1,8-桉葉油素調節自噬改善高糖誘導的內皮細胞損傷

宋曉妹，楊 紅，龍秋雙，方官琴，高 歌, 甘詩泉，陳 妍，沈祥春

(1. 貴州醫科大學藥學院，貴州 貴陽 550025；2. 貴州省高等學校天然藥物藥理與成藥性評價重點實驗室，貴州 貴陽 550025；3. 貴陽市婦幼保健院藥學部，貴州 貴陽 550003)

糖尿病患病率和相關死亡率不斷上升。全世界的糖尿病患者人數預計將從2017年的4.51億增加至2045年的6.93億。2017年，全球20-99歲年齡段的糖尿病死亡人數約為500萬[1]。這一新的預測使我們警惕糖尿病給全世界人類帶來了巨大的社會、財務和衛生系統負擔。超過68%的糖尿病病人最終死于心血管系統并發癥，糖尿病心血管并發癥已成為糖尿病致死與致殘的主要原因[2]，而血管內皮結構與功能的異常是血管并發癥的前提與基礎[3]。因此，尋找改善血管內皮功能障礙的發病機制和保護性分子機制已成為近年來研究的重點。

自噬是一種進化上保守的分解代謝過程，它以溶酶體依賴性的方式介導蛋白質降解，細胞器周轉和細胞質含量的循環[4]。最近的研究表明，自噬失調與幾種心血管病理過程有關，例如糖尿病心血管疾病、動脈粥樣硬化，心臟肥大和心肌病[5-6]。自噬流是細胞穩態的參數之一，它是自噬小體生物發生(多種自噬蛋白的隔離和膜狀結構的形成)和封閉內容物降解之間的平衡。自噬流障礙會引起非必要的貨物積累，從而導致內質網應激、線粒體功能障礙和異位脂質蓄積。相反地，自噬流通暢可改善代謝性疾病和心血管功能[7]。血管內皮細胞因其存在的廣泛性和敏感性，會隨著外界環境的改變而發生功能改變，并且伴隨著自噬的產生。但自噬在血管內皮細胞中所扮演的角色及具體調控機制尚不明確。

1,8-桉葉油素(1,8-Cineole)是一種單萜，存在于許多植物精油中，例如迷迭香和艷山姜揮發油[8]。1,8-Cineole具有抗氧化、抗炎、抗高血壓和改善血管內皮損傷作用，其是用于阿爾茨海默氏病、癌癥、呼吸系統疾病、消化系統疾病、心血管疾病、煩躁不安和桿菌的潛在治療劑[9]，但在心血管疾病研究主要集中在抗氧化和抗炎方面，對自噬的研究尚少。本文旨在探討1,8-Cineole是否通過自噬來改善高糖誘導HAECs損傷，為1,8-Cineole防治糖尿病心血管疾病提供理論依據和實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 儀器Heal force型細胞培養箱(中國上海力申科學儀器有限公司)、RM-220實驗室專用超純水機(沃特浦公司)、700-SERIES超低溫冰箱(Thermo SCIEMTIFIC)、LS-R35L-I立式壓力蒸氣滅菌器(江陰濱江醫療設備有限公司)、SW-CJ-2F單人雙面凈化工作臺(蘇州凈化設備有限公司)和5810R型冷凍離心機(德國Eppendorf公司)。

1.2 試劑及藥物

1.2.1試劑 原代人主動脈內皮細胞(HAECs，6100)購自ScienCell Research Laboratories、Endothelial Cell Medium(ECM，1001)購自 Sciencell technology，ECM中含有5.5 mmol·L-1葡萄糖；乳酸脫氫酶試劑盒(A020-2)購自南京建成生物工程研究所；LC3(14600-1-AP，1 ∶1 000)、SQSTM1/p62 (18420-1-AP，1 ∶1 000)、caspase-3(66470-2-1g，1 ∶1 000)、caspase-9(10380-1-AP，1 ∶1 000)購自Proteintech公司、Beclin1(ab207612，1 ∶1 000)購自Abcam公司。D-glucose(405A0918)和D-mannitol(1126F038)購自北京索萊寶科技有限公司；1,8-Cineole(Eucalyptol，K1822141)購自阿拉丁公司。

1.2.2藥物配制 精密吸取1,8-Cineole(純度>99%)10 μL稱重，溶于990 μL二甲基亞砜，0.22 μm濾頭過濾除菌配制成濃度為9.405×106μg·L-1的母液，分裝后置于-20 ℃保存備用。臨用時用2% ECM稀釋成所需濃度。

1.3 細胞培養及分組HAECs采用(含有5% FBS、1%雙抗、1%血管內皮生長因子)ECM培養，置于37 ℃、5%CO2的飽和濕度培養箱內培養。實驗分為兩部分，(1)：正常對照組(Control，5. 5 mmol·L-1葡萄糖)、甘露醇作為滲透壓對照組(MA， 29. 5 mmol·L-1甘露醇+ 5. 5 mmol·L-1葡萄糖)、高糖組(HG，35 mmol·L-1葡萄糖)、藥物1,8-Cineole 低劑量組(0.25 μg·L-11,8-Cineole(CL)+HG)、藥物1,8-Cineole 高劑量組(2.5 μg·L-11,8-Cineole(CH)+HG)。各給藥組預處理1 h 后，加入HG共同孵育60 h 建立HAECs損傷模型。(2)：對照組(Control，5. 5 mmol·L-1葡萄糖)、高糖組(HG，35 mmol·L-1葡萄糖)、1,8-Cineole 高劑量組 (2.5 μg·L-11,8-Cineole(CH)+HG)、自噬抑制劑(10 μmol·L-1氯喹(CQ))組、CQ+HG共給藥組、CQ+HG+CH 3者聯用組。各給藥組或抑制劑組預處理 1 h 后，加入HG共同孵育60 h，根據實驗需要對細胞進行相應的處理。

1.4 MTT法檢測細胞活力以1×108個·L-1密度的細胞接種于96孔板中，采用MTT法檢測細胞活性。計算公式：細胞存活率/%=各組OD值/對照組OD值×100%。

1.5 LDH檢測細胞毒性收集各處理組細胞上清液，根據南京建成LDH檢測試劑盒使用明書進行實驗操作，計算細胞上清液中LDH含量。

1.6 Western blot法檢測相關蛋白表達分別收集各處理組的細胞，加入細胞裂解液，其中PMSF占總體積1%，RIPA 占總體積99%來提取總蛋白，二喹啉甲酸(BCA)進行定量，規定上樣質量30 μg后進行分裝。經12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳后，采用濕轉法將蛋白轉移到0.22 μm PVDF膜上，采用2%牛血清白蛋白(BSA)進行室溫1 h封閉。加入相應一抗，置于4 ℃冰箱孵育過夜，次日從冰箱拿出膜于搖床上搖0.5 h后,回收一抗，1 × TBST洗膜3次后，加入二抗室溫孵育，1 h后回收二抗，洗膜3次。采用化學發光液在暗室顯影。

2 結果

2.1 1,8-Cineole增強HAECs活力和減輕高糖誘導的細胞毒性MTT結果顯示，高糖孵育細胞60 h后，HG組細胞活力明顯降低(P<0.05)，如Fig 1A所示，1,8-Cineole組以劑量依賴性增強細胞活力(P<0.05，與HG模型組比較)；HG模型組與Control組比較，LDH含量增加(P<0.05)；1,8-Cineole組與HG模型組比較，LDH含量減少(P<0.05)且呈劑量依賴性，如Fig 1B所示。

Fig 1 A. Cell viability enhanced by 1,8-Cineole n=3); B. HG-induced cytotoxicity reduced by 1,8-Cineole n=3)*P<0.05 vs Control; #P<0.05 vs HG.

2.2 1,8-Cineole改善HG誘導HAECs的自噬抑制與Control組比較，HG組抑制 Beclin1和LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白的表達(P<0.05)，促進p62蛋白的表達(P<0.05)；與HG組相比較，1,8-Cineole處理后可上調Beclin1 和LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白的表達和下調p62蛋白的表達(P<0.05)。結果表明1,8-Cineole可激活自噬，使自噬流通暢，如Fig 2所示。

Fig 2 Effect of 1,8-Cineole on HG-induced *P<0.05 vs Control; #P<0.05 vs HG.

2.3 1,8-Cineole抑制HG誘導HAECs的凋亡如Fig 3所示，Western blot結果表明，與Control組比較，HG組促進caspase-9和caspase-3蛋白上調(P<0.05)；與HG組比較，1,8-Cineole組二者表達都下調(P<0.05)。結果說明，1,8-Cineole可抑制HG誘導細胞的凋亡。

2.4 1,8-Cineole通過調節自噬流改善HG誘導自噬抑制溶酶體抑制劑氯喹(CQ)，可導致自噬流障礙，從而使自噬小體積聚增加。在本研究中，Western blot結果顯示，CQ組與Control組相比，Beclin1、LC3-Ⅱ/Ⅰ和p62表達進一步上調(P<0.05)；CQ+HG+CH組與CQ+HG組比較時三者差異無統計學意義，如Fig 4所示。結果表明，給予自噬抑制劑CQ，發現1,8-Cineole對HAECs自噬的改善作用被CQ完全減弱，提示1,8-Cineole通過調節自噬流改善HG誘導自噬抑制。

Fig 3 HG-induced cell apoptosis inhibited by *P<0.05 vs Control; #P<0.05 vs HG.

Fig 4 Effect of autophagy inhibitors on 1,8-Cineole in improving autophagy n=3)*P<0.05 vs Control; #P<0.05 vs HG.

2.5 1,8-Cineole通過調節自噬流障礙改善HG誘導HAECs的凋亡給予自噬抑制劑CQ干預后，caspase-9和caspase-3較Control組明顯上調(P<0.05)；CQ+HG+CH組與CQ+HG組比較時二者差異無統計學意義，如Fig 5所示。結果表明，1,8-Cineole通過調節自噬流障礙改善HG誘導HAECs的凋亡。

Fig 5 HG-induced apoptosis improved by 1, 8-Cineole via regulating autophagic n=3)*P<0.05 vs Control; #P<0.05 vs HG.

3 討論

隨著人口老齡化的加劇以及生活方式的改變，心血管疾病成為嚴重威脅人類健康的重要疾病之一，在近幾年的流行病調查中，因心血管疾病死亡人數一直高居因病死亡的榜首，因此，心血管疾病的預防和治療便成為現階段各國科研和臨床研究的重點[10]。研究顯示[11]，心臟、血管是糖尿病的主要靶器官，其中約2/3的糖尿病患者死于心血管疾病。糖尿病與心血管疾病的發生具有密切的關系，一旦發生心血管疾病后會對心臟、血管造成持續性損害，嚴重影響患者預后。

血管內皮細胞在維持心血管系統正常功能中起著關鍵作用，而內皮功能障礙已被認為是幾乎所有心血管疾病的常見危險因素[12]。在糖尿病血管并發癥的發病過程中，自噬對血管內皮細胞和平滑肌細胞起到了保護的作用。自噬是一種細胞自我保護機制，通過這種機制，細胞通過分類為大自噬的溶酶體依賴性機制降解受損的蛋白質和大分子。該過程涉及幾個步驟，包括引發、延伸、成熟、融合和降解。起始時，在細胞質成分周圍形成一個熒光團，然后被一個雙層膜隔離，形成一個自噬體。隨后，自噬體與溶酶體融合形成自溶體，封閉的內容物隨后降解[13]。Beclin-1 是自噬啟動的必需基因，通過與Ⅲ型磷脂酰肌醇3激酶(Ⅲ PI3K)結合形成Beclin1-Ⅲ PI3K復合物，調節自噬的水平。Beclin-1是第1個被發現的參與自噬對疾病調控的自噬基因，在自噬溶酶體降解途徑中對腫瘤有抑制作用。LC3是自噬體膜的重要標記物，以LC3Ⅰ和LC3 Ⅱ兩種形式存在，LC3在羧基端被具有蛋白內切酶活性的Atg4剪切，生成存在于細胞質的LC3Ⅰ；LC3Ⅰ通過Atg7和Atg3參與的泛素樣反應，使磷脂酰乙醇胺偶聯，生成脂質化形式的LC3 Ⅱ；LC3Ⅱ是自噬體的結構蛋白，可以附著到自噬體膜上，通過監測LC3Ⅰ向LC3Ⅱ的轉化可以檢測自噬的進展，所以通常用Western blot檢測LC3-Ⅱ/Ⅰ或mRFP-GFP-LC3雙熒光實驗評估自噬的表達[14]。p62是將LC3與泛素化底物連接的自噬的重要指標。p62被多泛素化蛋白轉移到自噬體中，并在自溶酶體中降解。當在哺乳動物細胞中抑制自噬時，p62的表達增加[15]。自噬紊亂可能是多種疾病的發病機理，包括心血管疾病，代謝性疾病，腎臟疾病，炎癥，癌癥以及神經退行性疾病。Ye等[16]研究提示，敲除Beclin 1(自噬啟動形成的關鍵組成部分)會加劇大鼠頸動脈損傷后新內膜的形成，這與延遲的內皮化有關。Beclin1是哺乳動物自噬基因，對自噬調節至關重要。最新研究表明，用30 mmol·L-1葡萄糖處理人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)后p62的表達增加，但抑制LC3-Ⅱ/Ⅰ的表達，透射電子顯微鏡顯示，HUVEC膜中自噬泡的減少[17]。在本研究中，HG處理細胞60 h后，檢測到Beclin1和LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白表達水平降低，p62表達增加，與文獻報道結果一致；文獻顯示，使用自噬抑制劑抑制巨噬細胞自噬，由于線粒體膜穩定性降低或半胱天冬酶抑制作用降低，可增強凋亡誘導的細胞死亡[18]，在本文中，HG處理細胞后，caspase-3和caspase-9表達增加，在給予自噬抑制劑CQ干預細胞后，觀察到caspase-3和caspase-9表達進一步增加，表明CQ促進細胞凋亡。因此篩選有效的天然活性物質調控自噬改善高糖誘導的內皮功能障礙是防治糖尿病心血管并發癥的重要策略。

1,8-Cineole是從植物精油中提取的單體化合物，目前1,8-Cineole在心血管藥理學研究報道盡顯稀缺。本研究結果表明，高糖作用HAECs 60 h后，誘導細胞活力下降、增加LDH含量、抑制自噬和促進細胞凋亡，在給予1,8-Cineole干預后可增強細胞活力、降低LDH含量、激活自噬和抑制細胞凋亡。給予自噬抑制劑CQ后，與Control組相比較，觀察到Beclin1、LC3-Ⅱ/Ⅰ和p62表達進一步增加，而CQ+HG+CH組與CQ+HG組比較時三者差異無統計學意義，表明1,8-Cineole對HAECs自噬流的改善作用被CQ完全減弱，提示1,8-Cineole通過調節自噬流改善HG誘導自噬抑制；同時caspase-9和caspase-3較Control組明顯上調，而CQ+HG+CH組與CQ+HG組比較時二者差異無統計學意義，表明1,8-Cineole可能通過改善自噬流障礙來抑制細胞凋亡的發生，從而發揮其對高糖誘導內皮損傷的保護作用。本文不足之處在于只在體外實驗中探討了抑制溶酶體后，檢測1,8-Cineole對Beclin1、LC3-Ⅱ/Ⅰ和p62表達和caspase-3和caspase-9蛋白表達情況，并未在體內相對應驗證1,8-Cineole的作用，從而闡明1,8-Cineole通過改善自噬流對糖尿病心血管疾病起到保護作用，未來的研究會對朝著這個方向深入研究，進一步深入系統闡明糖尿病血管內皮損傷的關鍵機制與1,8-Cineole 的防治作用。

綜上所述，本研究提示1,8-Cineole對高糖誘導的人主動脈內皮細胞損傷具有保護作用，其調控機制可能與自噬流有關。