具有線粒體靶向功能的穿心蓮內(nèi)酯TPP-PEG-PE脂質(zhì)體的制備及其作用于胃癌模型小鼠的機(jī)制研究

安麗麗，孫賀軍#，孔永紅，王新明，趙成龍

具有線粒體靶向功能的穿心蓮內(nèi)酯TPP-PEG-PE脂質(zhì)體的制備及其作用于胃癌模型小鼠的機(jī)制研究

安麗麗1，孫賀軍1#，孔永紅1，王新明1，趙成龍2, 3*

1. 駐馬店市中心醫(yī)院 藥學(xué)部，河南 駐馬店 463000 2. 河南省人民醫(yī)院 消化內(nèi)科，河南 鄭州 454002 3. 河南省中醫(yī)藥研究院，河南 鄭州 450004

制備穿心蓮內(nèi)酯（andrographolide，AP）(3-丙羧基)三苯基溴化膦［(3-carboxy propyl) triphenylphosph-onium bromide，TPP］-聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）-聚乙烯（polyethylene，PE）脂質(zhì)體（AP@TPP-PEG-PE#Lips），研究其體外釋放、溶血性、線粒體靶向性、促胃癌細(xì)胞凋亡和作用胃癌模型小鼠的機(jī)制。采用薄膜水化法制備AP@TPP-PEG-PE#Lips，檢測(cè)該脂質(zhì)體的粒徑、電勢(shì)、顯微電鏡形態(tài)、穩(wěn)定性、溶血性及體外釋放情況；流式細(xì)胞儀測(cè)定胃癌細(xì)胞對(duì)脂質(zhì)體的攝取情況，激光共聚焦顯微鏡研究其在線粒體的靶向性；評(píng)價(jià)AP@TPP-PEG-PE#Lips對(duì)胃癌細(xì)胞凋亡和胃癌模型小鼠的影響。AP@TPP-PEG-PE#Lips粒徑為（23.8±1.7）nm，Zeta電位為（30.2±1.1）mV，分布較為均勻，規(guī)則球形結(jié)構(gòu)；體外試驗(yàn)表明，AP@TPP-PEG-PE#Lips溶血率低、緩釋性能和血液相容性好；熒光試驗(yàn)結(jié)果顯示，TPP-PEG- PE#Lips可以促進(jìn)藥物的細(xì)胞攝取；AP@TPP-PEG-PE# Lips作用胃癌細(xì)胞和胃癌模型小鼠結(jié)果顯示，AP@TPP-PEG-PE#Lips可以明顯降低胃癌細(xì)胞線粒體膜電位，增加細(xì)胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）含量，促進(jìn)半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）的釋放，增加促凋亡蛋白B淋巴細(xì)胞瘤-2（Bcl-2）和減少抗凋亡蛋白Bcl2-associated X（Bax）的表達(dá)。AP@TPP-PEG-PE#Lips可以有效的將藥物遞送到線粒體，增強(qiáng)藥物促腫瘤細(xì)胞凋亡作用。

線粒體靶向；穿心蓮內(nèi)酯；TPP-PEG-PE；脂質(zhì)體；細(xì)胞攝取；胃癌；體外釋放；溶血性；細(xì)胞凋亡；薄膜水化法；活性氧；Caspase-3；Bcl-2；Bax

穿心蓮(Burm. f.) Nees是爵床科的藥用植物，也稱為“苦味之王”，具有清熱解毒、涼血消腫的功效[1-2]。穿心蓮內(nèi)酯（andrographolide，AP）是從穿心蓮中提取的二萜內(nèi)酯類化合物。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)AP可以抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖，具有抗癌活性[3-4]。劉奇章等[5]研究發(fā)現(xiàn)，AP對(duì)胃癌SGC7901細(xì)胞具有很好的抑制作用，該成分通過(guò)線粒體途徑誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡，上調(diào)Caspase-3和促凋亡蛋白Bax表達(dá)，下調(diào)抑凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)；另外，還可以通過(guò)上調(diào)細(xì)胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平，促使線粒體膜電位崩潰，抑制胃癌SGC7901細(xì)胞的生長(zhǎng)。盡管如此，但AP存在水溶性和脂溶性均差的成藥性問(wèn)題，藥物遞送效率不高，嚴(yán)重限制了AP在制藥領(lǐng)域內(nèi)的發(fā)展[6]。因此，開發(fā)一種新型藥物載體解決AP的成藥性問(wèn)題具有重要意義。脂質(zhì)體是目前研究比較熱門的新型藥物遞送系統(tǒng)。它由脂質(zhì)雙分子層組成，內(nèi)部為閉合囊泡，可包載親水性和親脂性藥物，具有優(yōu)良的生物相容性和水溶性，并且很容易通過(guò)各種修飾，提高藥物的靶向性。目前，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于腫瘤藥物的靶向遞送[7-8]。(3-丙羧基)三苯基溴化膦［(3-carboxy propyl) triphenylphosph-onium bromide，TPP］陽(yáng)離子呈正電荷性質(zhì)，常用來(lái)介導(dǎo)腫瘤藥物載體靶向遞送至線粒體，提高藥物的療效[9-11]。因此，本實(shí)驗(yàn)采用TPP陽(yáng)離子修飾脂質(zhì)體，擬將AP遞送到胃癌細(xì)胞線粒體，精確調(diào)節(jié)線粒體功能，明顯增強(qiáng)藥物促腫瘤細(xì)胞凋亡效果。

1 儀器與材料

1.1 儀器設(shè)備

NS-3500激光掃描共聚焦顯微鏡購(gòu)于北京美亞先科技有限公司；Zetasizer Nano ZSP納米粒度電勢(shì)儀購(gòu)于英國(guó)馬爾文公司；FA1004B電子分析天平購(gòu)于上海精密儀器儀表有限公司；JEM-2100透射電子顯微鏡（TEM）購(gòu)于日本電子株式會(huì)社；XPN-100臺(tái)式高速離心機(jī)購(gòu)于貝克曼庫(kù)爾特公司。

1.2 藥品與試劑

AP購(gòu)自四川洪恩植物科技有限公司，批號(hào)20191104，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%；TPP-聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）-聚乙烯（polyethylene，PE）相對(duì)分子質(zhì)量約2500，批號(hào)20191205，PEG-PE相對(duì)分子質(zhì)量約2000，批號(hào)20191103，質(zhì)量分?jǐn)?shù) 均≥90%，PDI均＜0.3，均購(gòu)買于西安瑞禧生物科技有限公司；大豆磷脂，批號(hào)20191109，購(gòu)買于上海太偉藥業(yè)有限公司；膽固醇，批號(hào)20191205，購(gòu)買于成都科龍生化公司；DID紅色熒光染料購(gòu)自西安百螢生物科技有限公司，批號(hào)20191109，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%；線粒體綠色熒光染料（MitoTrackerTMGreen）和細(xì)胞核Hoechst 33258染料購(gòu)自南京沃博生物科技有限公司；色譜甲醇和乙腈購(gòu)自美國(guó)Fisher化學(xué)試劑公司；Caspase-3活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)買于濟(jì)南碧云天生物公司，批號(hào)C1115。

1.3 細(xì)胞株與動(dòng)物

胃癌SGC7901細(xì)胞、MKN45細(xì)胞和胃黏膜上皮GES-1細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所；DMEM培養(yǎng)基（高糖）購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司；Gibco 16000-044胎牛血清（特級(jí)FBS）購(gòu)自上海聯(lián)碩生物科技有限公司。

SPF級(jí)BALB/C裸鼠，雄性，4～5周齡，購(gòu)買于中科院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)遵循河南駐馬店市中心醫(yī)院和河南省人民醫(yī)院有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用的規(guī)定，均符合3R原則。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

2 方法與結(jié)果

2.1 穿心蓮內(nèi)酯TPP-PEG-PE脂質(zhì)體（AP@TPP- PEG-PE#Lips）的制備及特征性分析

2.1.1 AP@TPP-PEG-PE#Lips和AP@PEG-PE#Lips的制備 精密稱取大豆磷脂200 mg，膽固醇20.1 mg，TPP-PEG-PE或PEG-PE 17.2 mg，AP 30 mg，將以上材料和藥物共同溶解于適量體積的混合溶劑［氯仿-甲醇（2∶1）］中[12]，充分溶解后，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中減壓濃縮成膜。真空冷凍條件下干燥5 h，除去殘留有機(jī)溶劑。加入適量的pH 7.4磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS），于37 ℃、200 r/min搖床中避光水化1 h；水浴超聲5 min，使脂質(zhì)膜從瓶壁上完全脫落；0.22 μm微孔濾膜3～5次，即得粒徑均勻分布的脂質(zhì)體AP@TPP-PEG-PE# Lips和AP@PEG-PE#Lips，備用。

2.1.2 粒徑分布和Zeta電位測(cè)定 以移液槍吸取少許AP@TPP-PEG-PE#Lips和AP@PEG-PE#Lips，加入適量蒸餾水稀釋，采用Zetasizer Nano ZS納米粒度電勢(shì)儀測(cè)定粒徑、Zeta電位分布，結(jié)果如圖1所示。AP@TPP-PEG-PE#Lips和AP@PEG-PE#Lips的粒徑分別為（23.8±1.7）、（20.3±1.5）nm；分布較為均勻，PDI分別為0.242±0.011、0.237±0.010；Zeta電位分別為（30.2±1.1）、（32.2±0.8）mV。

2.1.3 TEM觀察 移液槍吸取少量AP@TPP-PEG- PE#Lips和AP@PEG-PE#Lips溶液，滴加在200目銅網(wǎng)上，低溫吹干，TEM下找出各個(gè)樣品最適合觀察的質(zhì)量濃度，最適質(zhì)量濃度下樣品采用常規(guī)的磷鎢酸負(fù)染[13]，最后置TEM下觀察脂質(zhì)體的微觀形態(tài)。電鏡結(jié)果如圖2所示，AP@TPP-PEG-PE#Lips和AP@PEG-PE#Lips均表現(xiàn)為規(guī)則球形結(jié)構(gòu)。

圖1 AP@TPP-PEG-PE#Lips和AP@PEG-PE#Lips的粒徑分布和Zeta電位

圖2 AP@TPP-PEG-PE#Lips (a) 和AP@PEG-PE#Lips (b) 的電鏡圖

特征性分析結(jié)果表明，AP@TPP-PEG-PE#Lips和AP@PEG-PE#Lips基本特性差異不顯著。

2.1.4 包封率及載藥量測(cè)定 吸取AP@TPP-PEG- PE#Lips溶液500 μL，15 000 r/min高速離心5 min，AP@TPP-PEG-PE#Lips截留在0.4 mL超濾離心管內(nèi)（截留相對(duì)分子質(zhì)量10 000，Millipore公司）。加入數(shù)倍甲醇，60 ℃水浴下溶解5 min破壞脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)，促使AP從脂質(zhì)體中解離出來(lái)，采用HPLC法[14]，具體方法步驟參考游利江等的[7]報(bào)道，測(cè)定脂質(zhì)體包封的AP質(zhì)量（內(nèi)）；超濾膜外為游離AP，采用同樣的方法測(cè)定游離AP質(zhì)量（外），計(jì)算脂質(zhì)體的包封率為（81.4±2.2）%；冷凍干燥離心管內(nèi)截留的AP@TPP-PEG-PE#Lips溶液，稱質(zhì)量計(jì)為，計(jì)算AP@TPP-PEG-PE#Lips載藥量為（14.3±1.6）%。

包封率＝內(nèi)/(外＋內(nèi))

載藥量＝內(nèi)/

外為離心后游離AP質(zhì)量，內(nèi)為脂質(zhì)體中AP質(zhì)量，為AP@TPP-PEG-PE#Lips質(zhì)量

2.2 AP@TPP-PEG-PE#Lips體外實(shí)驗(yàn)

2.2.1 紅細(xì)胞溶血性考察 稱取AP、AP@PEG-PE# Lips和AP@TPP-PEG-PE#Lips適量，5 mL生理鹽水溶解后，再依次用生理鹽水半倍稀釋成AP質(zhì)量濃度為5.00、2.50、1.25、0.62、0.31、0.16、0.08 mg/mL的系列溶液，移取以上配制好的AP和AP@TPP- PEG-PE#Lips系列溶液各200 μL至1.5 mL的潔凈Eppendorf（EP）管中，陽(yáng)性對(duì)照EP管中只加200 μL蒸餾水，陰性對(duì)照EP管中只加200 μL生理鹽水，紅細(xì)胞溶血實(shí)驗(yàn)具體操作步驟參考文獻(xiàn)報(bào)道方法[15]。采用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度（），紫外吸收波長(zhǎng)為540 nm。結(jié)果如表1所示，AP@TPP-PEG-PE# Lips和AP@PEG-PE#Lips的溶血率都非常小，基本上保持在5%以下，由此表明，TPP-PEG-PE#Lips具有較好的血液相容性。

溶血率＝(樣品―陰性對(duì)照)/(陽(yáng)性對(duì)照―陰性對(duì)照)

表1 不同AP質(zhì)量濃度的AP@TPP-PEG-PE#Lips對(duì)紅細(xì)胞溶血率的影響 (,n = 3)

2.2.2 穩(wěn)定性考察 將AP@TPP-PEG-PE#Lips放置在4 ℃冰箱中保存56 d，每隔7 d檢測(cè)該脂質(zhì)體的粒徑和Zeta電位，結(jié)果見表2，結(jié)果表明，AP@ TPP-PEG-PE#Lips的粒徑和Zeta電位在冷藏期間基本上變化不大，聚合物分散指數(shù)（polymer dispersity index，PDI）也基本保持在0.3以下，相對(duì)較小。該結(jié)果表明，AP@TPP-PEG-PE#Lips在4 ℃存儲(chǔ)期間具有較好的穩(wěn)定性。

稱取AP@TPP-PEG-PE#Lips約1 mg，加入2 mL胎牛血清培養(yǎng)基（10%）在旋渦混合器上振蕩2 min使藥物完全溶解，加塞封口，于（37±1）℃的恒溫水浴鍋中共同孵育0、4、8、12、16、18、24 h后，按照上述方法處理樣品和測(cè)定樣品，檢測(cè)該脂質(zhì)體的粒徑和Zeta電位，結(jié)果見表3。結(jié)果顯示，AP@TPP-PEG-PE#Lips在血清中粒徑和電位基本同最初狀態(tài)保持一致，檢測(cè)時(shí)由于存在血清蛋白的干擾，故試驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)了少量的偏差。

表2 AP@TPP-PEG-PE#Lips在4 ℃下保存時(shí)穩(wěn)定性考察 (,n = 3)

表3 AP@TPP-PEG-PE#Lips在10%胎牛血清中的穩(wěn)定性考察 (,n = 3)

2.3 AP@TPP-PEG-PE#Lips的體外釋放研究[16]

取AP 0.3 mg、AP@PEG-PE#Lips（含AP 0.3 mg）和AP@TPP-PEG-PE#Lips（含AP 0.3 mg）分別置于Spectrumlabs透析袋（截留相對(duì)分子質(zhì)量為20 000）中，預(yù)定時(shí)間點(diǎn)1、2、6、9、12、15、18、21、24、36、48、72 h采集樣本，紫外分光度光度計(jì)測(cè)定AP質(zhì)量濃度，檢測(cè)波長(zhǎng)540 nm，計(jì)算AP在膠束中的累積釋放率。結(jié)果如圖3所示，游離AP呈快速釋放趨勢(shì)，20 h其累積釋放率就高達(dá)82%，而AP@ PEG-PE#Lips和AP@TPP-PEG-PE#Lips均呈緩釋態(tài)勢(shì)，75 h累積釋放率才達(dá)到85%。總之，三者總體比較，AP@TPP-PEG-PE#Lips釋放藥物最慢，具有較好的緩釋性能。

圖3 AP@TPP-PEG-PE#Lips的體外釋放對(duì)比研究

2.4 細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)

2.4.1 細(xì)胞攝取量考察 將胃癌SGC7901細(xì)胞接種于12孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h，再將制備好的DID@ PEG-PE#Lips和DID@TPP-PEG-PE#Lips（制備方法同AP@TPP-PEG-PE#Lips）加入細(xì)胞液中，使得細(xì)胞培養(yǎng)液中DID質(zhì)量濃度為10 ng/mL，共同孵育1、2、3、4 h后，收集10 000個(gè)胃癌細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度，觀察DID@PEG-PE#Lips和DID@TPP-PEG-PE#Lips是否有細(xì)胞毒性。首先，尋找最適質(zhì)量濃度。然后，在最適質(zhì)量濃度下檢測(cè)樣品熒光強(qiáng)度，計(jì)算細(xì)胞攝入率（uptake rate）[17]。結(jié)果如表4和圖4所示，游離熒光染料DID對(duì)細(xì)胞攝取率沒(méi)有影響；DID@PEG-PE#Lips、DID@TPP- PEG-PE#Lips隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞攝取率也相應(yīng)增多，具有很好的時(shí)間相關(guān)性。孵育3 h時(shí)，兩者的細(xì)胞攝取量基本達(dá)到平衡狀態(tài)，且DID@TPP- PEG-PE#Lips細(xì)胞攝取率明顯高于DID@PEG-PE# Lips（＜0.01）。該結(jié)果表明，TPP陽(yáng)離子能促進(jìn)藥物的細(xì)胞攝取。

表4 不同質(zhì)量濃度AP@TPP-PEG-PE#Lips對(duì)細(xì)胞攝取率的影響 (, n = 3)

A-不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞攝取率 B-3 h細(xì)胞攝取的流式細(xì)胞圖 與DiD@PEG-PE#Lips比較：*P＜0.05 **P＜0.01

細(xì)胞攝取率＝實(shí)驗(yàn)組藥物攝取量/對(duì)照組攝取量

2.4.2 細(xì)胞攝取方式考察 將胃癌SGC7901細(xì)胞接種于12孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)液后，然再分別加入1 mL不同質(zhì)量濃度的抑制劑：150 mg/mL蔗糖（網(wǎng)格蛋白抑制劑）、5 μg/mL環(huán)糊精（小窩蛋白介導(dǎo)抑制劑）、50 mmol/L 2--去氧葡萄糖（2--deoxyglucose，能量抑制劑）、50 μg/mL秋水仙堿（colchicine，微管形成抑制劑，巨胞飲抑制），以不做抑制劑處理的細(xì)胞作為對(duì)照。流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)各組熒光強(qiáng)度分析[18]。結(jié)果如圖5所示，2--去氧葡萄糖和秋水仙堿處理組與對(duì)照組比較，DID@TPP-PEG-PE#Lips的細(xì)胞攝取率明顯減少，由此表明，該脂質(zhì)體的細(xì)胞攝取方式屬于能量依賴過(guò)程，以細(xì)胞巨胞飲為主。

圖5 胃癌SGC7901細(xì)胞對(duì)DID@TPP-PEG-PE#Lips的細(xì)胞攝取方式

2.5 線粒體靶向研究

胃癌SGC7901細(xì)胞的前期處理過(guò)程同上，采用DID@TPP-PEG-PE#Lips和DID@PEG-PE#Lips與胃癌細(xì)胞共同孵育1、3 h后，將細(xì)胞取出，以50 nmol/L濃度MitoTracker?Green染線粒體（綠色）5 min，1 mg/mL Hoechst 33342染細(xì)胞核（藍(lán)色）5 min，采用激光共聚焦顯微鏡觀察脂質(zhì)體進(jìn)入細(xì)胞后的胞內(nèi)分布。結(jié)果見圖6-A所示，綠色熒光的線粒體與紅色熒光的脂質(zhì)體重合后顯示為黃色，DID@TPP-PEG-PE#Lips的黃色深度明顯高于DID@PEG-PE#Lips，且具有較好的時(shí)間相關(guān)性，在3 h時(shí)黃色最為明顯。定量結(jié)果見圖6-B，結(jié)果顯示，DID@TPP-PEG-PE#Lips的泊桑分布值明顯高于DID@PEG-PE#Lips，2組比較均具有極顯著性差異（＜0.01），由此可見，TPP陽(yáng)離子能誘導(dǎo)脂質(zhì)體靶向聚集在線粒體周圍，具有很好的線粒體靶向性。

2.6 促腫瘤細(xì)胞凋亡作用

2.6.1 細(xì)胞培養(yǎng) 胃癌SGC7901細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)皿中，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

2.6.2 鋪板密度測(cè)定 鋪板前使用0.05%胰蛋白酶（含0.03% EDTA）消化，制成1 mL細(xì)胞懸液，取10 μL細(xì)胞懸液放于細(xì)胞計(jì)數(shù)板，在倒置顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)算鋪板密度（鋪板密度＝細(xì)胞數(shù)目/10 μL）。

2.6.3 細(xì)胞存活率測(cè)定 待胃癌SGC7901細(xì)胞長(zhǎng)至約80%時(shí)，加入含有不同質(zhì)量濃度藥物的1640培養(yǎng)基。藥物組設(shè)定有：AP、AP@PEG-PE#Lips組、AP@TPP-PEG-PE#Lips組，將其給藥質(zhì)量濃度設(shè)定為0.5、1、2、4、8、16、32 μg/mL，紫外分光光度計(jì)570 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)各組的值，對(duì)照只加PBS，按公式計(jì)算細(xì)胞存活率（細(xì)胞存活率＝加藥/對(duì)照），然后再計(jì)算各組的半數(shù)抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）[19]。結(jié)果如圖7所示，給藥后腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)得到了明顯抑制，尤其是AP@TPP-PEG-PE#Lips，該藥對(duì)胃癌SGC7901細(xì)胞有時(shí)間、質(zhì)量濃度依賴性生長(zhǎng)抑制效果，隨著作用時(shí)間和藥物質(zhì)量濃度的增加，AP@ TPP-PEG-PE# Lips對(duì)胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率明顯升高，在高質(zhì)量濃度下、48 h時(shí)的抗腫瘤效果最為顯著，IC50明顯低于AP@PEG-PE#Lips和AP原料藥，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，AP@TPP-PEG-PE#Lips能明顯增強(qiáng)藥物抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)效果（表5）。

與DiD@PEG-PE#Lips比較：*P＜0.05 **P＜0.01

圖7 AP、AP@PEG-PE#Lips和AP@TPP-PEG- PE#Lips與胃癌細(xì)胞孵育24 h (a)、48 h (b) 后細(xì)胞存活率

表5 AP、AP@PEG-PE和AP@TPP-PEG-PE脂質(zhì)體細(xì)胞存活率的IC50 (, n = 3)

2.6.4 胃黏膜上皮GES-1細(xì)胞的細(xì)胞毒性 胃黏膜上皮GES-1細(xì)胞的處理過(guò)程同胃癌SGC7901細(xì)胞，然后給予以下藥物：AP@TPP-PEG-PE#Lips、AP@ PEG-PE#Lips，給藥質(zhì)量濃度分別設(shè)定為2、4、8、16 μg/mL，空白對(duì)照組為未加藥，共同孵育48 h后，添加MTT和二甲基亞砜，參照以上的方法計(jì)算各組的細(xì)胞存活率，與空白對(duì)照組進(jìn)行比較，其中AP由于具有水不溶性的特點(diǎn)，先將其溶解到DMSO中，配制成母液，再將其配制成16 μg/mL，其中DMSO終濃度為0.2%。結(jié)果如表6所示，不同質(zhì)量濃度下，AP@TPP-PEG-PE#Lips和AP@ PEG-PE# Lips的細(xì)胞存活率差異不大，其中最高質(zhì)量濃度16 μg/mL時(shí)AP@TPP-PEG-PE#Lips的細(xì)胞存活率仍然高達(dá)（93.6±1.7）%，AP@PEG-PE#Lips為 （95.4±2.2）%，由此表明，AP@TPP-PEG-PE#Lips對(duì)正常胃黏膜上皮GES-1細(xì)胞毒性比較小，具有較好的生物相容性。

表6 AP、AP@PEG-PE#Lips和AP@TPP-PEG-PE#Lips對(duì)胃黏膜上皮GES-1細(xì)胞毒性的影響(, n = 3)

2.6.5 Hoechst 33258染色 取適量對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的胃癌SGC7901細(xì)胞，培養(yǎng)于24孔培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至約80%時(shí)，加入藥物組進(jìn)行處理，具體分組同“2.6.4”項(xiàng)，Hoechst染色方法參考官娟等報(bào)道[20]，采用5% Hoechst 33258對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，通過(guò)統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)算Hoechst染色率，即活細(xì)胞的比率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖8，與對(duì)照組相比，所有給藥組的胃癌細(xì)胞均出現(xiàn)了形態(tài)變化現(xiàn)象，尤其是AP@TPP- PEG-PE#Lips處理組，該組的細(xì)胞核出現(xiàn)了顏色變暗、有些出現(xiàn)了碎塊狀致密濃染，Hoechst染色率最高，該結(jié)果提示，AP@TPP-PEG-PE#Lips組具有很好的抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)效果。

**P＜0.01

2.6.6 活性氧水平 取適量對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的胃癌SGC7901細(xì)胞，細(xì)胞處理和給藥同“2.6.5”項(xiàng)，藥物與腫瘤細(xì)胞孵育48 h后，收集細(xì)胞，加入10 μmol/L 2′,7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽（DCFH-DA）熒光探針作用30 min，然后以PBS洗滌2～4次，除去細(xì)胞表面殘留的DCFH-DA，DCFH-DA正常情況下無(wú)熒光，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后分解為DCFH，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)的活性氧升高時(shí)，DCFH與活性氧反應(yīng)生成帶熒光的二氨基熒光素（DCF），可以采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)DCF熒光的強(qiáng)度，從而可以檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧水平。

結(jié)果見表7所示，AP@TPP-PEG-PE#Lips組的DCF熒光強(qiáng)度最高，明顯高于其余3組，具有顯著性差異（＜0.01），由此表明，AP@TPP-PEG-PE# Lips組可以明顯增加腫瘤細(xì)胞內(nèi)活性氧水平，激活線粒體途徑誘導(dǎo)Caspase家族依賴的細(xì)胞凋亡，故具有很好的抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)效果。

2.6.7 Caspase-3活性 胃癌SGC7901細(xì)胞處理和給藥同“2.6.5”項(xiàng)，收集細(xì)胞，棄上清培養(yǎng)液，再采用PBS漂洗干凈，具體步驟參考Caspase-3活性檢測(cè)試劑盒。采用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀，設(shè)置波長(zhǎng)為405 nm，測(cè)定該波長(zhǎng)下的值。結(jié)果見表7所示，與對(duì)照組比較，給藥組的Caspase-3活性升高，其中，AP@TPP- PEG-PE#Lips組的Caspase-3活性最高，驗(yàn)證了TPP-PEG-PE#Lips將較多的AP遞送到線粒體部位，激活Caspase家族依賴細(xì)胞凋亡，故細(xì)胞液中釋放的Caspase-3顯著增加。

2.6.8 線粒體膜電位 胃癌SGC7901的孵育及各組給藥處理同“2.6.5”項(xiàng)方法，給藥完成后收集腫瘤細(xì)胞，采用常用的JC-1（10 μg/mL）熒光探針檢測(cè)線粒體膜電位[21]，以流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光進(jìn)行分析[22]。結(jié)果見表7，以對(duì)照組紅/綠熒光強(qiáng)度比值為基準(zhǔn)，給藥組的該組比值與對(duì)照組進(jìn)行比較，AP@ TPP-PEG-PE#Lips組的熒光比值最小，故促腫瘤細(xì)胞凋亡效果最優(yōu)。

表7 AP、AP@TPP-PEG-PE#Lips和AP@PEG-PE#Lips促腫瘤細(xì)胞凋亡的比較(, n = 3)

與對(duì)照組比較：*＜0.05**＜0.01；與AP組比較：#＜0.05##＜0.01；與AP@PEG-PE#Lips組比較：▲▲＜0.01

*< 0.05**< 0.01control group;#< 0.05##< 0.01AP group;▲▲< 0.01AP@PEG-PE#Lips group

2.6.9 Bax、Bcl-2蛋白表達(dá) 胃癌SGC7901的孵育及各組給藥處理同“2.6.5”項(xiàng)，對(duì)照組為含10%胎牛血清培養(yǎng)基取代藥物。采用Western blotting方法檢測(cè)[23]。以β-actin作內(nèi)參，用Image J圖像分析軟件計(jì)算光密度。結(jié)果如圖9所示，與對(duì)照組比較，給藥組均可明顯降低抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)，提高促凋亡蛋白Bax表達(dá)；其中，AP@TPP-PEG-PE#Lips組調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)效果最明顯，與另外2個(gè)給藥組比較均存在顯著性差異，考慮到Bax和Bcl-2是線粒體凋亡途徑的主要相關(guān)蛋白，據(jù)此推測(cè)，TPP-PEG-PE#Lips有助于將大量藥物靶向聚集再線粒體部位，啟動(dòng)細(xì)胞凋亡通路，從而，導(dǎo)致了相應(yīng)凋亡蛋白出現(xiàn)了明顯的改變。

2.7 AP@TPP-PEG-PE#Lips作用胃癌模型小鼠的效果

在確認(rèn)AP@TPP-PEG-PE#Lips體外對(duì)胃癌細(xì)胞具有促細(xì)胞凋亡后，進(jìn)一步驗(yàn)證AP@TPP-PEG- PE#Lips在胃癌皮下瘤BALB/C小鼠體內(nèi)生物分布情況。選取60只4～5周齡的Balb/c裸鼠，將其置于SPF級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng)，sc約0.1 mL 2×106/mL MKN45細(xì)胞懸浮液于裸鼠左側(cè)腹股溝處，待皮下瘤長(zhǎng)至100 mm3左右。按照隨機(jī)分組原則，將胃癌荷瘤小鼠隨機(jī)分成4組，對(duì)照（生理鹽水）組、AP組（16 mg/kg）、AP@PEG-PE#Lips組（16 mg/kg）和AP@TPP-PEG-PE#Lips組（16 mg/kg），每組15只，分別在第0、4、8天向荷瘤小鼠尾部給予藥物。給藥后每天稱量小鼠體質(zhì)量，測(cè)量小鼠皮下瘤瘤徑，皮下瘤體積計(jì)算公式：體積＝1/2×長(zhǎng)度×寬度2；相對(duì)腫瘤體積＝第天腫瘤體積（V）－第0天腫瘤體積（0）。給藥30 d后，脊椎脫臼法處死小鼠，稱量皮下瘤質(zhì)量。結(jié)果如圖10-a、c、d所示，對(duì)照組和AP組小鼠，皮下腫瘤增長(zhǎng)較快；AP@TPP-PEG- PE#Lips組和陽(yáng)性對(duì)照組能很好地抑制腫瘤生長(zhǎng)；AP@ PEG-PE#Lips組緩慢抑制腫瘤生長(zhǎng)。如圖10-b所示，4組小鼠體質(zhì)量差異不顯著。結(jié)果表明AP@TPP-PEG-PE#Lips和AP@PEG-PE# Lips對(duì)胃癌腫瘤有顯著效果，且無(wú)明顯毒性。

　*P＜0.05 **P＜0.01

2.8 AP@TPP-PEG-PE#Lips在胃癌皮下瘤模型小鼠中的體內(nèi)安全性評(píng)估

上述抑瘤實(shí)驗(yàn)完成后，收集各組小鼠的脾臟、心臟、腎臟、肝臟和肺臟等主要器官以及皮下瘤，將其完全浸入至4%甲醛固定24 h，制作石蠟切片，進(jìn)行HE染色[23]。結(jié)果如圖11所示，給藥后對(duì)照組、AP組（16 mg/kg）、AP@PEG-PE#Lips組（16 mg/kg）和AP@TPP-PEG-PE#Lips組（16 mg/kg）對(duì)胃癌皮下瘤小鼠主要器官均無(wú)顯著損傷。這些結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明AP@TPP-PEG-PE#Lips在哺乳動(dòng)物體內(nèi)應(yīng)用時(shí)安全且毒性小。

2.9 AP@TPP-PEG-PE#Lips在胃癌皮下瘤模型小鼠中的作用機(jī)制研究

2.9.1 活性氧水平 收集各組小鼠的皮下瘤，胰酶消化成懸浮細(xì)胞后，按照“2.6.6”項(xiàng)中具體操作方式，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧水平。結(jié)果如表8所示，AP@ TPP-PEG-PE#Lips組的DCF熒光強(qiáng)度明顯高于其他組，具有顯著性差異（＜0.01）。由此表明，AP@ TPP-PEG-PE#Lips組在體內(nèi)也可以明顯增加腫瘤細(xì)胞內(nèi)活性氧水平，抑制腫瘤生長(zhǎng)。

a-皮下瘤的大體圖片 b-小鼠體質(zhì)量曲線 c-皮下瘤體積生長(zhǎng)曲線 d-皮下瘤質(zhì)量

圖11 AP@TPP-PEG-PE#Lips在胃癌皮下瘤模型中的體內(nèi)細(xì)胞毒性評(píng)估

表8 AP、AP@TPP-PEG-PE#Lips和AP@PEG-PE#Lips促胃癌皮下瘤細(xì)胞凋亡的比較(, n = 3)

與對(duì)照組比較：*＜0.05**＜0.01；與AP組比較：#＜0.05##＜0.01；與AP@PEG-PE#Lips組比較：▲＜0.05▲▲＜0.01

*< 0.05**< 0.01control group;#< 0.05##< 0.01AP group;▲< 0.05▲▲< 0.01AP@PEG-PE#Lips group

2.9.2 Caspase-3活性 收集各組小鼠的皮下瘤，胰酶消化成懸浮細(xì)胞后，按照“2.6.7”項(xiàng)中具體操作方式，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Caspase-3活性。結(jié)果見表8所示，AP@TPP-PEG-PE#Lips組的的Caspase-3活性明顯高于其他組，具有顯著性差異（＜0.05、0.01）。這個(gè)結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明，TPP-PEG-PE#Lips將較多的AP遞送到線粒體部位，激活Caspase家族依賴細(xì)胞凋亡，故細(xì)胞液中釋放的Caspase-3顯著增加。

2.9.3 線粒體膜電位 收集各組小鼠的皮下瘤，胰酶消化成懸浮細(xì)胞后，按照“2.6.8”項(xiàng)中具體操作方式，檢測(cè)線粒體膜電位。結(jié)果見表8，以對(duì)照組紅/綠熒光強(qiáng)度比值為基準(zhǔn)，與對(duì)照組進(jìn)行比較，AP@TPP-PEG-PE#Lips組的熒光比值最小，故促腫瘤細(xì)胞凋亡效果最優(yōu)。

3 討論

胃癌作為臨床上高發(fā)的一種惡性腫瘤，對(duì)其治療手段目前主要以手術(shù)、化療和放療為主。化療和放療治療效果差；手術(shù)對(duì)患者身體損傷較大，且術(shù)后并發(fā)癥多發(fā)，這些都是胃癌治療急需解決的難 題[24-26]。AP根源于中醫(yī)“扶正祛邪”科學(xué)理念，對(duì)惡性腫瘤細(xì)胞具有很好的殺傷作用。研究發(fā)現(xiàn)，AP通過(guò)啟動(dòng)線粒體凋亡通路，顯著抑制胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[27-29]。因此，可以構(gòu)建一種新型靶向給藥系統(tǒng)，將AP精確遞送到腫瘤部位中細(xì)胞線粒體內(nèi)。這對(duì)于提高該藥物的抗腫瘤效果具有重要意義，同時(shí)也為如何治療胃癌等頑固性腫瘤提供了新的研究思路。

增強(qiáng)藥物的療效，改善藥物的成藥性一直是制劑學(xué)研究的熱點(diǎn)。本研究以AP為研究對(duì)象，針對(duì)該藥存在的水難溶性問(wèn)題，采用脂質(zhì)體藥物載體進(jìn)行包裹，提高AP的溶解性和抗腫瘤活性。針對(duì)該藥能上調(diào)胞內(nèi)活性氧水平促使線粒體膜電位崩潰，釋放大量的Caspase-3進(jìn)入細(xì)胞液中，迅速啟動(dòng)線粒體凋亡通路，促發(fā)腫瘤細(xì)胞凋亡。故本研究采用具有線粒體靶向功能的TPP陽(yáng)離子，介導(dǎo)脂質(zhì)體藥物載體進(jìn)入線粒體，制備了AP@TPP-PEG-PE# Lips。AP@TPP-PEG-PE#Lips粒徑為（23.8±1.7）nm，Zeta電位為（30.2±1.1）mV，在電鏡下表現(xiàn)為明顯核殼球狀結(jié)構(gòu)，穩(wěn)定性良好，溶血率微乎其微，體外釋放具有很好的緩釋性能，有助于提高藥物在體內(nèi)的存留時(shí)間。

細(xì)胞攝取試驗(yàn)結(jié)果表明，TPP-PEG-PE#Lips可以明顯促進(jìn)藥物的細(xì)胞攝取，且具有較好的時(shí)間依耐性，一方面由于脂質(zhì)體的磷脂與細(xì)胞膜的磷脂雙分子層能很好的融合，有助于細(xì)胞膜的攝取脂質(zhì)體；另外一方面是由于TPP-PEG-PE#Lips的正電荷性，可以與帶副電荷的細(xì)胞膜相互吸引，借助于正負(fù)電荷的吸引，促進(jìn)脂質(zhì)體的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)；在細(xì)胞攝取方式研究方面，秋水仙堿能夠通過(guò)抑制微管形成從而抑制巨胞飲途徑，2--去氧葡萄糖是細(xì)胞無(wú)法利用的碳源，50 mmol/L時(shí)可阻斷糖酵解，與對(duì)照組比較，DID@TPP-PEG-PE#Lips的細(xì)胞攝取率明顯減少，由此表明，該脂質(zhì)體的細(xì)胞攝取方式屬于能量依賴過(guò)程，以細(xì)胞巨胞飲為主；藥物進(jìn)入細(xì)胞后，由于TPP陽(yáng)離子的正電荷，被帶負(fù)電荷線粒體膜的吸引，故DID@TPP-PEG-PE#Lips可借助于正負(fù)電荷吸引效應(yīng)，聚集在腫瘤細(xì)胞線粒體周圍，從而實(shí)現(xiàn)了藥物的線粒體傳輸。

目前已經(jīng)文獻(xiàn)證實(shí)細(xì)胞膜帶30～60 mV負(fù)電荷，線粒體內(nèi)膜帶150～180 mV負(fù)電荷，兩者負(fù)電荷的疊加作用，可促使TPP陽(yáng)離子聚集于線粒體的能力提高100～500倍，同時(shí)還能克服高黏度細(xì)胞液的阻礙，很大程度上提高腫瘤藥物進(jìn)入線粒體的效率，從而增強(qiáng)了藥物抗腫瘤效果[10-11]。為了驗(yàn)證此推測(cè)，本研究進(jìn)行了AP@TPP-PEG-PE#Lips促腫瘤細(xì)胞凋亡的藥效試驗(yàn)，與AP和AP@PEG- PE#Lips比較，細(xì)胞毒試驗(yàn)顯示AP@TPP-PEG-PE# Lips能夠明顯抑制胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，且對(duì)正常的毒性較小，具有良好的生物相容性，正好驗(yàn)證了中醫(yī)藥“扶正祛邪，祛邪不傷正”的優(yōu)越性；Hoechst 33258染色試驗(yàn)很直觀的揭示了AP@TPP-PEG-PE# Lips誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的效果良好，明顯高于其余2個(gè)給藥組；線粒體凋亡機(jī)制試驗(yàn)結(jié)果顯示，AP@TPP-PEG- PE#Lips可以顯著升高細(xì)胞內(nèi)ROS水平和Caspase-3活性，降低線粒體膜電位，明顯降低抗凋亡蛋白BCl-2表達(dá)，提高促凋亡蛋白Bax表達(dá)。同時(shí)，還進(jìn)行了胃癌皮下瘤實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AP@ TPP-PEG- PE#Lips能顯著抑制胃癌腫瘤體積，而不影響小鼠體質(zhì)量；進(jìn)一步分析其機(jī)制，發(fā)現(xiàn)與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果類似，可以升高細(xì)胞內(nèi)活性氧水平和Caspase-3活性，降低線粒體膜電位等。

綜上所述，AP@TPP-PEG-PE#Lips的粒徑較小，穩(wěn)定性良好，具有良好的生物相容性和線粒體靶向性，能顯著增強(qiáng)藥物促腫瘤細(xì)胞凋亡和抑制腫瘤生長(zhǎng)作用。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 楊雪松, 高慧媛, 張又夕, 等. 穿心蓮內(nèi)酯藥理作用的研究進(jìn)展 [J]. 熱帶醫(yī)學(xué)雜志, 2019, 19(4): 518-522.

[2] 駱瑜, 邱慧, 汪保林, 等. 穿心蓮內(nèi)酯衍生物的合成研究進(jìn)展 [J]. 中國(guó)中藥雜志, 2017, 42(20): 3847-3859.

[3] 黃華坤, 袁曉慧, 張平, 等. 穿心蓮內(nèi)酯對(duì)骨肉瘤143B細(xì)胞的抑制作用及其機(jī)制 [J]. 中國(guó)病理生理雜志, 2020, 36(4): 628-636.

[4] 許洪彬, 綦向軍, 方彩珊, 等. 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接探討穿心蓮內(nèi)酯抗腫瘤機(jī)制 [J]. 中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志, 2020, 40(12): 1312-1319.

[5] 劉奇章. 穿瓜蓮內(nèi)酷對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞G2/M期的周期抑制與誘導(dǎo)線粒體途徑調(diào)亡的研究 [D]. 杭州: 浙江大學(xué), 2015.

[6] 李士平. 水溶性與脂溶性穿心蓮內(nèi)酯的藥理分析及臨床觀察 [J]. 中原醫(yī)刊, 2006, 33(19): 85.

[7] 游利江, 梁颶, 曹德英, 等. 低pH插入肽修飾的載siRNA脂質(zhì)體的制備與體外評(píng)價(jià) [J]. 中國(guó)藥學(xué)雜志, 2020, 55(4): 312-316.

[8] 于平華, 梁菊, 趙歡樂(lè), 等. 多肽修飾的pH敏感脂質(zhì)體研究進(jìn)展 [J]. 中國(guó)藥學(xué)雜志, 2018, 53(11): 849-853.

[9] 于鑫, 郭兆明, 郭兆明, 等. 靶向線粒體的載體給藥系統(tǒng)研究進(jìn)展 [J]. 內(nèi)蒙古大學(xué)學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版, 2017, 48(2): 219-224.

[10] Murphy M P. Targeting lipophilic cations to mitochondria [J]., 2008, 1777(7/8): 1028-1031.

[11] Biswas S, Dodwadkar N S, Piroyan A,. Surface conjugation of triphenylphosphonium to target poly(amidoamine) dendrimers to mitochondria [J]., 2012, 33(18): 4773-4782.

[12] 景恒翠, 王國(guó)生, 于陽(yáng). 肺靶向穿心蓮內(nèi)酯脂質(zhì)體的制備及體外釋放特征 [J]. 亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥, 2010, 6(8): 41-42.

[13] 仲為國(guó), 王富強(qiáng), 王自彬. 三種常用染液對(duì)胞外囊泡的負(fù)染效果評(píng)價(jià) [J]. 中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào), 2017, 39(11): 1441-1443.

[14] 祝文琪, 徐衛(wèi)康, 侯曉林. HPLC-超濾離心法測(cè)定連翹酯苷復(fù)方脂質(zhì)體包封率 [J]. 中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué), 2013, 30(9): 1001-1004.

[15] 劉興國(guó), 白雯靜, 田妮娜. 等. 不同紅細(xì)胞溶血實(shí)驗(yàn)替代兔眼刺激性實(shí)驗(yàn)比較研究 [J]. 科技視界, 2019, 32(109): 232-234.

[16] 徐思寧, 劉紅波, 唐志書, 等. 秦艽總苷脂質(zhì)體的制備及其體外釋放與經(jīng)皮滲透研究 [J]. 中藥材, 2018, 41(6): 1418-1422.

[17] 張強(qiáng), 彭紅, 張利娟. 等. 核酸適配體-順鉑納米脂質(zhì)體藥物的制備及對(duì)人急性淋巴細(xì)胞白血病T淋巴細(xì)胞的靶向治療作用的研究 [J]. 中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志, 2017, 37(5): 413-417.

[18] 官娟, 陸偉躍, 占昌友. 血漿蛋白對(duì)脂質(zhì)體體內(nèi)性能的調(diào)控 [J]. 藥學(xué)學(xué)報(bào), 2019, 54(12): 2240-2250.

[19] 劉暢, 張海華, 柴洋洋，等. 紅樹莓提取物降低油酸誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞脂肪的積累 [J]. 現(xiàn)代食品科技, 2019, 35(2): 24-31.

[20] 李磊, 姚亞超. 青蒿烯對(duì)人宮頸癌Hela細(xì)胞凋亡的影響及作用機(jī)制 [J]. 實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志, 2016, 32(9): 1384-1387.

[21] 任康, 李俊杰, 王亮, 等. 熒光探針JC-1與PI聯(lián)合染色法在豬精子線粒體膜電位檢測(cè)中的應(yīng)用 [J]. 繁殖生理, 2010, 46(9): 18-22.

[22] 李明熹, 屈藝, 母得志. 線粒體自噬對(duì)新生大鼠缺氧缺血腦損傷的影響 [J]. 中國(guó)當(dāng)代兒科雜志, 2017, 19(2): 242-249.

[23] 龐雅湘, 聶啟昊, 劉曉寧, 等. 3種細(xì)胞裂解液提取總蛋白在Western blot中的效果分析 [J]. 河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2019, 40(3): 263-267.

[24] 王蜀梅. 扶正祛邪方在晚期胃癌治療中的應(yīng)用 [J]. 中國(guó)民間療法, 2016, 24(9): 42-43.

[25] 邢增智, 李帥, 陳園園, 等. 中藥復(fù)方協(xié)同化療治療進(jìn)展期胃癌的研究進(jìn)展 [J]. 四川中醫(yī), 2019, 37(2): 218-222.

[26] 曲云慧, 余福兵. 早期胃癌診斷與治療進(jìn)展 [J]. 中華臨床醫(yī)師雜志, 2017, 11(2): 292-296.

[27] Verdera H C, Gitz-Francois J J, Schiffelers R M,. Cellular uptake of extracellular vesicles is mediated by clathrin-independent endocytos is and macropinocytosis [J]., 2017, 266(28): 100-108.

[28] 曹衡玉, 歐陽(yáng)征仁, 尹海輝, 等. 穿心蓮內(nèi)酯激活Nrf2抑制乙醇誘導(dǎo)肝細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷 [J]. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué), 2016, 35(11): 2897-2902.

[29] 鐘富有, 李良東, 黃志華, 等. 穿心蓮內(nèi)酯對(duì)大鼠心肌肥厚及抗氧化作用的影響 [J]. 時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥, 2010, 21(1): 226-227.

Preparation of andrographolide TPP-PEG-PE liposomes with mitochondrial targeting function and its mechanism in gastric cancer model mice

AN Li-li1, SUN He-jun1, KONG Yong-hong1, WANG Xin-ming1, ZHAO Cheng-long2, 3

1. Department of Pharmacy, Zhumadian Central Hospital, Zhumadian 463000, China 2. Department of Gastroenterology, Henan Provincial People’s Hospital, Zhengzhou 454002, China 3. Henan Academy of Chinese Medicine, Zhengzhou 450004, China

To prepare andrographolide (AP) triphenyl phosphate (TPP)-polyethylene glycol (PEG)-polyethylene (PE) liposomes (AP@TPP-PEG-PE#Lips), and study itsrelease, hemolysis, mitochondrial targeting, the mechanism of promoting gastric cancer cell apoptosis and acting on gastric cancer model mice.The membrane hydration method was used to prepare AP@TPP-PEG-PE#Lips; The particle size, electric potential, micro-electron microscopic morphology, stability, hemolysis andrelease of the liposomes were detected; Flow cytometry was used to measure the uptake of gastric cancer cells to liposomes, and laser confocal microscopy to study its mitochondrial targeting; AP@TPP-PEG-PE#Lips in gastric cancer cells and effects of apoptosis and gastric cancer model mice were evaluated.The particle size of AP@TPP-PEG-PE#Lips is (23.8 ± 1.7) nm, the Zeta potential is (30.2 ± 1.1) mV, the distribution is relatively uniform, and the regular spherical structure;tests showed that AP@TPP-PEG- PE#Lips had low hemolysis rate, sustained release performance and good blood compatibility; Fluorescence test results showed that TPP-PEG-PE#Lips can promote the cellular uptake of drugs; AP@TPP-PEG-PE#Lips act on gastric cancer cells and gastric cancer model mice, the results showed that AP@TPP-PEG-PE#Lips can significantly reduce the mitochondrial membrane potential of gastric cancer cells, increase intracellular reactive oxygen species (ROS) content, and promote cysteine The release of Caspase-3 increased the pro-apoptotic protein B lymphocyte tumor-2 (Bcl-2) and decreased the expression of anti-apoptotic BCL2-Associated X (Bax) protein (< 0.05).AP@TPP-PEG-PE#Lips can effectively deliver the drug to the mitochondria and enhance the drug’s effect of promoting tumor cell apoptosis.

mitochondrial targeting; andrographolide; TPP-PEG-PE; liposome; cell uptake; gastric cancer;release; hemolytic; apoptosis; membrane hydration method; reactive oxygen species; Caspase-3; Bcl-2; Bax

R283.6

A

0253 - 2670(2021)07 - 1945 - 12

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.07.011

2020-09-22

河南省衛(wèi)生健康委基金項(xiàng)目（201702161）

安麗麗，主管藥師，研究方向腫瘤藥物的靶向設(shè)計(jì)。E-mail: 1148118202@qq.com

趙成龍，博士，研究方向?yàn)榧{米藥物。E-mail: zhaocl@hotmail.com

#共同第一作者：孫賀軍，主管藥師，研究方向腫瘤藥物的靶向設(shè)計(jì)。E-mail: 1148118202@qq.com

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]