粗毛纖孔菌不同極性萃取物對α-葡萄糖苷酶的抑制作用及抗氧化活性研究*

唐 敏，丁 野，楊 陽，謝孟樂，王淑敏，陳長寶，王 歡，**，李 玉**

（1.長春中醫藥大學，吉林省人參科學研究院，人參化學與藥理重點實驗室，吉林 長春130117；2.吉林農業大學食藥用菌教育部工程研究中心，吉林 長春 130118；3.中國熱帶農業科學院環境與植物保護研究所，海南 海口 570100）

粗毛纖孔菌 [Inonotus hispidus (Bull.:Fr.) P.Karst.]，屬于擔子菌門（Basidiomycota） 傘菌綱（A-garicomycetes） 銹革孔菌目（Hymenochaetales） 銹革孔菌科 （Hymenochaetaceae） 纖孔菌屬 （Inonotus）[1]。粗毛纖孔菌具有極高的藥用價值，國內多用于治療消化不良[2]、胃潰瘍[3]等，國外主要用其潤腸通便的功效[4]。王婷等[5]的研究證明了粗毛纖孔菌粗多糖對H22荷瘤小鼠具有一定的抗腫瘤活性，此外，粗毛纖孔菌還可用于治療糖尿病、痛風和關節炎等病癥[6]；粗毛纖孔菌子實體萃取物還具有調節人體免疫力[7]、抗病毒[8]、降血脂[9]等作用。

當體內氧化還原系統失衡時，會引起氧化應激反應，氧化應激反應在糖尿病的發展過程中起著重要的作用。體內血糖濃度過高時，過量的活性氧ROS等會造成機體損傷進而引起糖尿病及其并發癥[10]。據國際糖尿病聯合會（IDF） 報道，2017年全世界約有4.25億糖尿病患者，每年約有11%的人死于糖尿病及其并發癥[11]。α-葡萄糖苷酶抑制劑可用于調節血糖代謝，有效預防糖尿病及血管并發癥等[12]。臨床現有的α-葡萄糖苷酶抑制劑類藥物，如阿卡波糖和伏格列波糖等對糖尿病具有較好的治療效果，但也會導致人體肝、腎組織的不可逆損傷[13]及出現腸胃脹氣、腹瀉、腹部不適等副作用[14]。從藥用真菌資源中挖掘具有抗氧化及α-葡萄糖苷酶抑制作用的天然藥物具有重要的意義。因此，本研究對粗毛纖孔菌子實體4種不同極性萃取物的總酚含量、α-葡萄糖苷酶抑制作用及體外抗氧化能力進行了測定，為開發高效低毒生物降血糖、抗糖尿病藥物及保健品提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

粗毛纖孔菌（I.hispidus） 采集于吉林省延吉市八家子鎮泉水洞林場，由長春中醫藥大學王淑敏教授鑒定，其子實體形態見圖1。

圖1 粗毛纖孔菌子實體Fig.1 The fruiting body of Inonotus hispidus

由圖1可知，粗毛纖孔菌子實體，無柄，革質至軟木栓質。菌蓋平展，外伸可達22 cm，寬可達29 cm，基部厚可達5 cm；表面呈淺褐色，生長活躍時呈金黃褐色，成熟時呈暗褐色，被粗毛，邊緣鈍。孔口表面褐色至暗褐色，多角形，每毫米2個～3個；管口邊緣薄，撕裂狀。不育邊緣明顯，寬可達3 mm。菌肉暗栗褐色，厚可達3 cm。菌管與孔口表面同色，長可達35 mm[15]。

1.2 主要試劑

沒食子酸、α-葡萄糖苷酶、1，1-二苯基-2-苦肼基（DPPH）、2，6-二叔丁基對甲酚 （BHT）、2，4，6-三吡啶基 （TPTZ）、2，2-聯氮-二 （3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸） 二銨鹽（ABTS）、福林酚，購自上海源葉生物有限公司；三氯化鐵、醋酸銨、甲醇、二甲基亞砜（DMSO）、過硫酸鉀，三氯乙酸和硫酸亞鐵等試劑均為國產分析純；4-硝基-α-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG），純度≥99%，為Sigma公司產品。

1.3 主要設備

M200 Pro多功能酶標儀，瑞士TECAN公司；EYELA N1300旋轉蒸發儀、EYELA OSB2200油浴鍋，東京理化器械（株）獨資工廠；BT25s電子分析天平，賽多利斯科學儀器（北京） 有限公司；SHZ-D（III）型循環水真空泵，上海瑞茲儀器設備有限公司；A11BS025粉碎機，德國IKA。

1.4 試驗方法

1.4.1 供試樣品制備

取粗毛纖孔菌子實體130 g，粉碎后過100目篩，經1.2倍體積甲醇連續提取3次，每次24 h，過濾后合并3次提取液，減壓濃縮，得到甲醇粗提物26.8 g。將甲醇粗提物溶解，按極性由小到大順序依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，每個極性分別萃取3次，合并各極性萃取液，減壓濃縮，即得4個不同極性供試樣品。將供試樣品的濃度分別稀釋為 15.625 μg·mL-1、31.250 μg·mL-1、62.500 μg·mL-1、125 μg·mL-1、250 μg·mL-1、500 μg·mL-1、1 000 μg·mL-1進行體外α-葡萄糖苷酶抑制作用及抗氧化能力測定。

1.4.2 總酚含量測定

按照參考文獻[16]，繪制標準曲線。根據Folin-Ciocalteu比色法原理，測定4種不同極性萃取物的總酚含量。將各極性萃取物的終濃度配制為1 000 μg·mL-1，以樣品溶液代替沒食子酸標準品，測定在波長750 nm下的吸光值。

1.4.3 α-葡萄糖苷酶抑制能力測定

按照參考文獻[17]，稍作修改進行測定。用pH 6.8磷酸鹽緩沖溶液（含1%的二甲基亞砜溶液）配置樣品溶液，測定在波長405 nm下的吸光值。以PBS（含1%的DMSO溶液） 為空白對照組，計算4種不同極性萃取物對α-葡萄糖苷酶抑制率（R1，%），公式為：

式中：Ax為樣品吸光值；Ax0為樣品本底吸光值；Ab為對照吸光值；A0為空白吸光值。

1.4.4 DPPH清除能力測定

DPPH是一種較穩定的自由基，溶于有機溶劑呈紫色，當有自由基清除劑類的物質存在時，DPPH自由基接受電子使溶液褪色，不同清除能力的物質會使溶液顏色產生變化，并使最大紫外吸收處的吸收值產生差異[18]。

按照參考文獻[19]，測定反應液在波長517 nm下的吸光值。以甲醇代替樣品為空白組，以同濃度的2，6-二叔丁基對甲酚（BHT） 為陽性對照組。DPPH自由基清除率（R2，%） 計算公式為：

式中：AX為樣品吸光值；AX0為顯色劑本底吸光值；A0為空白吸光值。

1.4.5 ABTS自由基清除能力測定

參考Li等[20]的方法進行ABTS自由基清除能力的測定。測定各反應液在波長734 nm下的吸光值。以甲醇代替樣品為空白組，以BHT為陽性對照組。ABTS自由基清除率（R3，%）計算公式為：

式中：AX為樣品吸光值；AX0為顯色劑本底吸光值；A0為空白吸光值。

1.4.6 總抗氧化能力測定

在酸性條件下，Fe3+可被樣品中還原物質還原為Fe2+的價態，在波長593 nm下具有最大紫外吸收。根據氧化還原反應的比色法原理，將樣品的吸光值換算為硫酸亞鐵的濃度進行比較。

按照參考文獻[21]，配制FRAP工作液及硫酸亞鐵標準溶液。樣品的抗氧化能力以硫酸亞鐵當量（mmol·g-1）表示，即1 g樣品抗氧化能力相當于硫酸亞鐵毫摩爾濃度。測定反應液在波長592 nm下的吸光值，以標準曲線求得硫酸亞鐵濃度（μmol·L-1）定義為FRAP值。FRAP值越大，表示抗氧化能力越強。以無水乙醇為空白組，以BHT為陽性對照組。

1.4.7 數據處理

采用SPSS 20.0軟件對數據進行處理及分析，通過GraphPad Prism 7.00軟件作圖。所有試驗重復3次，數據均以±SE表示。

2 結果與分析

2.1 不同極性萃取物得率

粗毛纖孔菌甲醇粗提物經石油醚、乙酸乙酯、正丁醇溶劑萃取后，不同極性萃取物得率分別為11.9%、4.5%、24.6%。

2.2 不同極性萃取物總酚含量

粗毛纖孔菌子實體不同極性萃取物的總酚提取率的影響見圖2。

圖2 粗毛纖孔菌子實體不同極性萃取物總酚提取率Fig.2 Polyphenol yield of Inonotus hispidus fruiting body extracts

由圖2可知，以沒食子酸標準品的濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線，計算回歸方程（R2=0.997 2） 為：

不同極性溶劑對多酚提取率影響較大，4種萃取物的多酚提取率有顯著性差異（P＜0.001）。乙酸乙酯萃取物多酚提取率最高，可達（10.21±0.03）%，其次分別為正丁醇萃取物（4.85±0.18）%、甲醇萃取物（1.85±0.04）%、石油醚萃取物（1.07±0.02）%。

2.3 不同極性萃取物對α-葡萄糖苷酶的抑制作用

粗毛纖孔菌子實體不同極性萃取物對α-葡萄糖苷酶抑制作用的情況見圖3。

由圖3可知，在試驗濃度范圍內，乙酸乙酯萃取物對α-葡萄糖苷酶的抑制作用顯著高于其他極性萃取物（P＜0.001），且隨樣品濃度升高，抑制率逐漸上升。1 000 μg·mL-1時，乙酸乙酯萃取物對α-葡萄糖苷酶的抑制率最高，為（98.17±0.60）%，其次是正丁醇萃取物（88.60±0.68）%，甲醇萃取物（50.62±1.32）%，石油醚萃取物 （6.12±0.60）%。結果表明，抑制α-葡萄糖苷酶活性的物質主要存在于乙酸乙酯和正丁醇萃取物中。

圖3 粗毛纖孔菌子實體不同極性萃取物對α-葡萄糖苷酶抑制作用的測定Fig.3 The α-glucosidase inhibition of Inonotus hispidus fruiting body extracts

2.4 不同極性萃取物對DPPH自由基清除能力的影響

粗毛纖孔菌子實體4種萃取物對DPPH自由基的清除率的清除率見表1。

如表1所示，石油醚萃取物和乙酸乙酯萃取物對DPPH自由基均具有一定清除作用。500 μg·mL-1、1 000 μg·mL-1石油醚萃取物，125 μg·mL-1、250 μg·mL-1、500 μg·mL-1、1 000 μg·mL-1乙酸乙酯萃取物，DPPH自由基的清除能力與陽性對照BHT相當。

表1 粗毛纖孔菌子實體不同極性萃取物對DPPH自由基的清除率Tab.1 DPPH scavenging activity of Inonotus hispidus fruiting body extracts

2.5 不同極性萃取物對ABTS自由基清除能力影響

粗毛纖孔菌子實體不同極性萃取物對ABTS自由基清除率見表2。

由表2所示，清除率與萃取物濃度呈明顯的效量關系，乙酸乙酯和正丁醇萃取物均顯示出一定的ABTS自由基清除活性。500 μg·mL-1、1 000 μg·mL-1乙酸乙酯萃取物，1 000 μg·mL-1正丁醇萃取物對ABTS自由基清除能力與陽性對照BHT相比，無顯著性差異。

表2 粗毛纖孔菌子實體不同極性萃取物對ABTS自由基清除率測定Tab.2 ABTS free radical scavenging capacity of Inonotus hispidus fruiting body extracts

2.6 不同極性萃取物對總抗氧化能力測定

由FeSO4標準曲線計算回歸方程為：Y=0.569 7X+0.049 7，R2=0.999 3。粗毛纖孔菌子實體不同極性萃取物的總抗氧化能力測定見表3。

由表3可知，4種不同極性萃取物的總抗氧化能力具有明顯的劑量依賴關系。250 μg·mL-1、500 μg·mL-1、1 000 μg·mL-1乙酸乙酯萃取物的 FRAP值，顯著高于陽性對照BHT（P＜0.05）。

表3 粗毛纖孔菌子實體不同極性萃取物的總抗氧化能力測定Tab.3 The total antioxidant capacity of Inonotus hispidus fruiting body extracts

3 討論

當體內積累大量自由基無法正常代謝時，會使人體抗氧化能力下降，同時引發機體產生肺炎、糖尿病、癌癥等病癥[22]。粗毛纖孔菌作為一種珍貴的藥用真菌，其含有的酚類物質可通過在體內調節代謝酶活性[23]，體外清除自由基發揮抗氧化作用[24]。研究結果表明，在4種不同極性萃取物中，乙酸乙酯萃取物總酚含量最高，是石油醚萃取物的9.54倍、正丁醇萃取物的2.11倍、甲醇萃取物的5.51倍；與同濃度的4種不同極性萃取物相比，乙酸乙酯萃取物對α-葡萄糖苷酶的抑制作用最強；清除DPPH、ABTS自由基的能力與陽性對照BHT相比無顯著性差異，總抗氧化能力顯著高于陽性對照BHT。正丁醇萃取物的總酚含量、α-葡萄糖苷酶的抑制能力僅次于乙酸乙酯萃取物，說明粗毛纖孔菌發揮抗氧化作用的有效活性物質主要存在于乙酸乙酯和正丁醇萃取物中。因此，應對乙酸乙酯、正丁醇萃取物進行深層次的藥理活性研究，進一步闡明粗毛纖孔菌發揮降糖、抗氧化作用的機制及途徑，為深入開發粗毛纖孔菌的藥用價值提供理論基礎。