菌和檸檬酸的處理與對照相比，青葙各部分生物量均顯著增加。單獨添加巨大芽孢桿菌的處理青葙地上部生物量增加了23.3%～32.2%，平均增加27.8%；單獨添加檸檬酸的處理增加了7.29%～17.4%，平均增加12.9%；檸檬酸和巨大芽孢桿菌聯合處理時增加了26.8%～45.6%，平均增加35.5%。其中B9-C5 處理效果最好，青葙生物量為12.8 g·pot-1。巨大芽孢桿菌對青葙的促生效果優于檸檬酸，但兩者聯合應用得到了更好的效果。

2.5 不同處理方式對青葙各部分Cd含量的影響

處理方式的不同對青葙各部分Cd含量的影響如圖5 所示。向土壤中添加不同濃度的檸檬酸和巨大芽孢桿菌后，與對照處理相比，所有處理均顯著提高了青葙各部分的Cd 含量。單獨添加檸檬酸時，青葙各部分Cd 含量增加，其中葉增加31.8%～41.3%，莖增加22.6%～39.9%，根增加21.2%～29.0%，地上部和地下部分別平均增加34.2%和21.6%；單獨添加巨大芽孢桿菌時，青葙各部分Cd 含量增加，其中葉增加18.8%～25.5%，莖增加 8.4%～12.7%，根增加 17.6%～23.3%，地上部和地下部分別平均增加21.3% 和14.1%；檸檬酸和巨大芽孢桿菌聯合處理時青葙各部分Cd 含量增加，其中葉增加18.8%～75.8%，莖增加8.4%～76.3%，根增加8.3%～74.6%，地上部和地下部分別平均增加61.6%和40.3%，其中B9-C5 處理效果最好，增加了77.8%。添加檸檬酸對青葙Cd 含量的提高效果優于巨大芽孢桿菌，而兩者聯合處理效果更好。

2.6 不同處理方式對青葙富集系數的影響

生物富集系數也稱為吸收系數，是指植物體內某種重金屬的濃度與其生長的土壤中這種重金屬濃度之比[28]。生物富集系數被用來反映土壤-植物體系中元素遷移的難易程度，這是植物將重金屬吸收轉移到體內能力大小的評價指標[29]。從表2 可以看出，向土壤中單獨或聯合添加不同濃度巨大芽孢桿菌和檸檬酸后，與對照處理相比，富集系數均有顯著提高（P＜0.05），說明添加巨大芽孢桿菌和檸檬酸可以促進青葙對重金屬Cd 的吸收及轉移；富集系數均大于15.0，說明青葙對重金屬Cd的富集能力很強。在B9-C5處理下達到最大（27.7），比對照處理（15.8）提高了75.3%。說明向土壤中添加檸檬酸和巨大芽孢桿菌可以提高青葙對Cd的吸收、轉移及富集能力。

2.7 不同處理方式對青葙地上部Cd積累量的影響

處理方式的不同對青葙地上部Cd積累量的影響如圖6 所示。向土壤中施加不同濃度巨大芽孢桿菌和檸檬酸后，所有處理青葙地上部Cd 積累量均顯著高于對照處理。單獨添加檸檬酸時增加了42.6%～63.3%，平均增加51.6%；單獨添加巨大芽孢桿菌時增加了45.2%～63.1%，平均增加55.2%；檸檬酸和巨大芽孢桿菌聯合處理時，增加了46.6%～159%，平均增加119%，兩者聯合應用效果更好。其中B9-C5 處理效果最好，比對照增加159%。

3 討論

植物提取修復技術最終收獲的是超富集植物的地上部，所以植物地上部重金屬積累量的大小是植物修復過程中最具有實際意義的指標之一，表征了植物的修復潛力，決定了植物提取修復技術效率的高低[30]。而地上部重金屬積累量的大小取決于兩個關鍵點，一個關鍵點是所用超富集植物生物量的大小，另一個關鍵點就是所用超富集植物吸收重金屬能力的強弱，即植物體重金屬濃度的大小[31-32]。

本試驗結果顯示添加巨大芽孢桿菌和檸檬酸顯著提高了青葙地上部的生物量，平均增加了29.6%，Esringü等[33]研究顯示在100 mg·kg-1Cd污染土壤中添加1.5×1010cfu·kg-1巨大芽孢桿菌后甘藍型油菜的生物量提高了3.3%，Han 等[31]試驗也證明添加2 mmol·kg-1檸檬酸時喜鹽鳶尾地上部的生物量比對照處理提高43.0%。本試驗結果與這些研究類似。單獨添加巨大芽孢桿菌時對青葙的促生效果更好，地上部生物量平均增加量（27.9%）是檸檬酸（12.9%）的2.16倍。這一方面可能是因為添加巨大芽孢桿菌時土壤有效磷含量是檸檬酸的3.30倍，另一方面是巨大芽孢桿菌促進植物生長的途徑不止一種，它還可以分泌促生激素IAA、產鐵載體為植物提供足夠的Fe元素來促進植物生長，增加植物對逆境的抗性[24]，而檸檬酸不具備這些能力。

同時，添加巨大芽孢桿菌和檸檬酸后青葙地上部Cd 的含量平均提高了49.4%，詹淑威等[34]研究表明添加10 mmol·kg-1檸檬酸可使小飛揚草地上部Cd 的含量增加49.1%；鄧月強等[23]試驗也證明接種1011cfu·kg-1巨大芽孢桿菌時伴礦景天地上部Cd 含量比對照處理提高60.4%，本試驗研究結果與這些研究相似。而檸檬酸在這個方面似乎更有優勢，平均提高量比巨大芽孢桿菌高12.9個百分點，而這得益于添加檸檬酸時土壤有效態Cd含量比巨大芽孢桿菌高4.17個百分點。這可能是因為檸檬酸在青葙還沒有種植時提前加入，環境較簡單，檸檬酸能夠更好地作用于土壤，而巨大芽孢桿菌是青葙移栽之后添加的，其分泌的有機酸成分比較復雜，作用的目標不僅是土壤，且對Cd的活化能力也有強有弱。從青葙對Cd的富集系數可看出添加檸檬酸和巨大芽孢桿菌提高了青葙對Cd的富集能力，但青葙地上部組織Cd 平均含量卻沒有達到超富集植物的臨界標準（100 mg·kg-1），這是因為富集系數計算公式為：富集系數（BCF）=植物葉Cd含量/土壤Cd 含量，而青葙地上部Cd 含量計算公式為：地上部Cd 含量=（葉生物量×葉Cd 含量+莖生物量×莖Cd含量）/（葉生物量+莖生物量），將青葙葉和莖中的Cd單獨計算時，青葙葉片中的Cd 含量達到了超富集植物的標準，葉片中的平均Cd含量為110 mg·kg-1，最大可達到132 mg·kg-1。而青葙莖的Cd 含量相對較低，平均只有32.0 mg·kg-1，最高也只有 39.4 mg·kg-1，所以導致青葙地上部Cd含量并未達到超富集植物的標準。本研究將青葙葉、莖、根分開分析，能夠體現出植物特性。

檸檬酸和巨大芽孢桿菌的添加提高了青葙地上部Cd 積累量，隨檸檬酸和巨大芽孢桿菌添加量的增加，青葙地上部Cd積累量呈現先增大后減小的趨勢。檸檬酸濃度從 0 mmol·kg-1增加到 5 mmol·kg-1、巨大芽孢桿菌從0 cfu·kg-1增加到109cfu·kg-1過程中，積累量的趨勢是逐漸提高的，但是當檸檬酸和巨大芽孢桿菌濃度進一步提高到7.5～10 mmol·kg-1及1010cfu·kg-1時，積累量不增反降，這可能是因為高濃度的檸檬酸進入土壤后促使有效態重金屬含量過高，對青葙產生了生理毒害，也會降低巨大芽孢桿菌的活性，而低濃度的檸檬酸反而促進了青葙的生長，這與沈斌等[35]研究結果一致，即低濃度檸檬酸的施加促進了魚腥草的生長發育，但高濃度檸檬酸對魚腥草有生理毒害，導致魚腥草生物量降低；Wang 等[36]試驗也表明添加高濃度檸檬酸顯著促進了玉米和冬小麥對Pb、Zn的積累，但同時抑制了植物的生長，降低了產量；過量的巨大芽孢桿菌進入土壤會產生過量的有機酸對青葙產生毒害作用，會因生存空間產生競爭相互消耗，反而降低了修復效果，所以檸檬酸和巨大芽孢桿菌的添加量不宜過高。

檸檬酸和巨大芽孢桿菌在強化青葙修復Cd污染土壤中各具優勢，聯合施用可將兩者的優勢結合起來，在促進青葙對Cd吸收的同時生物量也得到增加，從而得到更好的修復效果。數據顯示，檸檬酸和巨大芽孢桿菌聯合施用及單獨施用時，青葙地上部Cd 積累量最大分別提高了159.0%、63.3%和63.1%，顯然聯合處理時效果更好，甚至產生了“1+1＞2”的效果。這與丁玲[37]的研究結果一致，巨大芽孢桿菌和檸檬酸聯合施用比單獨施用更有利于提高印度芥菜對重金屬Cd的富集能力，其中混合添加30 mmol·kg-1檸檬酸和109cfu·kg-1巨大芽孢桿菌處理組效果最好，對Cd的去除率為4.91%。本試驗結果表明混合添加5 mmol·kg-1檸檬酸和 109cfu·kg-1巨大芽孢桿菌效果最好，地上部Cd 積累量為 1.03 mg·pot-1，比對照增加了159%，對Cd的去除率為21.0%，而不添加強化劑時去除率只有8.10%。

從經濟利益角度分析，不添加強化劑時需要種植13茬青葙可使該片農田土壤Cd含量恢復到安全生產水平，而添加強化劑則只需種植5 茬，使農田可以盡早產生經濟效益，但是添加強化劑也需要成本，需要核算添加強化劑與不添加強化劑的經濟效益孰強孰弱。按照農田表層0～20 cm土壤，土壤密度1.3 g·cm-3計算，每平方米土壤質量為260 kg。檸檬酸和巨大芽孢桿菌的施加量分別為5 mmol·kg-1和109cfu·kg-1，則施加檸檬酸的成本為3 000～3 750元·hm-2。但本試驗制備巨大芽孢桿菌菌劑的方法不適用于大面積修復工程，工程修復只能使用商品菌劑，這也會提高修復成本。添加巨大芽孢桿菌成本約為3 750～4 500 元·hm-2，強化修復成本為6 750～8 250 元·hm-2，而種植經濟作物（小麥、水稻等）利潤為12 000～15 000 元·hm-2。如果巨大芽孢桿菌添加后可以形成優勢菌群并且長期保持優勢，那么就不需要每次種植都添加菌劑，可以極大降低修復成本。巨大芽孢桿菌進入土壤后是否會成為優勢菌群，其優勢能維持多久，即巨大芽孢桿菌在土壤中的動態變化還需要進一步試驗探究。綜上所述，添加檸檬酸和巨大芽孢桿菌不僅能夠提高青葙對Cd污染土壤的修復效率，降低成本，使土地盡早投入使用，還可以減少磷肥用量，降低化學肥料對環境造成危害的風險。

4 結論

（1）檸檬酸和巨大芽孢桿菌在提高青葙對Cd 污染土壤修復效率中各具優勢，而聯合應用能達到更好的效果。

（2）檸檬酸和巨大芽孢桿菌的添加量分別為5 mmol·kg-1和109cfu·kg-1時更有利于青葙對土壤中Cd的吸收、轉移以及富集，地上部Cd 積累量最大為1.03 mg·pot-1，去除效率最高為21.0%。