山東蓬萊、平度及東營‘玫瑰香’葡萄香氣比較*

劉孟龍，于 夢，王文霞，杜遠(yuǎn)鵬

（1山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝科學(xué)與工程學(xué)院，泰安271018）（2泰安市東平縣梯門鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)綜合服務(wù)中心）

香氣是葡萄中一類重要的次生代謝物，并且種類眾多，不同的香氣物質(zhì)之間的濃度、特性和相互之間的平衡決定了不同葡萄品種和葡萄酒的風(fēng)格和典型性。在葡萄中鑒定出的幾百種香氣中，最重要的香氣是脂肪族類、苯的衍生物類、醇類、酯類、萜類、吡嗪類和硫醇[1]。而這些香氣又可根據(jù)其不同（相同）的前體和合成路線分為3類：異戊二烯途徑香氣、脂肪酸途徑香氣和氨基酸途徑香氣[2]。脂肪酸途徑香氣，也叫作綠葉揮發(fā)物，包括C6醛類、C6醇類和C6酯類，都是通過以C18多不飽和脂肪酸為前體的脂氧合酶途徑產(chǎn)生，其中VvLOX、VvHPL、VvADH和VvAAT是脂肪酸代謝的關(guān)鍵基因[3-4]。而脂肪酸途徑中的C6酯類，如乙酸乙酯、丁酸乙酯、2-丁烯酸乙酯、己酸乙酯和2-己酸乙酯是葡萄、草莓香氣的主要貢獻(xiàn)者[5]。此外，也有報(bào)道稱直鏈脂肪族類香氣是授粉或預(yù)防病原體入侵的重要信號分子[6]。萜類物質(zhì)通過異戊二烯途徑合成，在促進(jìn)“玫瑰香型”葡萄香氣方面發(fā)揮著重要作用，其特點(diǎn)是具有濃郁的花香和果香風(fēng)味，能賦予葡萄令人舒愉的玫瑰香型風(fēng)味，并且具有較低的感官閾值，即使含量不高，也能貢獻(xiàn)明顯香味。里那醇、香葉醇具有甜淡的玫瑰花香氣，橙花醇具有清甜的橙花和玫瑰花香氣，檸檬烯具有令人愉快的檸檬香氣[7]。

大量的研究表明，不同地域的“風(fēng)土條件”是造成葡萄香氣多樣性的主要原因。所謂的“風(fēng)土條件”主要包括氣候條件、土壤、栽培措施等，這些影響因素以及他們之間的相互作用都會影響葡萄和葡萄酒的質(zhì)量。然而，比起土壤、砧木或栽培方式等對葡萄香氣的研究，氣候條件對葡萄香氣及其他品質(zhì)指標(biāo)的研究仍然較少，尤其是不同生態(tài)因素對香氣的疊加影響[8]。研究發(fā)現(xiàn)，春季的平均溫度會對‘美樂’葡萄采收期的吡嗪類和C6類香氣造成影響[9]。2013年，Pedneault等報(bào)道了生長在加拿大魁北克的耐寒葡萄香氣的積累主要是由漿果生長來驅(qū)動，風(fēng)味發(fā)育受到限制[10]。在輕度缺水的情況下，‘長相思’葡萄的芳香潛力最高，而嚴(yán)重缺水會限制香氣積累，尤其是揮發(fā)性硫醇類香氣[11]。

目前生態(tài)條件對葡萄香氣的影響研究多是在釀酒葡萄上，以鮮食葡萄為研究對象的報(bào)道還比較少。本試驗(yàn)中，為探究氣候因素對玫瑰香型葡萄香氣的影響，以3個產(chǎn)地玫瑰香葡萄為試材，通過探究樣品之間香氣特征的差異，并結(jié)合產(chǎn)地的氣象條件，研究了其香氣與氣象指標(biāo)之間的關(guān)系，以期為實(shí)際生產(chǎn)上通過環(huán)境條件調(diào)控果實(shí)品質(zhì)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為2017年9月上中旬采自蓬萊市（土壤pH值為7.28）、平度市大澤山鎮(zhèn)（土壤pH值為7.26）、東營市六戶鎮(zhèn)（土壤pH值為7.32）的成熟度一致（可溶性固形物含量為20.5%）的‘玫瑰香’葡萄。三地土壤類型均為壤土。取樣植株為10年生‘玫瑰香’成齡樹，籬架栽培。為避免邊際效應(yīng)，每個品種每個重復(fù)取樣20穗，兼顧東西兩側(cè)，共60穗。采后立即用保鮮盒帶回實(shí)驗(yàn)室，使用手持折光儀（PAL-1，日本Atago）測定可溶性固形物含量，一部分液氮冷凍后于-80 ℃冰箱中保存用于香氣成分測定。

1.2 試驗(yàn)方法

香氣物質(zhì)成分的測定參考黃麗鵬等[12]的方法，略有改動。取20 g去籽葡萄樣品（液氮冷凍，-80 ℃冰箱保存）于50 mL三角瓶中，加入0.5 g NaCl粉末（使香氣被充分萃取）、0.5 g PVPP（抑制酚類氧化）、0.5 g D-葡萄糖酸內(nèi)酯（抑制糖苷酶活性）、3 μL 0.822 g/L 2-辛醇內(nèi)標(biāo)和磁力轉(zhuǎn)子，迅速用錫箔紙密封好。將完成活化或熱解析過的萃取頭（DVB/CAR/PDMS）插入樣品瓶距離液面1 cm的頂空部分，在40 ℃、200 r/min加熱攪拌條件下，吸附40 min，使瓶中香氣物質(zhì)達(dá)到氣—固和氣—液平衡，然后取出萃取頭插入氣相色譜進(jìn)樣口250 ℃，熱解析5 min，每個樣品平行測定3次。

GC-MS分析條件：載氣為高純氦氣，流速為1.27 mL/min，手動進(jìn)樣，采用不分流模式，進(jìn)樣口溫度250 ℃。柱溫升溫程序：初始40 ℃，保持2 min，以5 ℃/min升溫至230 ℃，保持5 min。質(zhì)譜接口溫度250 ℃，離子源溫度230 ℃，電離方式EI，電子能量70 eV，全掃描模式，掃描范圍30～450 U。各組分質(zhì)譜經(jīng)計(jì)算機(jī)譜庫（NIST17/WILEY7）檢索及資料分析，再結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行人工解析并確認(rèn)香味物質(zhì)的各個化學(xué)成分，僅保留相似度（SI）大于80，且3次重復(fù)均檢測到的物質(zhì)。

香氣各組分含量（ng/g）＝（各組分峰面積×c內(nèi)標(biāo)×V內(nèi)標(biāo)×1 000）/（內(nèi)標(biāo)峰面積×m）

其中，c內(nèi)標(biāo)表示內(nèi)標(biāo)2-辛醇濃度，0.822 g/L；V內(nèi)標(biāo)表示加入內(nèi)標(biāo)2-辛醇的體積，3 μL；m表示樣品質(zhì)量，20 g。

1.3 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析

氣象數(shù)據(jù)來自國家氣象數(shù)據(jù)網(wǎng)（http://data.cma.cn）。主成分分析采用SPSS 22.0及Excel繪制。聚類熱圖的繪制使用 Origin 2018中的Heatmap包。皮爾遜相關(guān)性矩陣使用Omic Share平臺繪制（https://www.omicshare.com）。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用Excel 2017和DPS軟件。差異顯著性分析采用DPS數(shù)據(jù)分析軟件（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 蓬萊、平度和東營三地的氣象條件

蓬萊、平度和東營三地的氣象條件見表1。圖1是以上三地氣候條件的主成分分析，主成分1（PC1）和主成分2（PC2）分別占總變化的59.505%和40.495%，提取的2個主成分很好地解釋了數(shù)據(jù)的總差異程度。由得分圖可知，蓬萊、平度和東營三點(diǎn)之間坐標(biāo)距離較遠(yuǎn)，即三地在氣候條件上無明顯相似性。結(jié)合載荷圖和表1可知，平度7—9月晝夜溫差、相對濕度均明顯高于其他兩地。蓬萊7月日照時數(shù)比東營同期高36.92%，8月日照時數(shù)比東營、平度同期分別高21.70%、35.66%，因此在得分圖中落在了得分圖中y軸負(fù)半軸。而7—9月較高的月均溫和積溫將東營與其他兩地區(qū)分開來。

表1 蓬萊、平度和東營三地的氣象條件

圖1 蓬萊、平度和東營三地氣候條件的主成分分析

2.2 蓬萊、平度和東營‘玫瑰香’葡萄香氣成分、含量及聚類分析

從表2和圖2可以看出，蓬萊、平度和東營三地‘玫瑰香’葡萄香氣總量從高到低依次為平度＞蓬萊＞東營，平度較東營香氣總量高32.57%；平度、蓬萊、東營三地的香氣種類依次為37、27、30種。此外，平度的‘玫瑰香’葡萄在大部分香氣種類中含量高于其他兩地，其中主要包括脂肪酸合成途徑的C6醛類、醇類和酯類；氨基酸合成途徑的苯衍生物和支鏈脂肪族香氣，如2-乙基-1-己醇；異戊二烯途徑中的降異戊二烯類香氣。來自不同合成途徑的香氣使得平度的‘玫瑰香’葡萄具有更復(fù)雜的香氣層次。

蓬萊的‘玫瑰香’葡萄雖然在脂肪酸途徑和氨基酸途徑的香氣中不占優(yōu)勢，但其異戊二烯途徑的香氣含量高于其他兩地的樣品，比東營的樣品高91.78%，比平度的樣品高22.01%。其中主要包括玫瑰醚、橙花醚和里那醇等，這些低閾值的香氣是‘玫瑰香’葡萄“玫瑰香味”的主要貢獻(xiàn)者。因此，雖然蓬萊‘玫瑰香’葡萄在香氣總量和種類上不如平度的樣本，但是它具有更典型的‘玫瑰香’葡萄的香味。

與蓬萊和平度的‘玫瑰香’葡萄相比，東營的樣本不僅香氣總量最低，在表征成熟果香味的C6酯類和玫瑰花香的里那醇上也均低于其他兩地。雖然東營的樣本在己醛含量上要比蓬萊和平度的樣品高13.00%和19.61%，但己醛是葡萄中青草味香氣的主要貢獻(xiàn)者。因此，相較于其他兩地的樣本，東營的‘玫瑰香’葡萄不僅青草味略高，在花香和果香上也較為寡淡。此外，通過圖2的聚類結(jié)果可知，由于東營和蓬萊的‘玫瑰香’葡萄在香氣的種類和含量上（尤其是氨基酸途徑和脂肪酸途徑）相似度更高，因此二者的聚類效果更好。

蓬萊、平度、東營三地的‘玫瑰香’葡萄氨基酸途徑香氣含量普遍較低，從高到低依次為平度＞蓬萊＞東營，平度較東營氨基酸途徑香氣含量高311.34%，差異顯著。平度和蓬萊兩地在苯衍生物和支鏈脂肪族類香氣上的積累明顯高于東營，平度和蓬萊兩地較東營在2-乙基-1-己醇上有比較多的積累。

表2 蓬萊、平度和東營‘玫瑰香’葡萄香氣成分及含量

圖2 蓬萊、平度和東營三地‘玫瑰香’葡萄香氣的聚類熱圖

2.3 蓬萊、平度和東營‘玫瑰香’葡萄香氣成分的主成分分析

對3個地區(qū)‘玫瑰香’葡萄香氣數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析（PCA），得到2個成分的得分圖及相應(yīng)的載荷圖（圖3）。其中，主成分1（PC1）和主成分2（PC2）分別占總變化的45.96%和19.85%，該主成分分析的2個成分共代表總變化的65.81%。根據(jù)得分圖中相應(yīng)點(diǎn)之間的疏遠(yuǎn)程度可以得出：3次重復(fù)間的重復(fù)性良好。不同產(chǎn)地之間東營與蓬萊的‘玫瑰香’葡萄香氣組成更相似，這與聚類結(jié)果一致。

東營樣品處于第二象限中，對應(yīng)載荷圖中，可以得出東營地區(qū)的‘玫瑰香’葡萄對己醛和香葉醇有比較豐富的積累。平度樣品處于第四象限中，靠近PC1的正半軸，對應(yīng)載荷圖中，平度‘玫瑰香’葡萄對直鏈脂肪醇、直鏈脂肪酯、苯衍生物、降異戊二烯類香氣有豐富的積累。蓬萊樣品處于第三象限中，靠近PC2的負(fù)半軸，說明蓬萊樣品香氣物質(zhì)較前二者的變化方向不同，主要由PC2影響；對應(yīng)載荷圖中，蓬萊‘玫瑰香’葡萄對萜類、支鏈脂肪族類香氣有豐富的積累。

圖3 蓬萊、平度和東營三地‘玫瑰香’葡萄香氣成分的主成分分析

2.4 蓬萊、平度和東營三地的環(huán)境因子與‘玫瑰香’葡萄主要香氣成分的相關(guān)性分析

為進(jìn)一步探究氣象條件與香氣之間的關(guān)系，就3個產(chǎn)地‘玫瑰香’葡萄的主要香氣成分與其生長季的氣候條件進(jìn)行皮爾遜相關(guān)性分析。相關(guān)性檢驗(yàn)表明：萜烯類香氣及其代表香氣里那醇與7月均溫、7月積溫、7月降雨、9月日照時數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān)，與7、8月日照時數(shù)呈正相關(guān)；C6類香氣與8、9月的月均溫、積溫呈負(fù)相關(guān)，與7—9月相對濕度、晝夜溫差呈顯著正相關(guān)。

圖4 環(huán)境因子與‘玫瑰香’葡萄主要香氣成分的皮爾遜相關(guān)性系數(shù)矩陣

3 討論與結(jié)論

葡萄的香氣受多種因素的影響，其中主要的影響因素是葡萄品種和產(chǎn)地的風(fēng)土條件[13]。而風(fēng)土條件主要包括產(chǎn)地果實(shí)生長季的光照、降雨、溫度、土壤質(zhì)地和肥力等。本試驗(yàn)運(yùn)用了主成分分析和聚類熱圖的手段，明確了蓬萊、平度、東營的氣候差異和香氣特征：蓬萊產(chǎn)地的8月日照時數(shù)高于其他兩地，其以里那醇為代表的萜烯類香氣含量最高；平度產(chǎn)地7—9月較大的晝夜溫差是其氣候特點(diǎn)，而其香氣特征主要表現(xiàn)為豐富的脂肪酸途徑和氨基酸途徑香氣；東營產(chǎn)地7—9月月均溫和積溫最高，而其己醛含量最為豐富。我們進(jìn)一步用皮爾遜相關(guān)性檢驗(yàn)從統(tǒng)計(jì)學(xué)水平分析驗(yàn)證了萜類含量與7、8月的日照時數(shù)呈正相關(guān)，與9月日照時數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān)；晝夜溫差和相對濕度與脂肪族香氣呈正相關(guān)。

脂肪族香氣包括C6醛類、C6醇類和C6酯類，其中以己醛和反式-2-己烯醛為代表的C6醛類因?yàn)槠涮赜械摹扒嗖菸丁睔庀⒂直环Q作是綠葉揮發(fā)物（GLVs），它不僅是下游C6酯類的重要前體，有報(bào)道表明它還是植物在響應(yīng)環(huán)境中生物（非生物）脅迫中的重要信號分子。一般來說，‘玫瑰香’葡萄在果實(shí)發(fā)育過程中以60%的空氣相對濕度為宜[14]，所以我們推測可能是平度7—9月較高的相對濕度促進(jìn)了其GLVs類香氣的大量積累，而GLVs的積累又為下游C6酯類的合成提供了充足的底物。此外，較大的晝夜溫差也可能是促進(jìn)平度脂肪族香氣的原因之一，相似的結(jié)果在‘赤霞珠’葡萄中也有報(bào)道[15]。

萜烯類香氣的積累也受多種環(huán)境因素的調(diào)控，其中光照是重要的環(huán)境因素之一。Bureau發(fā)現(xiàn)遮陰處理會顯著降低游離態(tài)和鍵合態(tài)的里那醇含量[16]，而當(dāng)對果穗完全遮光處理時，游離態(tài)的萜類香氣幾乎無法合成[17]。在本試驗(yàn)中，蓬萊8月日照時數(shù)明顯優(yōu)于其他兩地，而作為中晚熟的品種，8月正是‘玫瑰香’葡萄萜類大量合成的時期。因此我們推測蓬萊產(chǎn)地的‘玫瑰香’葡萄其豐富的萜類香氣應(yīng)該主要?dú)w因于其7、8月充足的日照時數(shù)。值得注意的是，不同時期的光照對萜類香氣的積累可能存在不同效應(yīng)。皮爾遜相關(guān)性檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，7、8月的日照時數(shù)對萜類香氣有正調(diào)控作用，而9月的日照卻對萜類香氣有負(fù)調(diào)控作用。我們推測這可能和萜類香氣的積累模式有關(guān)。據(jù)報(bào)道，萜類一般在果實(shí)轉(zhuǎn)色后期開始大量合成，在果實(shí)成熟時達(dá)到最高峰，而在后熟時期因?yàn)閾]發(fā)會有所下降[18]。就東營而言，9月有充足的光照其‘玫瑰香’葡萄成熟度要優(yōu)于其他兩地，而其7月的日照又劣于其他兩地，因此我們推測不適宜的光照條件可能是東營樣品萜類物質(zhì)含量較低的主要原因。

綜上所述，較大的晝夜溫差促進(jìn)了脂肪族類香氣的合成，果實(shí)轉(zhuǎn)色到成熟時期充足的光照利于萜烯類香氣的合成。