氮肥深施對免耕稻田土壤有機質化學特性和胞外酶活性的影響

樊代佳，李成芳，2*，曹湊貴，2*

（1.農業農村部長江中游作物生理生態與耕作重點實驗室/華中農業大學植物科學技術學院，武漢 430070；2.長江大學/長江大學主要糧食作物產業化湖北省協同創新中心，湖北 荊州 434023）

水稻（Oryza sativaL.）是我國最重要的糧食作物之一，其種植面積占全國糧食作物總面積的26.7%[1]。免耕作為一種新型保護性耕作措施近年來被廣泛應用于我國水稻生產[2-4]。農民常通過表施氮肥提高作物產量。有研究表明，氮肥表施會造成氮素的大量損失[5-7]。與傳統氮肥表施相比，氮肥深施可以促進作物生長，提高作物產量。Ibrahim 等[8]發現氮肥深施10 cm通過增加作物根系體積促進作物對營養元素的吸收，最終提高作物產量。還有研究表明，氮肥深施可以提高氮肥利用率，減少氮素損失。Rychel 等[9]研究指出，氮肥深施20 cm 顯著提高作物的含氮量并降低土壤氧化亞氮排放量。Wu 等[10]研究也發現，氮肥深施通過促進作物對氮肥的吸收提高氮素利用率。因此，近年來氮肥深施在我國免耕稻田生產中得到了大面積推廣[11]。

土壤有機質是植物養分的主要來源，是衡量土壤肥力的重要指標[12]。研究已表明，土壤有機質含量與作物產量顯著正相關[12-13]。耕作和施肥等農業措施影響著土壤有機質的含量和質量。有研究發現，保護性耕作較傳統翻耕提高了土壤有機質的含量，促進了有機碳的固定[14-16]。同時，研究表明，施肥措施顯著影響土壤有機質的含量及性質[17-18]。氮肥深施作為一種高效的氮肥施用方式顯著影響著土壤有機質。Zhang 等[19]研究指出，氮肥深施可以顯著提高土壤有機質的含量；Liu 等[20]發現氮肥深施可以降低土壤有機質的分解速率。在眾多土壤理化特性中，有機質的化學組成和性質對土壤肥力和養分循環起決定性作用[21-22]，因此不同施肥措施對土壤有機質化學特性的影響一度成為研究熱點。如史吉平等[23]發現長期施用有機肥或有機無機肥配施會改變土壤腐植酸中各化學官能團的組成和含量，Francioso 等[24]的研究結果表明施用糞肥會顯著提高土壤有機質中脂肪族和芳香族化合物的含量。然而，當前有關氮肥深施對土壤有機質化學組成與性質影響的研究寥寥無幾。因此，探討氮肥深施對免耕稻田土壤有機質化學特性的影響，對于明確氮肥深施調控土壤肥力和生產力的機制以及對其作出相應的改善對策具有重要意義。

土壤有機質按化學組成可分為腐殖質和非腐殖質兩大類。腐殖質由新鮮有機質經微生物分解轉化形成，屬于較穩定的惰性有機質，主要由胡敏素（Humin，HM）、胡敏酸（Humic acid，HA）和富里酸（Fulvic acid，FA）組成[25]。腐殖質含有羥基、羧基、羰基、甲氧基等多種官能團，這些官能團的含量和占比共同決定腐殖質的化學穩定性和作用[26]，也是影響土壤肥力的重要因素[27-28]。HA 是腐殖質中最活躍的成分，在一定程度上表征腐殖質的芳香性、化學穩定性和有效性，其含量越高，表明腐殖質的活性越高，品質越好[29]。因此，研究HA含量、化學結構與性質的變化可以揭示腐殖質以及土壤肥力的變化情況。非腐殖質包含小分子有機化合物、可溶性有機碳（DOC）和微生物量碳（MBC）等，屬于易分解的活性有機質，對植物養分的供應有最直接的作用[30-31]。相對密度低于2 g·cm-3、主要源于未分解及半分解植物殘體和部分微生物體的輕組有機質（Light fraction organic matter，LFOM）占活性有機質總含量的76%～96%[32]，因此通過測定LFOM 的含量與化學組成可以反映土壤活性有機質及土壤肥力的情況。

本試驗旨在通過比較傳統表施和氮肥深施之間的差異，明確氮肥深施措施對免耕稻田土壤有機質化學組成和性質的影響機制。本研究假設，與傳統表施相比，氮肥深施通過調控作物生長和土壤微生物活性改變土壤惰性和活性有機質的含量與化學特性，改變免耕稻田土壤有機質的質量和有效性，最終影響土壤肥力和生產力。為了驗證該假設，本試驗采用13C 核磁共振（Nuclear magnetic resonance，NMR）和熱裂解氣相色譜/質譜聯用法（Pyrolysis-gas chromatography/mass spectrometry，Py-GC/MS）研究土壤有機質的化學特性，通過β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase，BG）、β-N-乙酰氨基葡糖苷酶（β-N-acetylglucosaminidase，NAG）、L-亮氨酸氨基肽酶（L-leucine aminopeptidase，LLA）、酚氧化酶（Phenol oxidase，PHO）和過氧化物酶（Peroxidase，PEO）5 種酶的活性來反映土壤酶活性、能提，通過冗余分析（Redundancy analysis，RDA）研究土壤有機質各組分化學特性與土壤酶活之間的關系。

1 材料與方法

1.1 試驗地情況

在湖北省武穴市花橋鎮現代農業示范中心試驗基地（30°00′48″N，115°47′16″E，海拔19 m）開展大田試驗。該地區屬于亞熱帶濕潤季風氣候，年平均氣溫17.8 ℃，年平均降雨量1 361 mm，年平均日照時長約260 d，土壤為潛育土（FAO 土壤分類）。從2011 年6 月起直至本試驗開展期間，該試驗田一直進行水稻（黃華占）-油菜（華雙3 號，Brassica napusL.）免耕復種。試驗田本底土（0～20 cm）理化性質如下：pH 5.36，總有機碳含量 20.92 g·kg-1，總氮含量 2.06 g·kg-1，銨態氮含量 8.48 mg·kg-1，硝態氮含量 0.59 mg·kg-1，總磷含量2.36 g·kg-1，總鉀含量 3.77 g·kg-1，土壤容重1.08 g·cm-3。

1.2 試驗設計與大田管理

試驗處理包括不施肥（CK）、氮肥傳統表施（SB）、以及氮肥深施5 cm（5D）、10 cm（10D）和20 cm（20D），采取隨機區組設計，3 次重復。小區面積36 m2（長8.0 m，寬4.5 m），每小區設兩個廂（長7.4 m，寬1.8 m）。為方便灌溉和排水，在廂和小區四周挖掘溝渠（寬0.3 m，深0.25 m）。為防止水肥串流，小區之間用田埂（寬0.4 m，高0.4 m，覆蓋塑料薄膜）和保護行（寬1 m）隔開。試驗田總面積1 207.5 m（2長35 m，寬34.5 m），四周設置圍溝和保護行，以方便田間管理。

水稻在每年6 月進行人工拋秧（1.8×105穴·hm-2），10 月收獲。水稻生育期施肥總量為180 kg N·hm-2、90 kg P2O5·hm-2和180 kg K2O·hm-2，選用復合肥（N∶P2O5∶K2O=15%∶15%∶15%）、尿素（含氮量46%）以及氯化鉀（K2O 含量60%）作為肥料。全部磷肥作為基肥一次性施用；鉀肥一半基施，一半在拔節期追施；氮肥分別在秧苗期、分蘗期、拔節期和孕穗期施用總量的50%、20%、12%和18%，其中基肥為復合肥，追肥為尿素。為了盡量減少肥料施用對土壤的物理擾動，本試驗采用SB-13B3 型半自動深施施肥器（臺州市農樂塑料有限公司，中國）進行肥料深施，施肥點位于水稻之間，施肥點間距約20 cm。每年6 月上旬在稻田淹水前噴灑30%丙草胺乳油除草，其他時期進行人工除草。水稻生育期內采取間歇灌溉，維持田間水面在4～8 cm的深度。油菜分別在每年10月和來年5 月進行直播和收獲，同樣采用免耕栽培。油菜生育期總施肥量為180 kg N·hm-2、90 kg P2O5·hm-2和150 kg K2O·hm-2，所用肥料類型與水稻一致。在油菜苗期氮肥總量的一半進行深施，其余氮肥則在抽薹期和開花期進行表施。水稻和油菜季秸稈全部粉碎后覆蓋還田。

1.3 土壤采集與測定

在每年的水稻收獲期采集土壤樣本。每個小區隨機選取5 個采樣點，用內徑7 cm 的取土器采集0～20 cm 深的土樣，將來自同一小區的土樣裝入密封袋內形成混合樣本并立刻運回實驗室進行處理。挑出土樣中的石頭和動植物殘體后將其輕輕捏碎并充分混勻，分成兩個子樣本，一個子樣本保存在-20 ℃下用于有機質化學特性的測定，另一個子樣本冷藏于-80 ℃下用于土壤酶活的測定。

土壤有機質各組分的有機碳含量通過重鉻酸鉀外加熱法測定[33]。用氫氧化鈉（NaOH）-焦磷酸鈉（Na4P2O7）提取法分離和提取土壤腐殖質中的HA、FA和HM[34]。利用固體交叉極化/魔角旋轉（CP/MAS）13CNMR 光譜法對HA 的主要化學官能團結構及組成進行測定。通過浮選法從土壤中分離提取LFOM[35-36]。參考Saiya-Cork 等[37]的方法對土壤中5 種胞外酶（BG、NAG、LLA、PHO和PEO）的活性進行測定。

1.4 數據處理與分析

在對數據進行正態分布和方差齊性檢驗后，在SPSS 22.0 中進行單因素方差分析（ANOVA），對處理影響顯著的數據進行Turkey HSD 檢驗以兩兩比較不同處理間的影響差異。用OriginPro（2017 版）進行繪圖，用Canoco（5.0 版）進行RDA 分析。所有統計分析的顯著性水平都為P＜0.05。

2 結果與分析

2.1 腐殖質各組分的有機碳含量

氮肥施用措施顯著影響腐殖質中HA 和FA 的有機碳含量以及二者的比例HA/FA（表1）。與SB相比，氮肥深施下HA 的有機碳含量顯著高10.4%～30.7%（P＜0.05）；在氮肥深施處理中，與5D和20D相比，10D下HA 的有機碳含量顯著提高10.7%～18.3%（P＜0.05）。此外，SB、5D、10D 和20D 下FA 的有機碳含量之間都沒有顯著差異。與SB 相比，10D 下的HA/FA顯著高22.8%～32.5%（P＜0.05）；氮肥深施處理中，10D下的 HA/FA 比 5D 和 20D 顯著高 12.7%～21.0%（P＜0.05）。氮肥施用措施對HM 的有機碳含量沒有顯著影響。

2.2 LFOM的有機碳含量

氮肥施用措施對LFOM 的有機碳含量有顯著影響（圖1）。與SB 相比，氮肥深施處理下LFOM 的有機碳含量顯著提高1.7%～53.5%（P＜0.05）；在氮肥深施處理中，與 5D 和 20D 相比，10D 下的 LFOM 有機碳含量顯著升高2.5%～16.5%（P＜0.05）。

2.3 HA的化學組成與性質

氮肥施用措施對HA 的化學特性有影響（表2）。與SB相比，氮肥深施下烷基碳和羰基碳的含量、二者的比例以及HA 的疏水性分別提高3.9%～23.3%、16.7%～225.0%、5.9%～43.7%和1.0%～11.1%，烷氧碳、芳香碳和芳香氧碳的含量以及HA 的芳香性則分別降 低 0.9%～15.2%、1.8%～25.0%、2.3%～27.8% 和4.3%～21.7%；此外，與SB 相比，5D 和10D 下羧基碳的含量高2.0%～5.9%，20D 下羧基碳的含量則低1.1%～2.0%。氮肥深施處理中，與 5D 和 20D 相比，10D 下烷基碳、羧基碳、羰基碳、烷基/烷氧以及HA的疏水性分別 高 12.1%～17.6%、0.2%～7.0%、32.7%～178.6%、23.8%～35.4%和6.4%～10.0%，而烷氧碳、芳香碳和芳香氧碳的含量以及HA的芳香性分別低9.5%～13.4%、4.7%～18.1%、17.0%～24.0%和10.0%～18.2%。

表1 2015和2016年水稻收獲期免耕稻田在不同施肥處理下土壤腐殖質中各組分有機碳的含量Table 1 Organic carbon contents in different humic substances under different treatments in no-tillage paddy fields at harvest stages in 2015 and 2016

2.4 LFOM的化學組成

LFOM 中多糖類化合物的相對含量最高，木質素次之，其次是含氮化合物，脂質的相對含量則最低（表3）。氮肥施用措施對LFOM 的化學組成有顯著影響。與SB相比，氮肥深施下多糖和脂質的含量分別顯著增加 9.0%～24.1%（P＜0.05）和 43.2%～68.2%（P＜0.05），10D 下含氮化合物的含量則顯著減少31.1%～32.9%（P＜0.05）。在氮肥深施處理中，與5D和20D相比，10D下多糖的含量顯著提高7.9%～12.4%（P＜0.05），含氮化合物的含量則顯著降低31.5%～34.0%（P＜0.05）。此外，氮肥施用措施對木質素的含量沒有顯著影響。

2.5 土壤胞外酶活性

氮肥施用措施對土壤中各胞外酶的活性都有顯著影響（表4）。與SB 相比，氮肥深施下BG 和NAG 的活性分別顯著降低22.2%～48.8%（P＜0.05）和32.6%～40.4%（P＜0.05），10D 下LLA 和PHO 的活性則分別顯著提高 37.1%～38.5%（P＜0.05）和 11.1%～16.0%（P＜0.05）。氮肥深施處理中，10D 下 BG 的活性在 2015 年比5D和20D顯著降低29.3%～30.3%（P＜0.05），在2016年只比20D顯著降低31.8%（P＜0.05）；10D下LLA的活性則比5D和20D顯著提高25.5%～36.2%（P＜0.05）；此外，10D 下 PHO 的活性在 2015 年比 5D 和 20D 顯著提高9.5%～13.1%（P＜0.05），在2016 年則只比20D 顯著提高11.4%（P＜0.05）。氮肥施用措施對PEO 的活性沒有顯著影響。

表2 2015和2016年水稻收獲期免耕稻田在不同氮肥施用措施下HA中各化學官能團的相對含量（%）Table 2 Relative abundance of different chemical functional groups in HA in no-tillage paddy fields under different treatments at harvest stages in 2015 and 2016（%）

表3 2015和2016年水稻收獲期免耕稻田在不同氮肥施用措施下LFOM中各主要化合物的相對含量（%）Table 3 Relative abundance of dominant compounds in LFOM in no-tillage paddy fields under different treatments at harvest stages in 2015 and 2016（%）

2.6 土壤有機質化學特性與土壤胞外酶活性之間的關系

RDA 結果表明，氮肥深施尤其是氮肥深施10 cm對土壤酶活有顯著影響（圖2）。各胞外酶與HA、HA/FA、C-H/C-O、HYD 和ARM 密切相關。HA、HA/FA、C-H/C-O、HYD、ARM 與LLA、PHO、PEO 呈正相關，與BG、NAG 呈負相關 。另外，LFOM、Ps、Lp 與 LLA、PHO、PEO呈正相關，而與BG、NAG 呈負相關；與之相反的是，Nb 與 BG、NAG 呈正相關，而與 LLA、PHO、PEO 呈負相關；此外，Lg 與 NAG 呈正相關，但與其他胞外酶相關性較低。

3 討論

3.1 氮肥深施對土壤腐殖質有機碳含量及其化學性質的影響

有研究表示，HA是腐殖質中活性最高的成分，可以和無機微量元素螯合形成有機鹽而免于淋失，是植物運輸營養物質和水分的重要介質；此外，它也可以和土壤黏粒結合形成穩定的聚合體，提高土壤物理結構的穩定性，因此HA 對促進作物生長以及提高土壤肥力和質量都有很大的作用[38-39]。HA 的積累也意味著土壤腐殖化程度的提高[26]。本研究結果顯示，與傳統表施相比，氮肥深施顯著提高免耕稻田土壤腐殖質中 HA 的有機碳含量以及 HA 和 FA 的比例（表1），說明氮肥深施特別是深施10 cm 可以顯著提升腐殖質的品質和土壤的肥力。Zhang 等[40]研究也發現，施用氮肥能提高土壤HA 的有機碳含量。HA 主要是植物的凋落物、根系等經微生物降解轉化而形成[41-42]，因此氮肥深施能激發作物生長，從而促使更多植物殘體、凋落物或作物殘茬和秸稈輸入土壤[43]，導致腐殖質中HA 有機碳含量及其在腐植酸中比例的上升。同理，本研究中氮肥深施10 cm 下HA 的有機碳含量比深施5 cm和20 cm時更高（差異顯著，表1），其原因可能是深施10 cm 比深施5 cm 和20 cm 對作物生長的促進作用更強[44]。

本研究表明，氮肥深施顯著改變免耕稻田土壤腐殖質的化學性質（表2）。與傳統表施相比，氮肥深施尤其是深施10 cm 提高了HA 中烷基碳的含量和HA的疏水性（表2）。烷烴屬于土壤碳庫中一種較難分解的脂肪族化合物，其疏水性對土壤有機質的分解和穩定性起著至關重要的作用[45]，因此氮肥深施下烷基碳含量以及HA 疏水性的升高說明氮肥深施相對于傳統表施更有利于土壤腐殖質化學穩定性的提高。然而，本研究發現氮肥深施下芳香族碳含量以及HA的芳香性都顯著降低（表2），意味著HA 中復雜有機化合物的減少，化學結構變簡單[29]。與之類似的是，?ezá?ová 等[46]也發現施肥會降低土壤腐殖質的芳香性和分子量。這可能是氮肥深施下更多的外源碳氮輸入激發了特定土壤微生物群落的活性[44]，從而促進了其對芳香族化合物的氧化分解。此外，本研究結果表明，氮肥深施10 cm土壤PHO的活性比深施5 cm和20 cm 更高（表4），而PHO 酶催化反應的底物酚類屬于芳香族化合物，導致本研究中深施10 cm HA 的芳香性比深施 5 cm 和 20 cm 更低（表2），RDA 結果中PHO 活性與HA 芳香性呈顯著負相關，進一步支撐該推論（圖2）。

3.2 氮肥深施對LFOM 的有機碳含量及化學組成的影響

本研究發現，與傳統表施相比，氮肥深施顯著提高了免耕稻田LFOM 的有機碳含量（圖1），而LFOM與微生物生長和營養供給緊密相關[47-48]，因此該結果表明氮肥深施可以通過改變LFOM 的含量來提高土壤肥力。同樣，有很多研究發現長期施肥會提高土壤中活性有機質的有機碳含量[49-51]。這是因為LFOM等活性有機質更易被微生物分解利用且周轉速率更高，因此更易受到施肥等農業管理措施的影響[52]；此外，LFOM 主要來源于植物和微生物殘體[53-54]，因此，氮肥深施相對于傳統表施能促進作物生長，從而提高作物殘茬、凋零物、秸稈的還田，并激發土壤微生物活性，提高LFOM 有機碳含量[43]。同理，氮肥深施10 cm 比深施5 cm 和20 cm 顯著提高作物生長與微生物群落豐度[44]也可能是本研究中深施10 cm 時LFOM 有機碳含量比深施5 cm 和20 cm 更高（差異顯著，圖1）的原因。

本研究發現，氮肥深施顯著影響免耕稻田LFOM的化學組成。與傳統表施相比，氮肥深施提高LFOM中多糖和脂質的含量，而降低含氮化合物的含量（表3）。氮肥深施下多糖的增多一方面可能是因為氮肥深施促進作物的生長，促使更多的植物殘茬、秸稈和凋落物等外源碳的輸入；另一方面氮肥深施對微生物活性的激發也會導致更多糖的產生[43，55]；此外還可能是因為氮肥深施下土壤DOC和MBC等小分子活性有機碳的增加使得微生物對多糖等大分子有機碳源的需求降低，即減少微生物對多糖的分解利用，導致LFOM 中多糖含量增加[43，56]。氮肥深施下 BG 和 NAG的顯著降低以及BG 和NAG 活性與多糖含量的負相關都進一步論證了這一點（表4 和圖2）。同理，與深施5 cm和20 cm相比，氮肥深施10 cm提高作物生長、微生物群落豐度及小分子活性有機碳含量[44]，這也可能是導致氮肥深施10 cm下LFOM 中多糖含量比深施5 cm 和20 cm 更高（表3）的原因。本研究表明，與傳統表施相比，氮肥深施提高了脂質含量。這可能與氮肥深施促進作物根系的生長有關。作物根系經微生物降解后會產生穩定性較強的脂質化合物[44，57]，因此提高了LFOM 中脂質的累積量。本研究表明，與傳統表施及氮肥深施5 cm 和20 cm 相比，氮肥深施10 cm降低了含氮化合物的含量（表3）。其原因可能是氮肥深施10 cm 對微生物活性的激發促使其對氮素的需求增加[43-44]，從而提高LLA 等分解轉化含氮化合物的酶類的含量，最終導致LFOM 中含氮化合物的消耗。本研究結果中氮肥深施10 cm 處理下更高的LLA 活性以及LLA 活性與含氮物之間的顯著負相關也印證了這一點（表4和圖2）。

3.3 氮肥深施對土壤胞外酶活性的影響

本研究發現，與傳統表施相比，氮肥深施顯著降低了免耕稻田土壤中BG 和NAG 的活性，而氮肥深施10 cm 顯著提高了LLA 和PHO 的活性（表4），說明氮肥深施尤其是深施10 cm 顯著改變土壤的酶活性。相對于動植物等同樣能產生酶的有機體，土壤胞外酶主要由微生物群落產生；與動植物相比，土壤微生物群落的代謝活性更高且生命周期更短[58]。據此可以推斷，氮肥深施主要通過影響土壤微生物群落來改變土壤胞外酶的活性。有研究表明，施肥提高土壤微生物的活性和酶活性[59]，但本試驗結果顯示氮肥深施對各胞外酶活性的影響并不一致（表4）。如前所述，與傳統表施相比，氮肥深施下更高的土壤微生物群落豐度可能是本研究中更高的LLA、PHO 和PEO 活性的原因，而BG 和NAG 活性的下降則可能與氮肥深施下含量更高的DOC和MBC會在一定程度上替代多糖成為微生物群落的有機碳源有關[44]。同理，不同氮肥深施措施下（深施5、10 cm 與20 cm）微生物群落豐度和DOC、MBC 含量的差異[44]可能是造成氮肥深施10 cm具有更低BG 活性和更高LLA、PHO 活性的主要原因（表4）。

4 結論

（1）與傳統表施相比，氮肥深施通過促進作物和微生物群落生長提高土壤有機質各組分的有機碳含量。

（2）與傳統表施相比，氮肥深施通過調控β-葡萄糖苷酶和β-N-乙酰氨基葡糖苷酶的活性改變土壤有機質的化學特性。

（3）與傳統表施相比，氮肥深施提高土壤惰性有機質穩定性，促進活性有機質的有效性，最終改善土壤肥力和質量。

（4）3 種氮肥深施措施中深施10 cm 改善土壤肥力和質量的效果最佳，因此氮肥深施尤其是深施10 cm值得在免耕稻田生產中得到進一步推廣。