NLRP3炎性小體與糖尿病心肌病的發(fā)生發(fā)展

黃芷棋，寧一博，賀潤鋮，孫建寧，董世芬

(北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院中藥藥理系，北京 102488)

糖尿病心血管并發(fā)癥是糖尿病的首要致死原因，病變部位包括大血管和微血管，由微血管彌漫性損傷造成的糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是當(dāng)前的熱點(diǎn)研究之一。糖尿病性心肌病是1972年由Rubler等[1]首次提出。作為糖尿病特異心臟并發(fā)癥，DCM可獨(dú)立于冠狀動(dòng)脈疾病、高血壓或瓣膜性心臟病發(fā)生心肌功能障礙，并與糖尿病患者的心力衰竭高發(fā)生率和高死亡率密切相關(guān)。

DCM早期臨床癥狀不明顯，與其它糖尿病并發(fā)癥相比研究相對(duì)滯后，確切的發(fā)病規(guī)律至今尚未完全闡明，也尚無公認(rèn)的診療方法。疾病早期，高胰島素血癥、胰島素抵抗、游離脂肪酸和外周血循環(huán)瘦素水平增高以及腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS)激活即可誘導(dǎo)左心室肥厚發(fā)生[2]，表現(xiàn)為心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)改變、左心室容積、室壁厚度和緊張性、左心室重量等增加；隨著甘油三酯堆積和Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)缺陷，成纖維細(xì)胞增殖以替代死亡的心肌細(xì)胞，并由轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor beta1，TGF-β1)介導(dǎo)心肌細(xì)胞的纖維化[3]，導(dǎo)致左心室舒張功能下降，并逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)橐詳U(kuò)張型心臟重塑為特點(diǎn)的收縮功能障礙，進(jìn)一步可能發(fā)展成為缺血性心臟病和心衰[4]。

目前公認(rèn)的發(fā)病機(jī)制包括高血糖、蛋白非酶糖基化、氧化應(yīng)激、心肌纖維化、鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)異常、脂肪酸氧化增加以及神經(jīng)內(nèi)分泌功能激活等[5]。有研究指出，炎癥是糖尿病患者左室舒張功能障礙的獨(dú)立相關(guān)因素[6]。近年發(fā)現(xiàn)NLRP3炎性小體在機(jī)體炎癥反應(yīng)中起著重要作用，NLRP3炎性小體可通過促進(jìn)DCM心臟炎癥，從而影響心臟功能。本文綜述NLRP3炎性小體在DCM發(fā)生發(fā)展過程中的作用，以為深入闡釋該疾病的病理進(jìn)程以及相關(guān)藥物的開發(fā)提供借鑒。

1 NLRP3炎性小體及其激活機(jī)制

炎性小體是由模式識(shí)別受體(pattern recognition receptor，PRRs)形成的多蛋白復(fù)合物，是先天免疫應(yīng)答的重要組成部分。模式識(shí)別受體包括Toll樣受體(Toll-like receptors，TLR)、核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor，NLR)、黑色素瘤缺乏因子2受體(absent in melanoma 2，AIM2)等[7]。大多數(shù)NLR包含3個(gè)結(jié)構(gòu)域，即C端富亮氨酸重復(fù)區(qū)域(leucine-rich repeats，LRR)、中央核苷酸結(jié)合和寡聚化結(jié)構(gòu)域(nucleotide-binding oligomerization domain，NACHT)、N端熱蛋白結(jié)構(gòu)域(pyrin domain，PYD)。

核苷酸結(jié)合寡核苷酸結(jié)合域樣受體蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3)是最常見的炎性小體。典型的NLRP3炎性小體復(fù)合物是一種胞內(nèi)蛋白復(fù)合物，由“感應(yīng)蛋白”NLRP3、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD, ASC)和“效應(yīng)器”pro-caspase-1組成[7]。NLRP3炎性小體廣泛分布于免疫細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞等，還可分布于非免疫細(xì)胞，如成纖維細(xì)胞和心肌細(xì)胞等，許多疾病發(fā)生時(shí)(高血壓、糖尿病、糖尿病心肌病、動(dòng)脈粥樣硬化、抑郁癥、阿爾茨海默病、哮喘等)，可發(fā)現(xiàn)NLRP3表達(dá)上調(diào)。

NLRP3炎性小體的活化由啟動(dòng)和組裝兩個(gè)獨(dú)立且平行的步驟實(shí)現(xiàn)。第一步啟動(dòng)階段，Toll樣受體識(shí)別病原體相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)或損傷相關(guān)分子模式(damage-associated molecular patterns，DAMPs)后，誘導(dǎo)NF-κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)轉(zhuǎn)錄，上調(diào)NLRP3、pro-IL-1β、pro-IL-18的表達(dá)；第二步組裝階段，繼續(xù)由各種PAMPs、DAMPs或病原微生物刺激介導(dǎo)，并促進(jìn)NLRP3、ASC和pro-caspase-1寡聚進(jìn)而激活NLRP3炎性小體，隨后產(chǎn)生有活性的caspase-1。caspase-1的激活將無活性的促炎細(xì)胞因子pro-IL-1β、pro-IL-18切割為其對(duì)應(yīng)成熟的分泌因子IL-1β和IL-18，并介導(dǎo)細(xì)胞焦亡(pyroptosis)[7]。細(xì)胞焦亡是一種細(xì)胞程序性死亡，其表現(xiàn)與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞壞死的特征部分重疊，如DNA損傷、TUNEL染色陽性、Annexin V染色陽性、細(xì)胞膜上孔隙形成、細(xì)胞裂解等[8]。因此，NLRP3、caspase-1、IL-1β表達(dá)增加以及細(xì)胞焦亡是NLRP3炎性小體異常激活并介導(dǎo)炎癥的主要表現(xiàn)。

目前的相關(guān)研究[9]通常把NLRP3炎性小體的激活概括成三條不同的信號(hào)通路：① 細(xì)胞外ATP誘導(dǎo)K+通過嘌呤能受體(purinergic ligand-gated ion channel 7 receptor，P2X7)外排，從而導(dǎo)致NLRP3炎性小體的組裝和激活；② PAMPs和DAMPs觸發(fā)活性氧(reactive oxygen species，ROS)的生成，促進(jìn)NLRP3炎性小體的組裝和激活；③ 細(xì)胞內(nèi)形成的結(jié)晶或顆粒結(jié)構(gòu)導(dǎo)致溶酶體破裂以及溶酶體內(nèi)容物如組織蛋白酶B的釋放，從而誘導(dǎo)NLRP3炎性小體的組裝和激活。此外，NLRP3炎性小體的組裝和激活還涉及到其他觸發(fā)因素，包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ER stress)、自噬功能障礙和Ca2+超載等。

Fig 1 The signaling pathway of NLRP3 inflammasome activation

2 NLRP3炎性小體與糖尿病心肌病

NLRP3炎性小體已被證實(shí)與糖尿病心肌病中無菌性炎癥反應(yīng)有關(guān)，抑制NLRP3炎性小體可有效減輕DCM炎癥反應(yīng)，從而改善DCM 胰島β細(xì)胞功能受損、心肌損傷以及心肌纖維化等過程。

2.1 NLRP3炎性小體參與DCM胰島β細(xì)胞功能受損胰島β細(xì)胞數(shù)量減少或功能受損導(dǎo)致高血糖是糖尿病的重要發(fā)病機(jī)制之一。糖尿病的長期高血糖狀態(tài)可引起持續(xù)性炎癥、氧化應(yīng)激和心臟收縮功能障礙，是DCM的始發(fā)因素。

研究表明，NLRP3炎性小體可通過分泌IL-1β參與2型糖尿病心肌病的胰島損傷過程。Schroder等[10]發(fā)現(xiàn)在2型糖尿病發(fā)病過程中，胰島持續(xù)的高血糖狀態(tài)引發(fā)糖酵解增加并過度刺激線粒體電子傳遞鏈導(dǎo)致ROS的生成，ROS作為激動(dòng)劑激活NLRP3炎性小體并分泌成熟的促炎細(xì)胞因子IL-1β。IL-1β升高會(huì)引起β細(xì)胞死亡和功能障礙，導(dǎo)致葡萄糖刺激的胰島素分泌減少，加速糖尿病的進(jìn)程。使用IL-1受體拮抗劑(interleukin-1 receptor antagonist，IL-1Ra)可改善胰島素分泌和降低血糖，提高胰島β細(xì)胞存活率，從而改善胰島功能。通過敲除慢性肥胖小鼠的NLRP3基因，可保護(hù)胰島β細(xì)胞免受細(xì)胞死亡，從而減緩肥胖向糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)展[11]?？紫榈萚12]發(fā)現(xiàn)糖化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products，AGEs)可通過ROS途徑激活巨噬細(xì)胞中的NLRP3炎性小體并分泌IL-1β?lián)p傷胰島β細(xì)胞，沉默NLRP3基因可改善該過程。

硫氧還蛋白相互作用蛋白(thioredoxin-interactingprotein，TXNIP)是調(diào)節(jié)胰島β細(xì)胞生理病理學(xué)功能的關(guān)鍵蛋白。相比其他類型細(xì)胞，TXNIP主要在分泌胰島素的β細(xì)胞中高度表達(dá)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通過PERK和IRE1通路上調(diào)TXNIP的表達(dá)，TXNIP作為促發(fā)因子激活NLRP3炎性小體并增加IL-1β分泌，導(dǎo)致β細(xì)胞損傷[13]。另外，該過程分泌的IL-1β能夠與胰島β細(xì)胞表面的IL-1受體(interleukin-1 receptor，IL-1R)結(jié)合，從而誘導(dǎo)其自身表達(dá)，形成更多的IL-1β，加速糖尿病病情的發(fā)展[14]。在糖尿病心肌病模型中，高血糖誘導(dǎo)的ROS生成增多可促使硫氧還蛋白和TXNIP的復(fù)合物解離，隨后TXNIP以依賴氧化還原的方式激活NLRP3炎性小體進(jìn)而產(chǎn)生一系列的生理活動(dòng)影響胰島的結(jié)構(gòu)和功能[15]。

2.2 NLRP3炎性小體參與DCM心肌損傷過程心肌細(xì)胞壞死、凋亡和肥大是造成DCM患者心臟結(jié)構(gòu)和功能損傷，甚至發(fā)展成為心衰的重要原因。糖尿病高糖、高脂環(huán)境下心肌細(xì)胞ROS增多，可促進(jìn)NLRP3炎性小體激活。李雪蓮等[16]研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠心肌組織中活性氧水平升高，心肌凋亡細(xì)胞明顯增加以及心肌間質(zhì)呈現(xiàn)明顯的膠原纖維堆積，同時(shí)心肌組織中NLRP3和IL-1β基因陽性表達(dá)上調(diào)。采用藥物抑制NLRP3炎性小體激活可明顯減輕炎癥和改善心臟功能。Luo等[17]發(fā)現(xiàn)用高糖刺激的H9c2心肌細(xì)胞，其caspase-1表達(dá)升高，并出現(xiàn)細(xì)胞焦亡。沉默NLRP3基因后糖尿病大鼠心肌細(xì)胞焦亡和心肌纖維化顯著減少，心臟功能改善。提示NLRP3-caspase-1依賴的細(xì)胞焦亡是DCM發(fā)生時(shí)心肌細(xì)胞死亡的一個(gè)重要因素。

心肌細(xì)胞凋亡與心肌細(xì)胞肥大兩種損傷形式可相互作用，進(jìn)而影響心臟功能。NLRP3炎性小體不僅通過IL-1β促進(jìn)結(jié)構(gòu)性心肌病，也可通過IL-1β加重左心室肥厚。Lim[18]研究表明，AGEs可以通過激活NF-κB-NLRP3-IL-1β信號(hào)通路誘導(dǎo)心肌肥大。NLRP3敲除可抑制血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，AngⅡ)刺激引起的心肌細(xì)胞肥大。

2.3 NLRP3炎性小體參與DCM心肌纖維化過程心臟纖維化的特征是由纖維狀膠原組成的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)在心肌間質(zhì)中過多沉積。心臟纖維化會(huì)導(dǎo)致疤痕組織積累，左心室僵硬度增加，可引發(fā)心臟功能障礙。研究發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠心臟成纖維細(xì)胞內(nèi)NLRP3炎性小體活化水平升高。Zhang等[19]表明在DCM的高糖環(huán)境下，ROS和P2X7R可以介導(dǎo)NLRP3炎性小體激活，促進(jìn)新生大鼠心臟成纖維細(xì)胞膠原合成，導(dǎo)致心肌纖維化。相反，H3松弛素(H3 Relaxin)能夠在高糖環(huán)境下明顯減弱P2X7受體介導(dǎo)的NLRP3炎性小體激活，從而抑制心臟成纖維細(xì)胞膠原合成[20]。也有研究表明，NLRP3炎性小體的激活會(huì)抑制了心肌成纖維細(xì)胞中cAMP的釋放并抑制心肌收縮[21]。體外研究表明，IL-1β、IL-18均可通過劑量依賴性的方式刺激膠原蛋白的表達(dá)，具有促心肌纖維化作用[22]。

Bracey等[23]發(fā)現(xiàn)，在TGF-β1的刺激下，心臟成纖維細(xì)胞中NLRP3炎性小體的表達(dá)增加。另外，NLRP3在心臟成纖維細(xì)胞中可以不依賴于細(xì)胞因子釋放的新機(jī)制促進(jìn)纖維化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，這主要表現(xiàn)在NLRP3通過NACHT結(jié)構(gòu)域促進(jìn)R-Smad活化和心肌成纖維細(xì)胞分化?；罨腞-Smad與Co-Smad 結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物從而促進(jìn)促纖維化基因的表達(dá)。在體內(nèi)，NLRP3缺失的心臟成纖維細(xì)胞對(duì)TGF-β的反應(yīng)表現(xiàn)為肌成纖維細(xì)胞分化受損和R-Smad活化減少。提示NLRP3可直接促纖維化作用。

3 中藥對(duì)糖尿病心肌病NLRP3炎性小體的干預(yù)作用

目前中藥對(duì)糖尿病心肌病NLRP3炎性小體的干預(yù)研究起步較早，且多局限于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方面。云芝是一種傳統(tǒng)藥用真菌，其提取物具有抗腫瘤，免疫調(diào)節(jié)等作用?，F(xiàn)研究表明，云芝提取物可以通過抑制NF-κB通路減弱NLRP3炎性小體激活，使得DM大鼠caspase-1、IL-1β、IL-18和NLRP3炎性小體水平降低，從而減輕心臟炎癥和改善心功能。此外，云芝提取物還可以通過抑制TGF-β1/ Smad信號(hào)傳導(dǎo)，減輕DM大鼠的心臟纖維化[24]。

絞股藍(lán)為葫蘆科植物絞股藍(lán)Gynostemmapentaphylla(Thunb.)Makino的全草，又名七葉膽、落地生、遍地生根。絞股藍(lán)皂苷(Gypenoside，GPS)是絞股藍(lán)的主要活性成分之一，具有抗炎、降血糖、保護(hù)心臟等作用。在H9C2細(xì)胞及DCM的小鼠模型中均發(fā)現(xiàn)高糖誘導(dǎo)NLRP3炎性小體活化可引起心肌細(xì)胞凋亡。高糖通過劑量依賴性促進(jìn)ROS產(chǎn)生從而活化NLRP3炎性小體。絞股藍(lán)皂苷通過降低線粒體ROS的水平，即調(diào)節(jié)NLRP3炎性小體的啟動(dòng)步驟，抑制NLRP3炎性小體的激活以及IL-1β和IL-18的分泌，進(jìn)而改善糖尿病心肌病的心肌損傷[25]。

槲皮素是一種天然黃酮類化合物，廣泛存在于槐花、桑葉、銀杏葉、旋覆花、車前子等中藥。糖尿病大鼠模型經(jīng)槲皮素治療后，可明顯抑制炎性小體蛋白表達(dá)量，改善心肌間質(zhì)纖維化病變及心肌凋亡。這表明，槲皮素可通過介導(dǎo)NLRP3炎性小體減輕糖尿病大鼠中高糖誘導(dǎo)的心功能受損[16]。

柚皮素(naringenin)屬于二氫黃酮類化合物，是枳殼、枳實(shí)、骨碎補(bǔ)、化橘紅等中藥的主要有效成分之一。柚皮素可通過下調(diào)心臟組織的NLRP3炎性小體蛋白(NLRP3、caspase-1和ASC)、IL-1β及I型膠原蛋白、FN纖粘連蛋白，進(jìn)而減少心肌細(xì)胞凋亡、改善心肌纖維化，抑制心肌重構(gòu)[26]。

中藥成分熊果酸(ursolic acid，UA)廣泛存在于植物界中，如山楂、夏枯草、白花蛇舌草、梔子、車前草等。通過高脂喂養(yǎng)聯(lián)合鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)建立小鼠2型糖尿病模型發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠出現(xiàn)心肌纖維排列紊亂、心肌組織炎性細(xì)胞浸潤、心肌細(xì)胞肥大、壞死的情況。熊果酸干預(yù)8周后，糖尿病小鼠心肌病變明顯改善，其機(jī)制與抑制NLRP3炎性小體活化，減少IL-1β表達(dá)有關(guān)[27]。

無患子皂苷(Soapnut Saponin)是野生落葉喬木無患子(SapindusmukorossiGareth.)果皮的提取物，含有豐富的糖苷類物質(zhì)，主要為三萜皂苷類、倍半萜糖苷類。用高糖誘導(dǎo)H9C2細(xì)胞損傷和焦亡，caspase-1、IL-1β兩種蛋白表達(dá)水平較正常組升高，免疫組化染色和Western blot結(jié)果均顯示無患子皂苷處理可抑制caspase-1及IL-1β水平。綜上所述，無患子皂苷可通過NLRP3調(diào)控caspase-1、IL-1β等下游基因抑制H9C2心肌細(xì)胞損傷[28]。

4 結(jié)語和展望

綜上，NLRP3炎性小體參與糖尿病心肌病的發(fā)生發(fā)展過程。NLRP3炎性小體活化可誘發(fā)或加劇DCM患者心臟心肌炎癥、心肌細(xì)胞壞死或凋亡、心肌纖維化及其他心臟功能障礙。目前以NLRP3為靶點(diǎn)，研究藥物干預(yù)糖尿病心肌病作用處于起步階段，已有研究證實(shí)中藥的干預(yù)作用可影響NLRP3炎性小體的啟動(dòng)和活化，也可影響其下游基因的表達(dá)，進(jìn)而抑制DCM的心肌損傷，改善心臟功能，但是具體機(jī)制尚需深入研究。糖尿病心肌病發(fā)生時(shí)，心肌脂質(zhì)代謝紊亂，脂質(zhì)小分子代謝物組譜失衡，而脂質(zhì)代謝產(chǎn)物如神經(jīng)酰胺可以充當(dāng)NLRP3炎性小體的激活信號(hào)，影響糖尿病等代謝性疾病的發(fā)展。研究小檗堿等可通過調(diào)控脂質(zhì)組學(xué)改善DCM心肌損傷[29]，并對(duì)NLRP3炎性小體有調(diào)控作用[30]，值得深入探討。