銀耳子實體及菌絲體膠質化產生的雙核酵母狀孢子萌發條件探索*

陳利丁，劉云超，孔旭強，張琪輝，紀君儀，李 帆，孫淑靜**

（1.福建農林大學生命科學學院，福建 福州 350002；2.古田縣食用菌研發中心，福建 寧德 352200）

銀耳（Tremella fuciformis），俗名白木耳，主要分布于亞熱帶地區，屬于中溫好氣性真菌[1]。銀耳生活史由擔孢子萌發開始至下一代擔孢子成熟結束[2]，擔孢子萌發產生萌發管或繼續無性分裂產生酵母狀分生孢子，萌發管延伸形成單核菌絲[3]，相鄰的2種單核菌絲在生長蔓延過程中互相結合形成雙核菌絲[2]；雙核菌絲繼續扭結形成白毛團，后逐漸膠質化形成原基；原基在適宜條件下，繼續生長為子實體，子實體成熟后，會彈射大量的擔孢子，完成一個完整的生活史[2]。來源于子實體、菌絲體膠質化產生的雙核酵母狀孢子（dikaryotic yeast-like spores from fruiting body and mycelia，FBMds） 是銀耳生活史的一個特殊形態，是銀耳在菌絲體階段、子實體階段由于在濕度過大（游離水過多）、溫度過高、機械碰撞等諸多不利環境下產生的一種應激性反應[2-3，6]，FBMds在一定條件下又可萌發形成菌絲，這在真菌學上稱為“二型現象”[4]。很多學者認為FBMds是菌絲斷裂形成的節孢子[4-5]，鐘德義[6]認為FBMds與菌絲的膠質化程度有關，而不是簡單的菌絲斷裂。

通常情況下，銀耳一旦轉變為FBMds，就很難再恢復為菌絲或子實體形態[8]。正是因為銀耳具有這個特性，在生產、保種過程中，一旦銀耳被發現形態發生轉變，便遭廢棄。但酵母態的銀耳FBMds具有恢復為菌絲或子實體形態的潛能[3]，由FBMds萌發形成的菌絲具有極高的純度，若能穩定傳代，將在育種、保種、基因功能研究等工作中發揮巨大優勢。然而，目前如何使銀耳FBMds由酵母態轉變為菌絲態的報道尚不多，而關于銀耳FBMds萌發效果的研究較為薄弱，萌發率不高，菌絲的產生帶有較大隨機性。在諸多環境因素中，香灰菌浸提液是影響銀耳FBMds萌發的重要因素[5]，同時在特定的固體培養基中，銀耳FBMds也可以產生銀耳菌絲[9]，但時間長，效率低。如何進一步提高銀耳FBMds的萌發率，使其在較短時間內轉變為銀耳純菌絲，并可以繼續穩定傳代，對研究銀耳二型態、銀耳菌種純化、新品種選育具有重要意義。在前人研究基礎上，以銀耳Tr21 FBMds菌株為材料，探究在固體培養條件下香灰菌浸提液、銀耳孢子發酵液對銀耳Tr21 FBMds萌發的影響，以期得到具有較高萌發率的FBMds及能夠穩定傳代的銀耳純菌絲。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

研究中所采用的8株銀耳孢子供試菌株、5株香灰菌供試菌株的名稱和來源見表1。

表1 供試菌株及來源Tab.1 Strains and sources

1.2 試劑與儀器設備

葡萄糖、KH2PO4購自西隴科學股份有限公司；麥芽糖、MgSO4·7H2O購自國藥集團化學試劑有限公司；（NH4）2SO4購自天津市恒興化學試劑制造有限公司，以上試劑均為分析純；酵母粉、蛋白胨購自廣東環凱微生物科技有限公司；瓊脂購自北京索萊寶科技有限公司。

B-190TB正置生物顯微鏡，德國OPTIKA公司；SPX-250B-Z生化培養箱，上海博訊實業有限公司；ZHWY-2102恒溫培養震蕩儀，上海智誠分析儀器制造有限公司；XY-110MW含水量測定儀，常州幸運電子設備有限公司。

1.3 培養基配方

PDA加富培養基（1 L）：土豆200 g、葡萄糖20 g、酵母粉 3 g、蛋白胨 3 g、MgSO4·7H2O 1.5 g、KH2PO41.5 g，ddH2O 1 000 mL。

TSG 促萌發培養基 （1 L）：MgSO4·7H2O 1 g、（NH4）2SO41 g、KH2PO41.5 g、葡萄糖 10 g、麥芽糖10 g、瓊脂粉30 g，香灰菌浸提液400 mL，ddH2O定容 1 000 mL。

PDA加富固體培養基（1 L）：土豆200 g、葡萄糖 20 g、酵母粉 3 g、蛋白胨 3 g、KH2PO41.5 g、MgSO4·7H2O 1.5 g，ddH2O 1 000 mL。

木屑培養基：木屑67%、麩皮30%、葡萄糖2%、石膏1%，料水比1∶1.3。

空白培養基（1 L）：麥芽糖10 g、葡萄糖10 g、MgSO4·7H2O 1 g、（NH4）2SO41 g、KH2PO41.5 g、瓊脂粉 30 g，補水至 1 000 mL[7，11]。

1.4 香灰菌浸提液與銀耳孢子發酵液的制備

1.4.1 香灰菌浸提液制備

用無菌接種鉤從試管中鉤取香灰菌接種塊至PDA加富固體培養基正中央，24℃活化7 d，用6 mm打孔器在長好的香灰菌上打孔，再用無菌接種鉤挑取1塊放在木屑培養基正中央，24℃培養30 d，調整培養基含水量為60%，準確稱量300 g含有香灰菌的木屑培養基，加水1 500 mL沸水浴30 min，4層紗布過濾2次，加水定容至1 L。

1.4.2 銀耳孢子發酵液的制備

用無菌接種環從試管中刮取一環銀耳孢子并劃線至PDA加富固體培養基上，24℃活化7 d，將不同來源活化好的銀耳孢子接種到PDA加富培養基中，25℃搖床培養7 d，600 nm下測定發酵液OD值（光密度值），用無菌水將不同孢子發酵液OD值調整至基本一致，10 000 r·min-1離心5 min，取上清液，過濾除菌（濾膜孔徑0.45 μm）。

1.5 影響銀耳Tr21 FBMds萌發率的因素研究

1.5.1 不同濃度香灰菌浸提液對銀耳Tr21 FBMds萌發率的影響

制備香灰菌HTW01-5的浸提液，向TSG培養基及空白培養基中添加香灰菌浸提液，使TSG培養基香灰菌終濃度分別為10%、20%、30%、40%、50%，制備成含有不同濃度香灰菌浸提液的萌發培養基，121℃滅菌20 min，保存備用。將銀耳雙核酵母狀孢子Tr21 FBMds劃線至不同濃度的TSG培養基上，25℃培養，從第3天開始取樣鏡檢、計數，統計萌發為菌絲的FBMds數與未萌發的FBMds數，計算FBMds萌發率。萌發率（GR，%）計算公式為：

式中：A1為萌發的FBMds總數；A2為未萌發的FBMds總數。

1.5.2 不同來源香灰菌浸提液對銀耳Tr21 FBMds萌發率的影響

制備不同來源香灰菌的浸提液，向空白培養基中添加由1.5.1得出的最佳香灰菌浸提液添加濃度。制備含有不同來源香灰菌浸提液的TSG培養基，121℃滅菌20 min，保存備用。將銀耳Tr21 FBMds劃線至培養基上，25℃培養，從第3天開始取樣、鏡檢并計算FBMds萌發率。

1.5.3 不同來源銀耳孢子發酵液對銀耳Tr21 FBMds萌發率的影響

制備空白培養基，補水至800 mL，每個三角瓶（250 mL） 分裝80 mL，121℃滅菌20 min，保存備用。加熱融化培養基，待培養基溫度下降到60℃左右，每瓶加入20 mL不同來源的孢子發酵液，制備成終濃度為20%的孢子發酵液-萌發培養基（FSG培養基），直接倒平板備用。接種銀耳Tr21 FBMds，25℃靜置培養，從第3天開始取樣、鏡檢并統計FBMds萌發效果。

銀耳孢子發酵液的促萌發效果采用相對程度用0～1描述，對照為空白培養基添加培養孢子的PDA加富培養基，根據菌絲團大小及數量特征進行相關統計。

1.6 統計學處理

不同濃度香灰菌浸提液對銀耳Tr21 FBMds萌發率的影響、不同來源香灰菌浸提液對銀耳Tr21 FBMds的影響試驗中，萌發率統計取3個重復，單因素方差分析均采用IBM SPSS Statistics 19.0軟件處理。

2 結果與分析

2.1 不同濃度香灰菌浸提液對銀耳Tr21 FBMds萌發率的影響

不同濃度香灰菌浸提液對銀耳Tr21 FBMds萌發率的影響見圖1。

圖1 不同濃度香灰菌浸提液對銀耳Tr21 FBMds萌發率的影響Fig.1 Effects of different concentration of Annuloypoxylon stygium extracts on germination rate of Tremella fuciformis Tr21 FBMds

由圖1所示，香灰菌浸提液濃度對銀耳Tr21 FBMds萌發率的影響極大。由第3天Tr21 FBMds萌發率的平均值可知，在一定濃度范圍內銀耳Tr21 FBMds的萌發率隨香灰菌浸提液濃度的增大而提高。其中含40%香灰菌浸提液的培養基FBMds萌發率最高，萌發率為30.12%。香灰菌浸提液的濃度超過40%后，FBMds萌發率無顯著提高。不同濃度香灰菌浸提液銀耳Tr21 FBMds的萌發情況見圖2。

圖2 不同濃度香灰菌浸提液對銀耳Tr21 FBMds萌發的影響Fig.2 Effects of different concentration of Annuloypoxylon stygium extracts on germination of Tremella fuciformis Tr21 FBMds

由圖2可知，從第5天開始，萌發的菌絲會聚集成菌絲團，無法通過震搖、吹打等方式將之分散開，對計數造成較大影響。隨著FBMds培養時間的延長，從顯微形態上看，萌發的FBMds會不斷聚集成菌絲團，且菌絲團會逐漸變大；從菌落形態看，平板菌落隨培養時間的延長，菌落逐漸變大，表層逐漸失水變干，菌落不斷收縮，最終呈溝壑狀，培養到第7天，部分平板菌落邊緣開始出現茸毛狀菌絲，再繼續培養，菌絲不會增多。顯微鏡下銀耳Tr21 FBMds的不同形態見圖3。

圖3 顯微鏡下銀耳Tr21 FBMds的不同形態Fig.3 Differentmorphology of Tremella fuciformis Tr21 FBMds under microscope

由圖3鏡檢結果可知，FBMds具有瓜子狀、橢圓狀和圓形3種形態。FBMds萌發時一頭伸出芽管，呈蝌蚪狀；隨后芽管逐漸延伸、變長甚至分叉，萌發的FBMds逐漸聚集成團，相鄰菌絲發生交合；分叉芽管、成團菌絲在顯微鏡下，可以觀察到明顯的鎖狀聯合。萌發后的銀耳Tr21 FBMds菌絲生長情況見圖4。

圖4 萌發后的銀耳Tr21FBMds在新的TSG培養基上的菌落形態Fig.4 Colony morphology of Tremella fuciformis Tr21 FBMds after germination on new TSG medium

由圖4可知，萌發后的FBMds菌落接種至新的TSG培養基后，開始大量芽殖，待長到一定大小后，菌落周圍產生白色致密菌絲。待菌落周圍菌絲長至一定面積后，對菌絲區域打孔并于新的TSG培養基上繼續傳代，可得到不含雙核酵母狀孢子的銀耳純菌絲。

2.2 不同來源香灰菌浸提液對銀耳Tr21 FBMds萌發率的影響

不同來源香灰菌浸提液對銀耳Tr21 FBMds萌發率的影響見圖5。

圖5 不同來源香灰菌浸提液對銀耳Tr21 FBMds萌發率的影響Fig.5 Effects of different source of Annuloypoxylon stygium extracts on germination rate of Tremella fuciformis Tr21 FBMds

由圖5所示，不同來源的香灰菌對銀耳Tr21 FBMds的促萌發作用也不同。在香灰菌浸提液濃度不變的情況下（濃度40%），加入與銀耳Tr21伴生的原始香灰菌HTW01-5浸提液，銀耳Tr21 FBMds的萌發率最高，為30.34%，與不同來源、相同香灰菌菌種HTY01-SC、HT01-TH的浸提液對Tr21 FBMds萌發率的影響無顯著差異。顯微鏡下其萌發情況見圖6。

由圖6可知，隨著培養天數的增加，不同香灰菌浸提液均可促進FBMds萌發，且菌落形態均逐漸變大、變干燥、溝壑狀菌落愈發明顯。從第7天開始，Tr21 FBMds均能夠形成面積較大的菌絲團。

圖6 不同來源香灰菌浸提液對銀耳Tr21 FBMds萌發的影響Fig.6 Effects of different source of Annuloypoxylon stygium extracts on germination rate of Tremella fuciformis Tr21 FBMds

2.3 不同來源銀耳孢子發酵液對銀耳Tr21 FBMds萌發率的影響

銀耳孢子發酵液也是影響銀耳Tr21 FBMds萌發率的重要因素之一。不同來源銀耳孢子發酵液對銀耳Tr21 FBMds萌發的影響見圖7。

如圖7所示，不同來源的銀耳孢子發酵液均能在一定程度上提高銀耳Tr21 FBMds的萌發率。其中T30-CAS孢子發酵液的影響效果最為顯著，接下來依次為 Tr01、Tr21、T8225-CAS，均能夠形成大面積的菌絲團，見圖8。

圖7 不同來源銀耳孢子發酵液促FBMds萌發效果Fig.7 Effect of different sources fermentation broth of Tremella fuciformis spores on FBMds germination rate

圖8 不同FSG培養基中銀耳Tr21FBMds鏡檢圖與平板菌落形態Fig.8 Microscopic examination and plate colony morphology of Tr21 FBMds of Tremella fuciformis spores on different FSG medium

由圖8鏡檢結果可知，銀耳Tr21 FBMds在含TWY01-GP、T56-CAS孢子發酵液的FSG培養基中形成的菌絲團數量少、面積小、松散度高，且大部分是游離的芽管。比較香灰菌發酵液的促萌發效果，孢子發酵液中多為芽管形式存在，菌絲短，在含T30-CAS平板中有萌發程度高、菌絲團面積大的菌落，與其他平板比較，表面更加干燥，呈瘤狀突起。將促萌發過的銀耳Tr21 FBMds挑取較干燥部分并轉接至添加了不同銀耳孢子發酵液的FSG培養基上培養14 d，菌落呈現出不同的形態見圖9。

圖9 FBMds在不同FSG培養基上菌落形態Fig.9 Colony morphology of FBMds on different FSG media

由圖9所示，在添加了TWW01-AX、TWY01-GP、T56-CAS孢子發酵液的FSG培養基上，部分位置的菌落外觀干燥，另一部分菌落依舊呈濕潤、飽滿的狀態；在含有促萌發效果較好的T30-CAS、Tr01、Tr21、T8225-CAS孢子發酵液的FSG培養基上，菌落呈半干的瘤狀；促萌發效果越好，菌落越干燥，菌落收縮越明顯。含有T30-CAS發酵液的FSG培養基上，僅有少部分平板菌落邊緣會產生纖弱的菌絲。由此可見，不同銀耳孢子發酵液促進FBMds萌發效果顯著低于香灰菌發酵液。

3 討論

當前銀耳FBMds的產生對生產、保種而言均不利[8]。但是酵母態銀耳FBMds具有恢復為菌絲態的潛能，能極大地提高銀耳菌絲的純度，在育種、保種、基因功能研究等工作中均具有較大應用前景。目前，常規的銀耳品種選育方法工作量大、過程煩瑣、育種效率低，而現代化的育種手段尚未取得實質性進展[11]。但無論是原生質體融合育種、誘變育種還是基因工程育種，其最終都要回歸到FBMds的研究上。如何使FBMds由酵母態轉變為菌絲態，是當前銀耳領域需要關注的重點，也是當前銀耳領域向前發展的突破口。

二形態現象在許多真菌中普遍存在，尤以病原真菌如熱帶假絲酵母[12]、白念珠菌[13]等最為典型。銀耳作為二型性真菌，由于其酵母態細胞難萌發菌絲，相較于其他容易在二型態間轉變的真菌，基礎研究薄弱，未有突破性的進展[14]。銀耳FBMds的萌發由芽管開始，萌發的芽管會伸長、分叉，并與其他萌發的銀耳FBMds聚集交合，形成菌絲團，單個FBMds萌發后有鎖狀聯合，這與單倍體的擔孢子萌發的菌絲有本質區別。

銀耳FBMds萌發與許多環境因素有關。劉娟等[5]認為氮源、碳源、培養時間、pH、溫度和香灰菌的胞外液7種環境因素，均對銀耳TrJ38 FBMds向菌絲形態轉化有一定影響。其中過濾除菌后的香灰菌胞外液的添加對FBMds的形態轉化影響最大，能使菌絲型銀耳TrJ38的比率提高到9.89%，但認為FBMds形態的轉變與香灰菌濃度無關。本研究在此基礎上進行改進，揭示了不同香灰菌菌種及濃度對銀耳Tr21 FBMds的萌發率的影響，香灰菌HTW01-5發酵液添加濃度為40%時，銀耳FBMds萌發率達30.34%，同時發現銀耳Tr21原始伴生的香灰菌HTW01-5促萌發作用最強。

在TSG培養基上，FBMds菌落由光滑、濕潤的酵母狀菌落逐漸失水、收縮、變干，最終形成干燥的溝壑狀菌落，部分菌落周邊長出少量肉眼可見的白色菌絲。FBMds菌落的干燥程度及收縮程度與FBMds萌發率息息相關，菌落表面越干燥、溝壑越明顯，FBMds萌發率越高、菌絲團越大。若將萌發的FBMds轉接至新的TSG培養基上，當FBMds菌落長至一定大小后，其周邊長出大量肉眼可見的致密菌絲。除了香灰菌浸提液外，銀耳孢子發酵液也具有促進FBMds萌發的作用。香灰菌浸提液與銀耳孢子發酵液均可以顯著促進銀耳FBMds的萌發，但香灰菌浸提液的促萌發效果明顯優于銀耳孢子發酵液，添加了香灰菌發酵液的培養基所得的菌絲更加粗壯、濃密。

當前銀耳育種主要是通過馴化野生種、不同來源銀耳與香灰菌的配對選育。銀耳雜交育種歷史上也僅報道過2例[15-16]。究其原因主要是銀耳純菌絲較難獲得，導致銀耳只能通過較為原始的方法進行育種。本研究優化了銀耳FBMds的萌發條件，能在不需要大量重復的條件下幾乎能100%獲得銀耳純菌絲，且該銀耳純菌絲具有傳代能力，能繼續在TSG培養基上維持穩定生長；此外，該方法得到的銀耳純菌絲能穩定與香灰菌在木屑培養基上配對出耳。銀耳純菌絲的易獲得與穩定出耳為以菌絲為基礎的雜交育種和以酵母態的FBMds為基礎的誘變育種、原生質體融合育種、基因工程育種等現代化育種方式奠定了基礎。同時，由FBMds萌發得到的菌絲相較于由子實體、白毛團得到的銀耳純菌絲純度高，對菌種純化工作具有極大意義。