NOS3 基因rs1799983 多態(tài)性與心衰風(fēng)險的關(guān)系的Meta 分析

沈金蓮 米亞非 上官嬌玲

心力衰竭（下稱心衰）是一種由多種因素共同導(dǎo)致的復(fù)雜的臨床綜合征，是所有心血管病發(fā)展的終末結(jié)局。心衰的患病率、病死率均高，疾病負(fù)擔(dān)重，有關(guān)心衰的研究一直是國內(nèi)外的研究重點(diǎn)。隨著分子遺傳生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮型一氧化氮合酶（type Ⅲnitric oxide synthase，NOS3）rs1799983 基因多態(tài)性在心衰中也起到了非常重要的作用。NOS3 以L-精氨酸為底物，在輔酶催化下，利用氧生成一氧化氮（nitric oxide，NO），從而起到保護(hù)血管內(nèi)皮的作用。rs1799983 多態(tài)性，即G894T 或Glu298Asp，是一種錯義突變，在編碼鏈的150999023 位（功能域外）的核苷酸由鳥嘌呤核苷酸（guanine，G）向胸腺嘧啶核苷酸（thymine，T）轉(zhuǎn)化而形成。因而，轉(zhuǎn)錄的第298 個遺傳密碼即從GAG 轉(zhuǎn)變?yōu)镚AT，從而導(dǎo)致翻譯的多肽中的天冬氨酸殘基（aspartic acid，Asp）被替換成谷氨酸殘基（glutamic acid，Glu）。在過去的十余年中，已經(jīng)進(jìn)行了多項遺傳流行病學(xué)研究，以研究NOS3 rs1799983 多態(tài)性與心衰風(fēng)險之間的關(guān)系，但總體而言，目前有關(guān)NOS3 rs1799983 多態(tài)性與心衰風(fēng)險之間聯(lián)系的證據(jù)并不一致。差異可能是由于樣本量小，統(tǒng)計功效低和臨床異質(zhì)性所致。本研究通過Meta 分析，旨在總結(jié)和闡明NOS3 rs1799983 多態(tài)性與心衰風(fēng)險之間的關(guān)系，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料和方法

1.1 檢索策略 以heart failure、dilated cardiomyopathy，polymorphism，genetic、nitric oxide synthase type Ⅲ，rs1799983 為主題詞及相關(guān)的自由詞檢索Cochrane Library、EMbase、PubMed 等英文數(shù)據(jù)庫中相關(guān)文獻(xiàn)；以Ⅲ型NOS、rs1799983、基因多態(tài)性、心力衰竭、擴(kuò)張型心肌病為主題詞及相關(guān)的自由詞，計算機(jī)檢索中國生物醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)服務(wù)系統(tǒng)、中國知網(wǎng)、萬方數(shù)據(jù)庫，并追索納入文獻(xiàn)的參考文獻(xiàn)。檢索時間從建庫至2020 年2 月29 日。

1.2 文獻(xiàn)選擇標(biāo)準(zhǔn) （1）納入標(biāo)準(zhǔn)：嚴(yán)格按照PRISMA 聲明完成，均選取關(guān)于NOS3 與心衰易感相關(guān)性的研究；提供NOS3rs1799983 多態(tài)性的基因型和等位基因頻率；提供充足的數(shù)據(jù)計算OR和95%CI；病例對照研究；可獲取全文；對源于同一人群、數(shù)據(jù)使用一致的重復(fù)發(fā)表文獻(xiàn)，選擇樣本量最大的一篇文獻(xiàn)納入。（2）排除標(biāo)準(zhǔn)：數(shù)據(jù)不全；基于譜系數(shù)據(jù)的研究、病例報告、綜述、評論、摘要以及基礎(chǔ)研究。

1.3 數(shù)據(jù)提取與處理 首先由2 位研究人員采用統(tǒng)一的數(shù)據(jù)提取表，獨(dú)立提取資料，而后交叉核對，必要時聯(lián)系原文獻(xiàn)作者，以確定試驗的具體實(shí)施過程。在納入標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，納入下列信息：第一作者、發(fā)表年份、地區(qū)、種族、心衰類型（根據(jù)左心室射血分?jǐn)?shù)分為減少型、混合型、保留型）、心衰病因、基因檢測方法、病例組總數(shù)、對照組總數(shù)、研究質(zhì)量分?jǐn)?shù)、病例組及對照組中3 種基因型的例數(shù)（GG、GT、TT）、G等位基因頻率、哈代溫伯格定律（Hardy Weinberg Equilibrium，HWE）檢驗值、研究質(zhì)量分?jǐn)?shù)。2 位研究者在數(shù)據(jù)提取過程中若有爭議，由第3 位研究者一起參照原文討論后協(xié)助解決。

1.4 納入研究的質(zhì)量評價 3 位研究人員根據(jù)在先前研究中完善的質(zhì)量評估表（表1）獨(dú)立評估研究的質(zhì)量。分?jǐn)?shù)范圍從0 分到13 分，其中0 分為最低質(zhì)量，13 分為最高質(zhì)量。

表1 質(zhì)量評估表

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用Stata 15 統(tǒng)計軟件對對照組進(jìn)行哈代溫伯格定律（Hardy Weinberg Equilibrium，HWE）檢驗，若P＞0.05，則認(rèn)為該樣本來自同一孟德爾群體，符合遺傳平衡；采用Stata 15 軟件統(tǒng)計進(jìn)行Meta 分析。對多種基因模型進(jìn)行分析，包括等位基因遺傳模型（T 與G），共顯性遺傳模型（TT 與GG、GT 與GG），顯性遺傳模型[（TT+GT）與GG]和隱性遺傳模型[TT 與（GT+GG）]。計算OR及其95%CI，采用雙側(cè)檢驗，顯著水準(zhǔn)為α=0.05，以測量NOS3 rs1799983 多態(tài)性與心衰之間關(guān)系的強(qiáng)度。分別采用數(shù)值方式（I2統(tǒng)計量、Q檢驗的P值）及圖示方式（拉貝圖）對各研究的結(jié)果進(jìn)行異質(zhì)性檢驗。I2值表示研究中由異質(zhì)性而不是機(jī)遇引起的異質(zhì)性百分比。P值＜0.1 及I2值＞50%被認(rèn)為具有異質(zhì)性。當(dāng)出現(xiàn)異質(zhì)性時，采用亞組分析及靈敏度分析（metaninf）探索異質(zhì)性來源。若各研究間無明顯統(tǒng)計學(xué)異質(zhì)性，采用固定效應(yīng)模型進(jìn)行合并分析；如結(jié)果間存在明顯統(tǒng)計學(xué)異質(zhì)性但未發(fā)現(xiàn)來源于臨床異質(zhì)性，則可采用隨機(jī)效應(yīng)模型法進(jìn)行數(shù)據(jù)合并。應(yīng)用Stata 15 統(tǒng)計軟件進(jìn)行漏斗圖和Egger’s 檢驗分析，判斷納入文獻(xiàn)是否存在發(fā)表偏倚，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 文獻(xiàn)篩選流程結(jié)果 見圖1。

由圖1 可見，初步檢索獲得文獻(xiàn)305 篇，根據(jù)納入排除標(biāo)準(zhǔn)最終納入文獻(xiàn)9 篇。

2.2 納入研究基本情況 9 篇文獻(xiàn)中，其中對亞洲人研究2 篇，對高加索人研究5 篇，對混合人種研究2篇[1-9]。研究對象的人群基本特征、基因型特征、HWE檢驗值、研究質(zhì)量分?jǐn)?shù)等信息完整。納入心衰患者共1 202 例，對照人群共1 380 例。納入研究的具體特征見表2，其基因型具體數(shù)據(jù)及HWE 驗證見表3。

由表2、3 可見，高質(zhì)量研究6 篇，分別為：Moncores[8]，Oliveira[9]，Goppe[4]，張美紅[3]，Tepliakov[5]。

各研究病例組、對照組基因型數(shù)據(jù)完整，僅有1項研究不符合HWE。

2.3 Meta 分析結(jié)果

2.3.1 關(guān)聯(lián)性分析 見圖2。

由圖2 可見，各個遺傳模型相關(guān)性結(jié)果分別為：（1）T 比G：OR=1.16，95%CI：0.75 ～1.79，P=0.509，I2=77.1%，P異質(zhì)性=0.000；（2）TT 比GG：OR=1.01，95%CI：0.68～1.51，P=0.960，I2=78.1%，P異質(zhì)性=0.000；（3）（TT+GT） 比GG：OR=1.01，95%CI：0.68～1.49，P=0.958，I2=79.3%，P異質(zhì)性=0.000；（4）TT 比（GG+GT）：OR=1.01，95%CI=0.56 ～1.84，P=0.968，I2=62.5% ，P異質(zhì)性=0.006。在各個遺傳模型分析中，OR的95%CI均跨越無效線（OR=1），且各模型顯著性檢驗P＞0.05，初步說明NOS3 rs1799983 與心衰風(fēng)險無明顯相關(guān)性。

2.3.2 異質(zhì)性檢驗 見圖3。

圖1 文獻(xiàn)篩選流程圖

表2 Meta 分析中相關(guān)研究具體特征表

表3 各研究中基因型、等位基因頻率、病例組和對照組樣本量及HWE 檢驗值的總結(jié)表

圖2 NOS3 rs1799983 多態(tài)性與心衰風(fēng)險關(guān)聯(lián)性分析的森林圖[A：等位基因模型（T 比G）；B：共顯性遺傳模型TT 比GG；C：顯性遺傳模型（TT+GT）比GG；D：隱性遺傳模型TT 比（GG+GT）]

由圖3 可見，在大多數(shù)模型中，不同研究之間的異質(zhì)性較大（P異質(zhì)性＜0.1，I2＞50%），不可忽略。

2.3.3 靈敏度分析 見圖4。由圖4 可見，在等位基因遺傳模型中，2013 年張美紅等[3]的研究可能是造成異質(zhì)性的原因。在共顯性及顯性遺傳模型中，2018 年Oliveira 等[9]的研究可能是造成異質(zhì)性的原因。在隱性遺傳模型中，2011年劉佼磊等[2]的研究可能是造成異質(zhì)性的原因。

圖3 異質(zhì)性分析的拉貝圖[A：等位基因模型（T 比G）；B：共顯性遺傳模型TT 比GG；C：顯性遺傳模型（TT+GT）比GG；D：隱性遺傳模型TT 比（GG+GT）]

圖4 靈敏度分析[A：等位基因模型（T 比G）；B：共顯性遺傳模型TT 比GG；C：顯性遺傳模型（TT+GT）比GG；D：隱性遺傳模型TT 比（GG+GT）]

2.4 亞組分析結(jié)果 見表4。

由表4 可見，在按心衰類型進(jìn)行分類的亞組分析中，大部分模型異質(zhì)性下降，但僅發(fā)現(xiàn)保留型的隱性遺傳模型中基因型TT 與心衰風(fēng)險增加顯著相關(guān)，而在混合型及減少型中結(jié)果差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。在按HWE、研究質(zhì)量進(jìn)行的亞組分析中，各模型異質(zhì)性無明顯降低，結(jié)果示差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。

在按人種進(jìn)行亞組分析時，各個模型均有不同程度的異質(zhì)性下降。在混合人種中，4 種遺傳模型結(jié)果均可見差異有統(tǒng)計學(xué)意義。在亞洲人種中，僅發(fā)現(xiàn)在隱性遺傳模型下心衰風(fēng)險增加。在高加索人中，各個模型中結(jié)果顯示差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。

根據(jù)樣本量大小進(jìn)行亞組分析時（以250 為界點(diǎn)分大樣本與小樣本），小樣本的異質(zhì)性均顯著降低，且除外隱性模型，其余結(jié)果顯示差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。大樣本中各模型組差異亦均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。

2.5 發(fā)表偏倚分析 見表5。

由表5 可見，各個模型的Egger’s 檢驗均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。結(jié)合上述靈敏度分析，沒有發(fā)現(xiàn)單項研究對結(jié)果產(chǎn)生重大影響，由此可以表明本研究結(jié)果較為穩(wěn)定。

表4 亞組分析結(jié)果

表5 Meta 分析主要結(jié)果及發(fā)表偏倚檢測表

3 討論

在完整的內(nèi)皮細(xì)胞中，激素和物理刺激導(dǎo)致NOS3 表達(dá)生成NO，NO 擴(kuò)散到血管平滑肌細(xì)胞中，刺激可溶性鳥苷酸環(huán)化酶生成環(huán)狀鳥嘌呤單磷酸，最終導(dǎo)致平滑肌松弛。NO 也對心肌等血管外組織器官起著相似的作用，同時也在炎癥調(diào)節(jié)、血管生長以及血小板聚集等方面起重要調(diào)節(jié)作用[10-11]。以往已有諸多證據(jù)表明，內(nèi)皮功能障礙在射血分?jǐn)?shù)減少型心衰患者病理生理機(jī)制中起到重要作用[12-15]。激活的神經(jīng)體液信號、心肌釋放的炎癥因子以及局部剪切力的改變共同調(diào)節(jié)了基因的表達(dá)，增加氧化應(yīng)激的產(chǎn)生，從而減少NO 的合成。由此產(chǎn)生的內(nèi)皮功能障礙又繼而導(dǎo)致炎癥因子的產(chǎn)生增加，NOS3 表達(dá)的下調(diào)或解偶聯(lián)以及氧化應(yīng)激的進(jìn)一步加重[16]。上述過程最終導(dǎo)致NO 生物利用度降低和內(nèi)皮功能障礙惡化，繼而加重心衰的進(jìn)展。同時，由于心衰觸發(fā)了心肌NO 生成的變化，從NOS3 調(diào)節(jié)NO 生成轉(zhuǎn)變?yōu)檎T導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible NOS，NOS2）產(chǎn)生的NO的過度釋放，從而對心肌造成了負(fù)性肌力作用。

關(guān)于NOS3 rs1799983 突變基因T 表達(dá)的產(chǎn)物，一方面，起初有研究認(rèn)為，該產(chǎn)物會在細(xì)胞內(nèi)被裂解，從而產(chǎn)生兩個無效片段（N-末端35-kDa 和C-末端100-kDa 片段），因此導(dǎo)致體內(nèi)NO 的生成減少[17]。在2019 年的一項大型Meta 研究中也得出突變基因T 導(dǎo)致NO 生成減少的結(jié)論[18]。然而，又有研究認(rèn)為當(dāng)時無效片段產(chǎn)物其實(shí)是與酸性環(huán)境下水解相關(guān)的，而突變基因T 的產(chǎn)物活性并未見明顯降低[19]。另一方面，多項研究發(fā)現(xiàn)該多態(tài)性與內(nèi)皮功能障礙相關(guān)，而Coceani 和Leeson 等[20-21]也通過對248例受試者進(jìn)行基因型分析后認(rèn)為，基因的表型與環(huán)境因素與飲食因素也密切相關(guān)。因而，盡管以往有關(guān)NOS3 rs1799983 多態(tài)性在心血管領(lǐng)域中的多項研究均認(rèn)為突變基因T 是疾病的危險因素，是心血管發(fā)病率和死亡率的重要因素之一[22-28]，但對rs1799983 多態(tài)性與疾病之間的聯(lián)系的機(jī)制始終未能清晰闡明。

本Meta 分析發(fā)現(xiàn)NOS3 rs1799983 多態(tài)性與心衰發(fā)病無關(guān)。9 項研究包括心衰患者1 202 例，對照人群1 380 例，樣本主要來自俄羅斯、巴西、中國、印度和加拿大，包括亞洲人種、高加索人種及混合人種（高加索人種及非裔黑人）。但本研究存在局限性。一方面，樣本量偏少，同時研究之間的異質(zhì)性顯著。另一方面，有諸多研究認(rèn)為，NOS3 多態(tài)性之間互相關(guān)聯(lián)。有學(xué)者認(rèn)為真正影響內(nèi)皮功能障礙或NO 合成的從而影響心衰的不是7 號外顯子上的突變，而是啟動子區(qū)的T-786C 突變[29]；也有學(xué)者認(rèn)為只有結(jié)合3 個位點(diǎn)基因的單倍體-786C/4b/Asp298 才是真正起作用的[9]。

通過亞組分析可得出，人種可能是異質(zhì)性來源之一。在混合人種中，除共顯性模型下NOS3 rs1799983 多態(tài)性導(dǎo)致了更高心衰風(fēng)險，其余3 個模型均顯示保護(hù)作用。綜合考慮，突變基因T 表現(xiàn)為保護(hù)作用。在亞洲人種中，則僅在隱性模型下看到了NOS3 rs1799983 多態(tài)性帶來的心衰高風(fēng)險。首先，關(guān)于基因型頻率，在以往其他疾病如高血壓等研究中也發(fā)現(xiàn)存在人種之間的區(qū)別，且往往與人種起源相關(guān)[30-32]。在前面所述觀察性研究中發(fā)現(xiàn)野生型純合子GG 在心衰患者中占主導(dǎo)地位，且與不良預(yù)后相關(guān)。本研究所納入的2 項混合人種的研究與觀察性研究結(jié)果相符，此2 項研究中人群均來自巴西，以白人及黑人為主。5 項高加索人研究中卻未發(fā)現(xiàn)差異有統(tǒng)計學(xué)意義，此可能與該組研究之間異質(zhì)性太大，存在其他不可平衡因素影響最終結(jié)果有關(guān)。其次，除了基因型分布區(qū)別，還與諸多人種相關(guān)其他因素有關(guān)。如據(jù)Framingham 隨訪研究報道非洲人發(fā)生心血管病風(fēng)險高于其他種族、黑人存在更多的內(nèi)皮功能障礙及NO 生物可利用度降低等。

在對心衰類型進(jìn)行亞組分析時，僅在保留型中發(fā)現(xiàn)NOS3 rs1799983 可能通過隱性遺傳導(dǎo)致心衰風(fēng)險增加，而該結(jié)果恰恰也來自于亞洲人種的2 項研究。在對研究質(zhì)量分類的亞組分析中結(jié)果示差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義。因此該基因多態(tài)性的表達(dá)與心衰類型、HWE 及研究質(zhì)量均無關(guān)。

本Meta 分析中存在多項偏倚。（1）僅針對單個基因位點(diǎn)突變與心衰風(fēng)險之間的關(guān)系，而未考慮其他一些存在基因間相互作用的基因位點(diǎn)。如：T786C，VnTR4a/b；（2）由于各研究中人群基本信息不夠完整，如缺乏重要的性別比例、平均年齡等數(shù)據(jù)，無法對此類混雜因素進(jìn)行進(jìn)一步分析；（3）由于滿足納入標(biāo)準(zhǔn)的研究數(shù)量有限，因此在rs1799983多態(tài)性與心衰之間的關(guān)聯(lián)分析中納入了相對較少的樣本量。這會降低統(tǒng)計功效，并可能導(dǎo)致Ⅰ型錯誤。

總之，本研究通過對NOS3 rs1799983 多態(tài)性與心衰易感性相關(guān)進(jìn)行Meta 分析，結(jié)果表明NOS3 rs1799983 多態(tài)性與心衰易感性無關(guān)，但在混合人種中，突變基因T 可能存在保護(hù)作用。由于目前符合納入標(biāo)準(zhǔn)的研究及樣本量均明顯有限，上述結(jié)果缺乏足夠的把握度，尚需在全世界、各種族間開展更多大樣本、控制混雜因素如年齡性別伴隨疾病等、隨機(jī)、對照、符合HWE 的研究加以驗證，同時不可忽視基因之間、基因與環(huán)境之間的相互影響。