雙環(huán)醇通過(guò)抑制線(xiàn)粒體凋亡途徑緩解TNF-α/D-GalN誘導(dǎo)的爆發(fā)性肝損傷

李 虎，李健蕊，劉楠楠，汪美汐，譚佳麗，彭宗根

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所，北京 100050)

急性肝損傷是由各種原因引起的肝臟短時(shí)間內(nèi)功能異常，嚴(yán)重者甚至導(dǎo)致肝衰竭，進(jìn)而危及生命[1]。急性肝損傷可由肝臟長(zhǎng)時(shí)間缺血、藥物、乙醇、毒素或毒物暴露、代謝紊亂、感染及免疫過(guò)程等引起。由于病因多樣且發(fā)病較急，目前對(duì)其治療仍是一個(gè)挑戰(zhàn)[1]。急性肝損傷發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、NF-κB活化、細(xì)胞凋亡等[2]。腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)作為一種多效性細(xì)胞因子，在各種肝病中大多可見(jiàn)含量升高，其誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是肝損傷的一種典型的病理機(jī)制[3]。TNF-α聯(lián)合應(yīng)用肝臟特異性致敏劑D-半乳糖胺(D-galactosamine，D-GalN)可誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡和肝組織損傷，目前已在多種體內(nèi)外模型中證明了其誘發(fā)急性肝損傷的作用[4-6]。

雙環(huán)醇(Bicyclol)是由我國(guó)自主研發(fā)的I類(lèi)抗炎保肝藥物[7]。在刀豆蛋白A、順鉑、四環(huán)素、酒精及肝臟缺血/再灌注等引起的小鼠或大鼠肝損傷模型中已證實(shí)具有明顯的肝保護(hù)作用[7-8]。其中，雙環(huán)醇對(duì)化學(xué)性肝損傷的作用與保護(hù)線(xiàn)粒體功能，清除自由基，調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝等有關(guān)[7-8]；而對(duì)刀豆蛋白A等引起的免疫性肝損傷的保護(hù)作用與調(diào)節(jié)炎癥/抗炎因子的體內(nèi)平衡、調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能及促進(jìn)熱休克蛋白的表達(dá)，從而抑制肝細(xì)胞凋亡有關(guān)[7-8]。另外，雙環(huán)醇對(duì)脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)/D-GalN及聚肌胞苷酸(polyinosinic-polycytidylic acid，Poly(I:C))/D-GalN引起的肝損傷同樣具有明顯緩解作用，其機(jī)制則涉及抗炎、抗氧化應(yīng)激作用[9-11]。鑒于TNF-α/D-GalN誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡在肝損傷中的關(guān)鍵作用，雙環(huán)醇對(duì)TNF-α/D-GalN誘導(dǎo)的凋亡性肝損傷是否同樣具有保護(hù)作用，目前尚未可知。本研究擬通過(guò)TNF-α聯(lián)合D-GalN(TNF-α/D-GalN)誘導(dǎo)的小鼠急性凋亡性肝損傷模型，評(píng)價(jià)雙環(huán)醇對(duì)肝損傷的保護(hù)作用及相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑雙環(huán)醇(北京協(xié)和藥廠(chǎng)，純度> 99%)，小鼠TNF-α重組蛋白(R&D Systems)，D-GalN(Sigma)。TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(Roche)，線(xiàn)粒體提取試劑盒(索萊寶)。含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(cysteinyl aspartate specific proteinase-3，caspase-3)、caspase-9活性檢測(cè)試劑盒及Bradford蛋白定量試劑盒(碧云天)。純化線(xiàn)粒體膜通道孔(mPTP)光度法檢測(cè)試劑盒(美國(guó)GENMED公司)。細(xì)胞色素C(Cytochrome c, Cyt c)及Actin抗體(Cell Signaling公司)。激活型caspase-3及caspase-9、Bax、Bcl-2、COX IV抗體(沈陽(yáng)萬(wàn)類(lèi)生物公司)。

1.2 模型及處理SPF級(jí)♂ C57BL/6N小鼠(22.0 g±2.0 g)購(gòu)于斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)SCXK(京)-2019-0010。小鼠適應(yīng)3 d后按體質(zhì)量隨機(jī)分成6組：對(duì)照組、雙環(huán)醇高劑量(200 mg·kg-1·d-1)單獨(dú)處理組、模型組、模型+雙環(huán)醇低/中/高劑量(50/100/200 mg·kg-1·d-1)組，每組6只。采用不同劑量雙環(huán)醇或?qū)φ杖軇?5 g·L-1的羧甲基纖維素鈉)灌胃5 d，每天2次。于末次給藥后2 h腹腔注射700 mg·kg-1的D-GalN，30 min后腹腔注射10 μg·kg-1的TNF-α，正常及雙環(huán)醇單獨(dú)給藥組給予溶劑PBS腹腔注射。4 h后取血并分離血清，生化儀檢測(cè)ALT和AST，收集肝組織標(biāo)本用于后續(xù)檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)按照國(guó)家實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物飼養(yǎng)管理規(guī)范進(jìn)行，并經(jīng)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.3 生存率分析將60只SPF級(jí)♂ C57BL/6N小鼠(22.0 g±2.0 g)按體質(zhì)量隨機(jī)分成對(duì)照組、模型組、模型+雙環(huán)醇低劑量組、模型+雙環(huán)醇高劑量組，每組15只。給藥及誘導(dǎo)過(guò)程同上，于TNF-α注射后觀(guān)察并記錄各組小鼠24 h生存情況并繪制生存率曲線(xiàn)。

1.4 組織病理及TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)采集小鼠肝右葉相同部位肝組織，10%中性福爾馬林固定24 h后，常規(guī)程序制作蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色玻片，顯微鏡下觀(guān)察各組肝組織病理學(xué)改變。TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)采用肝組織經(jīng)4%多聚甲醛固定后制作石蠟切片，常規(guī)脫蠟、蒸餾水洗。加入蛋白酶K 37℃孵育30 min，PBS洗3次。吸干周?chē)郑尤隩UNEL反應(yīng)混合液37 ℃孵育2 h，PBS洗3次。用新配制的3%過(guò)氧化氫溶液室溫避光孵育15 min，PBS洗3次。加入適量converter-POD覆蓋組織，37 ℃孵育30 min，PBS洗3次。DAB顯色，蘇木精復(fù)染、脫水、封片后顯微鏡觀(guān)察，陽(yáng)性細(xì)胞的胞核呈棕黃色。

1.5 caspase活性檢測(cè)按照說(shuō)明書(shū)方法研磨各組小鼠肝組織，Bradford法測(cè)定肝勻漿蛋白含量，調(diào)整蛋白濃度一致。取96孔板，設(shè)立空白對(duì)照孔、樣品孔及不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品孔，配制反應(yīng)體系及加樣。405 nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值，以對(duì)照組caspase活性為1，計(jì)算各組caspase-3及-9相對(duì)活性。

1.6 純化線(xiàn)粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔(membrane permeability transition pore, mPTP)開(kāi)放狀態(tài)測(cè)定用線(xiàn)粒體提取試劑盒提取肝組織線(xiàn)粒體并定量。根據(jù)說(shuō)明書(shū)，取200 μg純化線(xiàn)粒體加入到96孔板對(duì)應(yīng)孔中，然后加入170 μL室溫預(yù)熱的緩沖液，混勻后即刻放入酶標(biāo)儀測(cè)定540 nm波長(zhǎng)下初始讀數(shù)(OD0 min)。室溫靜置1 min，加入10 μL誘導(dǎo)液，混勻后測(cè)定10 min吸光度值OD10 min，計(jì)算吸光值降低相對(duì)大小Relative△A540=(OD0 min-OD10 min)/ OD0 min。吸光值降低越大(比值越大)，表明線(xiàn)粒體mPTP開(kāi)放程度越大。

1.7Westernblot取肝組織按質(zhì)量比例加入裂解液，勻漿器研磨后12 000×g，4 ℃離心10 min。取上清進(jìn)行蛋白定量，調(diào)整濃度一致，加入上樣緩沖液并煮沸后用于Western blot檢測(cè)。常規(guī)上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后于4 ℃孵育一抗Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9、Bax、Bcl-2、Cyt c過(guò)夜(1:500)。次日，TBST洗3次，室溫孵育相應(yīng)二抗(1 ∶5 000)1 h，使用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)蛋白條帶，采用Gel-Pro analyzer進(jìn)行定量分析。Cyt c及內(nèi)參COX Ⅳ蛋白檢測(cè)采用線(xiàn)粒體提取試劑盒提取線(xiàn)粒體并裂解、煮沸后上樣檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 雙環(huán)醇提高TNF-α/D-GalN誘導(dǎo)肝損傷小鼠的生存率如Fig 1所示，TNF-α/D-GalN處理后小鼠陸續(xù)死亡。6 h時(shí)，模型組生存率為60%，雙環(huán)醇低、高劑量組均為100%；8 h時(shí)，模型組生存率為6.67%，雙環(huán)醇低、高劑量組均分別為46.67%及53.33%；12 h及24 h時(shí)，模型組生存率為0%，雙環(huán)醇低、高劑量組均分別為20%及33.33%。因此，雙環(huán)醇低、高劑量干預(yù)后小鼠生存率較模型組有明顯提升，兩組生存率的提高均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.2 雙環(huán)醇緩解TNF-α/D-GalN導(dǎo)致的凋亡性肝損傷轉(zhuǎn)氨酶是反映肝臟功能的常用指標(biāo)。本研究中，雙環(huán)醇單獨(dú)處理對(duì)轉(zhuǎn)氨酶水平無(wú)影響，而雙環(huán)醇干預(yù)能明顯抑制TNF-α/D-GalN誘導(dǎo)的ALT及AST升高(Fig 2A和2B)。肝臟大體觀(guān)察可見(jiàn)模型組肝臟出血灶明顯，給藥后明顯好轉(zhuǎn)(Fig 2C)。病理結(jié)果與以往TNF-α/D-GalN誘導(dǎo)肝損傷病理?yè)p傷相似[6]，模型組可見(jiàn)大量肝細(xì)胞死亡并伴有出血淤積、大片肝索結(jié)構(gòu)破壞，而不同劑量雙環(huán)醇干預(yù)后，肝小葉內(nèi)結(jié)構(gòu)破壞及紅細(xì)胞淤積情況均明顯減輕(Fig 2C)。TUNEL法肝組織內(nèi)細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果顯示：肝臟凋亡細(xì)胞核染成棕黃色，模型組凋亡細(xì)胞數(shù)目較多，雙環(huán)醇干預(yù)后肝細(xì)胞凋亡明顯減少(Fig 2C)。因此，雙環(huán)醇能夠減輕TNF-α/D-GalN誘導(dǎo)的肝組織損傷及肝細(xì)胞凋亡，且對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制具有一定的劑量依賴(lài)性。

Fig 1 Effect of bicyclol on mouse survival rate of TNF-α/D-GalN-induced fulminant **P<0.01 vs TNF-α/D-GalN-induced model group

2.3 雙環(huán)醇抑制TNF-α/D-GalN誘導(dǎo)的線(xiàn)粒體凋亡途徑caspase家族屬于半胱氨酸蛋白酶，介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，是細(xì)胞凋亡的中心調(diào)節(jié)分子。各組小鼠在PBS或TNF-α/D-GalN腹腔注射后4 h取肝組織，勻漿后檢測(cè)肝內(nèi)caspase-3和caspase-9(caspase-3/-9)活性。結(jié)果顯示：雙環(huán)醇單獨(dú)給藥組與正常對(duì)照組相比較，caspase-3/-9活性無(wú)顯著變化，而模型組兩者活性明顯高于對(duì)照組。與模型組相比較，不同劑量雙環(huán)醇干預(yù)后caspase-3/-9的活性顯著降低(Fig 3A和3B)。與此一致，Western blot結(jié)果也證實(shí)模型組小鼠肝內(nèi)激活型caspase-3/-9蛋白水平較正常對(duì)照組明顯升高，而雙環(huán)醇干預(yù)后肝內(nèi)激活型caspase-3/-9蛋白水平明顯下調(diào)(Fig 3C)。同時(shí)，不同劑量雙環(huán)醇可降低TNF-α/D-GalN引起的Bax升高，并一定程度逆轉(zhuǎn)TNF-α/D-GalN引起的抗凋亡蛋白Bcl-2下調(diào)。因此，TNF-α可引起D-GalN致敏的小鼠線(xiàn)粒體凋亡途徑激活，而雙環(huán)醇可明顯抑制該過(guò)程，從而發(fā)揮抗肝損傷作用。

Fig 2 Effect of bicyclol on TNF-α/D-GalN-induced apoptotic liver injury in **P<0.01 vs control group;##P<0.01 vs TNF-α/D-GalN-induced model group

Fig 3 Effect of bicyclol on mitochondrial apoptosis pathway of TNF-α/D-GalN-induced fulminant hepatitis in *P<0.05,**P<0.01 vs control group;#P<0.05,##P<0.01 vs TNF-α/D-GalN-induced model group

2.4 雙環(huán)醇的抗凋亡效應(yīng)與線(xiàn)粒體保護(hù)作用有關(guān)線(xiàn)粒體為T(mén)NF-α/D-GalN誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡機(jī)制的核心環(huán)節(jié)，線(xiàn)粒體細(xì)胞色素C的胞質(zhì)釋放引起下游caspase的激活。因此，我們檢測(cè)了雙環(huán)醇在該模型中是否對(duì)線(xiàn)粒體起到保護(hù)作用。結(jié)果顯示，雙環(huán)醇單獨(dú)給藥對(duì)線(xiàn)粒體及胞質(zhì)細(xì)胞色素C含量無(wú)影響，但可降低TNF-α/D-GalN誘導(dǎo)的胞質(zhì)細(xì)胞色素C含量增加，抑制線(xiàn)粒體內(nèi)細(xì)胞色素C含量的減少，即雙環(huán)醇抑制了TNF-α/D-GalN引起的線(xiàn)粒體內(nèi)細(xì)胞色素C的胞質(zhì)釋放，且該效應(yīng)具有一定的濃度依賴(lài)性(Fig 4A)。肝損傷過(guò)程中線(xiàn)粒體mPTP的開(kāi)放引起細(xì)胞色素C的胞質(zhì)釋放，mPTP開(kāi)放程度檢測(cè)結(jié)果顯示：雙環(huán)醇處理后吸光度降低較模型組小，說(shuō)明其可抑制TNF-α/D-GalN誘導(dǎo)的mPTP開(kāi)放增強(qiáng)(Fig 4B)。因此，雙環(huán)醇在TNF-α/D-GalN誘導(dǎo)的肝損傷模型中的抗凋亡效應(yīng)與其保護(hù)線(xiàn)粒體膜通透性，進(jìn)而抑制線(xiàn)粒體內(nèi)細(xì)胞色素C的胞質(zhì)釋放有關(guān)。

Fig 4 Effect of bicyclol on cytochrome c level and opening of membrane permeability transition pore in mouse liver *P<0.05,**P<0.01 vs control group;#P<0.05,##P<0.01 vs TNF-α/D-GalN-induced model group

3 討論

腹腔聯(lián)合注射TNF-α和特異性肝臟致敏劑D-GalN可誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡。目前，多種體內(nèi)外模型已證實(shí)其在誘導(dǎo)急性肝細(xì)胞凋亡性肝損傷中的作用[4-6,12]。細(xì)胞凋亡是TNF-α/D-GalN誘導(dǎo)重型肝炎的主要機(jī)制，抑制凋亡過(guò)程有望使肝損傷得到較好的治療。雙環(huán)醇作為我國(guó)臨床推薦的常用保肝抗炎藥物，在化學(xué)性、免疫性、脂肪性、肝部分切除與缺血再灌注等肝功能損傷模型中具有良好的抗炎保肝作用[8,13]。前期我們?cè)赑oly(I:C)/D-GalN誘導(dǎo)的肝炎中證明了雙環(huán)醇對(duì)氧化應(yīng)激及炎癥通路的抑制與其對(duì)線(xiàn)粒體的保護(hù)作用有關(guān)，但該機(jī)制并未涉及細(xì)胞凋亡過(guò)程[11]。因此，我們進(jìn)一步提出假設(shè)：雙環(huán)醇或可通過(guò)對(duì)線(xiàn)粒體的保護(hù)抑制TNF-α/D-GalN誘導(dǎo)的凋亡性肝損傷。本研究中我們證實(shí)了雙環(huán)醇通過(guò)抑制經(jīng)典的線(xiàn)粒體凋亡途徑，緩解TNF-α/D-GalN誘導(dǎo)的肝損傷。

爆發(fā)性肝損傷病情進(jìn)展迅速，往往對(duì)生命造成重大威脅。本研究中TNF-α/D-GalN誘導(dǎo)小鼠后6 h即可引起小鼠死亡，至12 h時(shí)模型組死亡率為100%，而雙環(huán)醇處理可延緩小鼠死亡，明顯提高生存率。TNF-α可通過(guò)兩條途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[14]，一種是內(nèi)源性凋亡信號(hào)途徑，即線(xiàn)粒體損傷引起細(xì)胞色素C的胞質(zhì)釋放及caspase-3和caspase-9激活，進(jìn)而誘導(dǎo)下游凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)。該過(guò)程中，mPTP作為跨越線(xiàn)粒體內(nèi)外膜的由多種蛋白質(zhì)組成的復(fù)合蛋白通道，其開(kāi)放程度決定了凋亡因子細(xì)胞色素C等的胞質(zhì)釋放程度，基質(zhì)中的促凋亡蛋白Bax、Bak等可增加其通透性，而抗凋亡的Bcl-2、Bcl-xL等蛋白則抑制這一過(guò)程[15-16]。本研究中我們發(fā)現(xiàn)，雙環(huán)醇可抑制線(xiàn)粒體凋亡途徑中caspase-3和caspase-9的激活。進(jìn)一步研究顯示，雙環(huán)醇抑制了促凋亡蛋白Bax并提高抗凋亡蛋白Bcl-2的水平，進(jìn)而降低了TNF-α/D-GalN誘導(dǎo)的mPTP開(kāi)放程度，最終抑制了線(xiàn)粒體細(xì)胞色素C的胞質(zhì)釋放。雙環(huán)醇在該模型中對(duì)線(xiàn)粒體膜通透性的保護(hù)與以往研究中其誘導(dǎo)熱休克蛋白進(jìn)而維持細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)及線(xiàn)粒體穩(wěn)定性的作用一致[7-8]。細(xì)胞凋亡的另一條途徑是外源性途徑：TNF-α與細(xì)胞表面TNF-α受體1(TNFR1)結(jié)合，進(jìn)而通過(guò)接頭蛋白招募并激活caspase-8。激活的caspase-8不僅可以直接剪切并激活caspase-3，還可以通過(guò)剪切促凋亡蛋白Bid，促進(jìn)其轉(zhuǎn)位到線(xiàn)粒體中激活Bax及Bak，從而進(jìn)一步激活內(nèi)源性凋亡途徑[17]。外源和內(nèi)源途徑介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡交織在一起，雙環(huán)醇抑制caspase-3的激活，這提示外源性凋亡途徑可能也被雙環(huán)醇所抑制。細(xì)胞凋亡通路失調(diào)與肝細(xì)胞癌、病毒性肝炎、自身免疫性肝炎及各種類(lèi)型肝損傷有直接聯(lián)系[3]，而文獻(xiàn)報(bào)道雙環(huán)醇對(duì)以上幾種肝病均有不同程度的保護(hù)作用。因此，基于本研究的結(jié)論，我們推測(cè)雙環(huán)醇對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制或在各種病因引起的肝病中具有不同程度的作用。

綜上所述，雙環(huán)醇通過(guò)抑制TNF-α/D-GalN誘導(dǎo)的線(xiàn)粒體凋亡途徑緩解爆發(fā)性肝損傷，其機(jī)制與抑制線(xiàn)粒體膜通道轉(zhuǎn)換孔開(kāi)放、減少線(xiàn)粒體內(nèi)細(xì)胞色素C釋放進(jìn)而抑制凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)通路有關(guān)。本研究補(bǔ)充了雙環(huán)醇對(duì)肝損傷過(guò)程中細(xì)胞凋亡的影響，為其在急性肝損傷防治中的更廣泛應(yīng)用提供了參考。

(致謝：本研究在中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室和病毒室完成，感謝在實(shí)驗(yàn)的指導(dǎo)老師及各位參與者！)