基于RT-PCR檢測對6個香味葡萄品種感染病毒狀況的分析*

李 晨，范旭東，張尊平，胡國君，任 芳，張寶東，董雅鳳

（中國農業(yè)科學院果樹研究所，國家落葉果樹脫毒中心，遼寧興城 125100）

葡萄作為重要的經濟作物，在果樹產業(yè)中有重要的地位。我國鮮食葡萄種植面積多年來一直處于世界第一（OIV.2020）。根據中國統(tǒng)計年鑒2019年統(tǒng)計，我國葡萄栽培主要集中于新疆、河北、山東、云南、遼寧、河南、江蘇、浙江、陜西、廣西等地。香氣是葡萄的重要感官和品質指標，是評價優(yōu)良葡萄種質資源的關鍵因素之一。近年來，隨著消費者對多元化品種的需求，一些香味葡萄品種也因其獨特的感官品質備受人們追捧，‘巨峰’‘玫瑰香’‘夏黑’‘陽光玫瑰’等葡萄品種大面積發(fā)展，尤其是近2年‘陽光玫瑰’成為熱門品種[1]。

葡萄是感染病毒最多的果樹，目前，國內外已報道的葡萄病毒病病原種類有80多種[2]，我國至今報道了18種[3-17]。病毒病害的發(fā)生嚴重影響葡萄的產量和品質。如‘夏黑’感染病毒之后，果實色澤暗淡，易萎蔫失水，風味寡淡，果實含糖量顯著降低，含酸量和總酚含量增加，導致果皮變澀，芳香物質成分改變，嚴重影響了果實品質[18]。葡萄一旦感染病毒，很難徹底根除，并且易通過嫁接或修剪傳染[19]。目前，我國大部分產區(qū)葡萄種植戶在栽培技術標準化方面已經大幅度提升，明顯從追求產量轉變?yōu)樽非筚|量[1]。葡萄病毒病是制約香味葡萄栽培效益提高的重要因素，明確我國香味葡萄品種攜帶病毒的情況對于病毒病防控具有重要意義。

2018—2019年，筆者采用RT-PCR方法對來自13個省（市、自治區(qū)）的6個香味葡萄品種的212個樣品進行了14種葡萄病毒的檢測，包括葡萄卷葉相關病毒1、2、3、4、7（grapevine leafroll-associated virus，GLRaV-1,2,3,4,7）、沙地葡萄莖痘相關病毒（grapevine rupestris stem pitting -associated virus,GRSPaV）、葡萄扇葉病毒（grapevine fanleaf virus,GFLV）、葡萄斑點病毒（grapevine fleck virus,GFkV）、葡萄病毒A（grapevine virus A,GVA）、葡萄病毒B（grapevine virus B,GVB）、葡萄病毒E（grapevine virus E,GVE）、灰比諾葡萄病毒（grapevine pinot gris virus,GPGV）、葡萄漿果內壞死病毒（grapevine berry inner necrosis virus,GINV）和葡萄蠶豆萎蔫病毒（grapevine fabavirus,GFabV），初步明確了我國6個香味葡萄品種的帶毒狀況。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2018—2019年采集來自我國13個省（市、自治區(qū)）的6個香味葡萄品種的樣品212個，其中包括59個‘陽光玫瑰’樣品（來源于安徽、福建、廣西、河南、江蘇、遼寧、山東、上海、云南）、31個‘玫瑰香’樣品（來源于北京、河北、遼寧、天津、浙江）、47個‘巨峰’樣品（來源于安徽、廣西、河北、江蘇、遼寧、山東、上海、四川、浙江）、30個‘夏黑’樣品（來源于山東、上海、江蘇、云南、廣西、安徽）、22個‘水晶葡萄’樣品（來源于貴州）、23個‘著色香’樣品（來源于遼寧和吉林）。

1.2 試驗方法

1.2.1RNA提取及cDNA合成

采用柱式提取方法[20]進行總RNA的提取。反轉錄在1.5 mL滅菌離心管中進行，依次加入滅菌純水20.0 μL、50 μmol/L六堿基隨機引物（上海生工生物工程技術服務公司合成）2.0 μL，總RNA 8.0 μL，離心混勻，72 ℃保溫10 min，冰上放置2 min；加入5×M-MLV buffer 10.0 μL、10 mmol/L dNTPs 2.5 μL、200 U/mL M-MLV逆轉錄酶1 μL、滅菌純水6.5 μL，離心混勻，37 ℃ 10 min，42 ℃ 50 min，70 ℃5 min。合成的cDNA立即用于PCR擴增或置于-20 ℃冰箱中保存。

1.2.2PCR擴增

根據已報道的14種葡萄病毒序列合成特異性引物[21]，以cDNA為模板分別進行PCR擴增，擴增體系為：cDNA2.0 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，10 mmol/L dNTPs 2.5 μL，上下游引物各0.5 μL，rTaq酶0.2 μL，DEPC H2O補足總體積至25 μL。PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。PCR擴增均設陰性和陽性對照，其中，GFLV檢測需采用巢氏PCR方法[21]，進行第二輪擴增。

2 結果與分析

2.1 RT-PCR檢測結果

由表1、圖1可知，59個‘陽光玫瑰’葡萄樣品中帶毒樣品55個，帶毒株率93.22%，檢測到GRSPaV、GFkV、GLRaV-3、GPGV、GVA、GINV、GLRaV-2、GVB、GVE、GFabV、GLRaV-1、GLRaV-4和GFLV共13種病毒，檢出率3.39%～66.10%；31個‘玫瑰香’葡萄樣品中帶毒樣品21個，帶毒株率67.74%，檢測到GRSPaV、GFkV、GLRaV-3、GPGV、GVA、GINV、GLRaV-2、GVB、GVE和GFLV共10種病毒，檢出率3.23%～38.71%；47個‘巨峰’葡萄樣品中帶毒樣品39個，帶毒株率82.98%，檢測到GRSPaV、GFkV、GLRaV-3、GPGV、GVA、GINV、GLRaV-2、GVB、GVE和GLRaV-4共10種病毒，檢出率2.13%～70.21%；30個‘夏黑’葡萄樣品中帶毒樣品19個，帶毒株率63.33%，檢測到GRSPaV、GFkV、GLRaV-3、GVA、GLRaV-2、GVE、GFabV和GFLV共8種病毒，檢出率3.33%～40.00%；22個‘水晶葡萄’樣品中帶毒樣品6個，帶毒株率27.27%，檢測到GVA、GLRaV-2和GVE共3種病毒，檢出率4.55%～22.73%；23個‘著色香’葡萄樣品中帶毒樣品10個，帶毒株率43.48%，檢測到GRSPaV、GFkV和GLRaV-2共3種病毒，檢出率17.39%～26.09%。所有樣品均未檢測到GLRaV-7。

表1 6個香味葡萄品種的病毒檢測結果

圖1 葡萄病毒在212個樣品中的分布情況

2.2 病毒在不同地區(qū)及復合侵染的發(fā)生情況

對212個葡萄樣品檢測結果進行統(tǒng)計分析的結果顯示，來源于不同地區(qū)的同一品種的帶病毒情況存在差異性（表2）。來自福建、廣西、河南、云南、江蘇、安徽等地的‘陽光玫瑰’樣品帶毒率均達100.00%，來自上海的樣品未檢測到葡萄病毒；除來自浙江的‘玫瑰香’外，其他地區(qū)的‘玫瑰香’樣品以及來自各地的‘巨峰’和‘夏黑’樣品中均能檢測到葡萄病毒，且?guī)Ф韭瘦^高；來自遼寧的‘著色香’和貴州的‘水晶葡萄’樣品帶毒率分別為10.00%和27.27%。

表2 不同地區(qū)6個香味葡萄品種病毒侵染情況

病毒復合侵染在6個香味葡萄品種中普遍發(fā)生（表3）。‘陽光玫瑰’以2～5種病毒復合侵染為主，其中2種病毒復合侵染率為25.42%，3種病毒復合侵染率為10.17%。‘玫瑰香’以3種病毒復合侵染為主，復合侵染率為29.03%。‘巨峰’和‘夏黑’以2～4種病毒復合侵染為主，復合侵染率分別為10.64%～21.28%和6.67%～10.00%。‘水晶葡萄’和‘著色香’主要為2～3種病毒復合侵染，復合侵染率分別為9.09%和8.70%。

表3 6個香味葡萄品種病毒復合侵染情況

3 討論與結論

本研究發(fā)現，葡萄病毒在6個香味品種中發(fā)生普遍，其中分布較廣的有GRSPaV、GFkV、GLRaV-3以及近幾年新報道的GPGV和GINV；檢測結果顯示，玫瑰香型的‘陽光玫瑰’和草莓香型的‘巨峰’‘夏黑’以GRSPaV、GFkV、GLRaV-3侵染居多，近幾年報道的GPGV、GINV、GFabV在我國主栽香味葡萄品種中侵染率也較高，例如，玫瑰香型的‘玫瑰香’葡萄以GPGV（38.71%）侵染為主。因此，香味品種中新病毒的發(fā)生和危害需引起高度重視，同時，有必要加強新病毒的傳播途徑研究，從而為其防控提供依據。

近年來，香味葡萄品種栽培面積迅速擴大，苗木生產量大、流通頻繁，極大地增加了葡萄病毒感染幾率[22]。‘陽光玫瑰’‘玫瑰香’‘巨峰’和‘夏黑’栽植范圍廣，來自各地的樣品大部分檢測到葡萄病毒，而‘水晶葡萄’和‘著色香’主要分布于貴州及遼寧，樣品帶毒率相對較低。葡萄病毒復合侵染是一種常見現象，有研究表明，復合感染葡萄卷葉病毒及GVA的植株，危害會加劇[23]，通常復合侵染嚴重的植株病癥表現明顯，果實品質下降，嚴重時可致樹體死亡[24]，給葡萄產業(yè)帶來極大威脅。對6個香味品種的病毒檢測結果統(tǒng)計后發(fā)現，在‘陽光玫瑰’‘巨峰’和‘玫瑰香’上2種及以上葡萄病毒復合侵染現象更普遍，復合侵染率達86.42%、51.08%、48.39%，復合侵染的組合方式有多種，其中‘陽光玫瑰’單個樣品中最多檢測出9種病毒，以GRSPaV、GFkV和GLRaV-3與其他葡萄病毒組合的復合侵染比例最高，而‘玫瑰香’則以GPGV和GINV與其他葡萄病毒組合居多。‘水晶葡萄’與‘著色香’葡萄病毒復合侵染現象不突出，可能與其地域性栽培和扦插繁殖使病毒傳播和累積受限有關。分析結果還發(fā)現，GRSPaV+GFkV+GLRaV-3以及GPGV+GINV的復合侵染率較高，是否與這幾種病毒的傳播途徑有關，有待進一步研究。

本研究初步明確了‘陽光玫瑰’‘巨峰’‘夏黑’‘玫瑰香’‘著色香’‘水晶葡萄’等6個香味葡萄品種的病毒種類及侵染狀況，為其引種栽培、病毒早期檢測及病毒病防控提供了依據。