Nampt對ERK1/2的調控在病理性心肌肥大中的作用研究

陳建杏，王盼霞，胡粵懷，路 靜，劉培慶

(中山大學藥學院，廣東 廣州 510006)

病理性心肌肥大是心臟在應對各種病理刺激時表現出的適應性反應，整體主要表現為心臟增大、心腔縮小、心室壁增厚。心肌細胞典型肥大特征包括：胚胎基因重新激活和心肌細胞表面積增大。病理性心肌肥大開始是代償性的增大，但持續發展到不可逆轉時，會導致嚴重的心功能下降，甚至心力衰竭[1-2]。心肌肥大的發病機制尤為復雜，因此，深入研究其病理機制及關鍵調節因子，在病程初期進行有效干預，可延緩心衰進程，為其防治提供重要的理論依據。

細胞外調節蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK1/2)，屬于促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)家族成員，其磷酸化與病理性心肌肥大有關。在受到胞外肥大信號刺激時，心肌細胞膜上的G蛋白偶聯受體激活，進而激活了RAS-RAF-MEK-ERK1/2 級聯信號系統，使得ERK1/2發生磷酸化轉位入核，從而增加肥厚相關轉錄因子的表達[3]。有研究表明，G蛋白信號調節10可抑制ERK1/2信號傳導，從而減輕心肌肥大[4]。因此，抑制ERK1/2的異常激活可減緩心肌肥大發生發展進程。

煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine denucleotide，NAD)是傳遞氫離子的輔酶，能接受氫化物，形成還原型NADH，為線粒體電子傳遞鏈提供還原等價物，從而參與線粒體三羧酸循環。煙酰胺磷酸核糖基轉移酶(nicotinamide phosphoribosyltransferase，Nampt)，長度約52 ku，結構高度保守，在心臟中含量豐富[5]。在哺乳動物中，Nampt主要調控細胞內以煙酰胺(NAM)為原料合成的NAD+補救生物合成途徑，且是NAD+合成過程中的關鍵限速酶[6]。研究表明，Nampt可以保護心肌細胞免受PARP1誘導的凋亡損傷[7]，其競爭性抑制劑FK866可導致線粒體功能障礙[8]。NAD+可作為Ⅲ類去乙酰化酶(Sirtuins)和PARPs等多種調節蛋白家族的底物，調控基因表達、DNA修復、凋亡、線粒體生物合成及蛋白折疊反應等。研究表明，Nampt可能對心臟具有保護作用，但Nampt是否參與了ERK1/2調控的病理性心肌肥大，尚未見明確報道。

基于以上研究背景，本文探究了Nampt對ERK1/2的調控作用及與病理性心肌肥大的關系，為心肌保護新靶點的尋找提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試劑PE粉末(純度>99%，英國，Bristol)；ISO粉末(純度>99%，美國，Sigma，I5627-5G)；組織用胰酶粉末(美國，Sigma，B5002-250 mg)；細胞用血清(美國，Gibco，10099-141)；Nampt抗體(66385-1-Ig-100 uL)和GAPDH抗體(10494-1-AP)，品牌均為美國Proteintech；ERK1/2抗體(9102S)、p-ERK1/2抗體(5726S)、Lamin B1抗體(68591S)、兔二抗(8889S)和鼠二抗(4410S)，品牌均為美國CST；ANF抗體(美國，Santa Cruz，sc-515701)；BNP抗體(美國，Millipore)；α-Tubulin抗體(美國，Sigma,T8328-200 UL)；核蛋白提取試劑盒(美國，Active Motiff，40010)；BCA蛋白定量試劑盒(美國，Thermo，23227)；TRIzol(日本，TaKaRa)；RNA逆轉錄試劑盒(美國Thermo，K1622)；NAD+/NADH測定試劑盒(英國，Abcam，ab65348)。

1.2 儀器細胞用CO2培養箱、全自動高內涵篩選分析系統和實時熒光定量PCR儀均購于美國Thermo；單人單面超凈工作臺購買于中國蘇州；恒溫水浴鍋來自德國Memmert；顯微成像系統使用的是美國Invitrogen品牌；移液槍、冷凍高速離心機和常溫低速離心機則出自德國Eppendorf；蛋白電泳儀和蛋白電轉儀均購于美國BioRad；全自動化學發光圖像分析系統是美國Waukesha品牌的產品。

1.3 方法

1.3.1原代心肌細胞培養 用酒精棉擦拭SD大鼠乳鼠(1-3 d)胸腹部表面，開胸并小心分離出心臟，修剪干凈后心臟對稱剪碎4-6塊至均勻大小，轉至提前高壓滅菌錐形瓶。加入適量0.8 g·L-1的胰酶，冷消化20 min。中途輕輕晃動瓶子，使冷消充分。然后在磁力攪拌器37 ℃水浴攪拌消化，每次5 min。小心吸取上清至新的15 mL離心管，加含胎牛血清的培養基終止消化。錐形瓶另加胰酶繼續消化至完全。重懸離心收集到的細胞，種植在150 mm的大皿(按10-14只乳鼠的量計算)，將培養皿置于細胞培養箱孵育1 h，然后收集上層培養基。以一定密度將細胞均勻種在細胞培養皿/孔板中，并加入雙抗和5-溴脫氧尿嘧啶核苷。繼續培養24 h，待心肌細胞貼壁后換液，并按實驗需求進行不同處理。

1.3.2RT-qPCR 用TRIzol將細胞輕柔吹下并收集，加入氯仿，迅速上下顛倒幾次至液體明顯乳化分層，使蛋白質變性，并除去一些脂溶性雜質。靜置離心后小心吸取上層透明水相至新的EP管中，加預冷異丙醇混勻，靜置，離心，使RNA沉淀在EP管底部析出。沉淀中加體積分數為75%乙醇洗滌，離心后直接倒去上清，于紙巾上倒扣去除殘液，或用小槍頭進一步去除管壁殘液，然后置通風櫥中室溫干燥。之后用適量DEPC水作為溶劑，于58 ℃水浴或空氣浴輔助溶解RNA，然后用nanodrop測定其濃度和純度。逆轉錄第一步體系為12 μL，PCR條件是：65 ℃，5 min，然后降溫至4 ℃；第二步是基于第一步反應，總體系20 μL。PCR條件為：先42 ℃持續60 min，然后70 ℃反應5 min，最后降溫至4 ℃。

1.3.3Western blot 原代心肌細胞經貼壁、換液、加藥處理、繼續培養完成后加適量RIPA裂解液，將細胞全部刮下于冰上孵育30 min，使細胞充分裂解，蛋白質釋放出來。心臟組織經稱重、洗滌、剪碎、離心等步驟，加入適量RIPA重懸，充分勻漿。得到的細胞/組織蛋白裂解液離心15 min(4 ℃、12 000×g)，去除細胞碎片或組織不容物。取上清液5 μL和PBS溶液20 μL進行吸光度的測定。計算濃度并制樣。用SDS-PAGE 凝膠進行蛋白樣品電泳分離，經電泳，電轉，封閉，一抗孵育過夜，二抗室溫孵育并洗滌后，將切下的蛋白膜條帶和顯色液反應，然后進行化學發光顯影檢測。

1.3.4心肌肥大和心衰動物模型的建立 實驗所用動物SPF 級Sprague-Dawley(SD)大鼠均購買并飼養于中山大學實驗動物中心，體質量約為200 g，其質量合格編號：4400850000012196[9]。所有的實驗操作均在動物中心實施完成。動物實驗分為異丙腎上腺素(ISO)給藥模型和腹主動脈縮窄(AAC)模型。

ISO誘導的模型組(雌雄不限，n=12)大鼠每天接受皮下注射ISO溶液(2.5 mg·kg-1)，對照組則給予等體積量生理鹽水。連續給藥1周或3周。AAC模型(雄性，n = 10)的SD大鼠則經歷了術前麻醉、術中迅速開腹、鈍性分離腎動脈和腹主動脈，并用5/0絲線結扎腹主動脈，以及術后進行傷口縫合等過程。Sham組大鼠也進行了開腹手術但不束縛主動脈。所有動物于給藥前后進行超聲心動檢測。AAC術后8周取材。

1.3.5細胞水平干預Nampt (1)過表達Nampt：用載體為pcDNA 3.1(+)，攜帶大鼠Nampt編碼區的質粒瞬時轉染原代心肌細胞48 h，只轉染pcDNA 3.1(+)質粒作為對照組。

(2)敲低Nampt：加入Nampt干擾序列降低其表達或加入抑制劑FK866抑制其酶活性。對幾種siRNA進行篩選，選定敲低效率較高的siRNA進行后續實驗。RNA干擾采用Lipo2000轉染試劑，進行瞬時轉染。轉染后4-6 h換液，換成無血清培養基，使細胞增殖減緩，提高干擾效率。此外，我們也通過加入FK866來模擬Nampt敲低的效果。加入5 μmol·L-1FK866，與原代心肌細胞共同孵育24 h，然后提取蛋白或RNA。

1.3.6核蛋白提取 以150 mm大皿為例：開始收集細胞離心用500×g，其余均為14 000×g。

原代心肌細胞經貼壁、換液、加藥處理、繼續培養完成后用預冷PBS/PI洗滌并刮下，離心后用1×Hypotonic Buffer重懸并于冰上孵育15 min。孵育完成后以最大轉速渦旋10 s，并用胰島素針輕輕勻漿。短暫離心，上清即為胞質蛋白。用1×Hypotonic Buffer 清洗沉淀1次后加入Complete Lysis Buffer重懸，在搖床上搖擺孵育30 min。離心后的上清即為核蛋白。可用考馬斯亮藍和BCA定量法分別對核蛋白、胞質蛋白進行定量并制樣。

1.3.7原代心肌細胞表面積測定 每次進行下一步操作處理前均先用37 ℃的PBS清洗3次。

(1)固定細胞：細胞處理完成經洗滌后，加入提前放至室溫的4%多聚甲醛固定，以15-20 min為宜。

(2)透膜：棄去多聚甲醛，室溫下開蓋干燥5 min，去除殘余多聚甲醛。加入體積分數為0.3%的Triton破膜10 min。

(3)細胞染色：加入羅丹明-鬼筆環肽于37 ℃避光孵育半小時，然后用DAPI染核5 min，最后用高內涵系統測定總體細胞表面積。

1.3.8SD大鼠心臟取材 用戊巴比妥鈉(45 mg·kg-1)麻醉大鼠后迅速開胸，小心將心臟周圍的組織血管等分離干凈，然后從心尖處灌注氯化鉀(0.1 mol·L-1)溶液至心臟停博。取出心臟，擠去殘血并將結締組織等修剪干凈，但保留完整心耳。心臟進行稱重并拍照，然后沿最大橫截面分切，上半部分浸泡在多聚甲醛進行后續切片，下半部分凍存于-80 ℃冰箱或液氮中。處死后的大鼠丈量脛骨長后置放于黃色醫療袋，待實驗結束后放置中山大學實驗動物中心動物尸體房進行統一無害化處理。

2 結果

2.1 建立PE誘導的心肌細胞肥大模型及Nampt的表達變化首先使用PE(100 μmol·L-1)構建心肌細胞肥大模型。如Figure 1A-B所示，PE處理后的心肌細胞表面積明顯大于對照組(Figure 1A)，且心肌肥大相關指標ANF、BNP和β-MHC的mRNA表達也呈現明顯上調的趨勢(Figure 1B)，提示成功構建PE誘導的原代心肌細胞肥大模型。進一步檢測細胞內NAD+的變化，發現PE可時間依賴性地降低NAD+的含量(Figure 1C)。隨后，我們考察了此模型下調控NAD+水平的關鍵蛋白Nampt的RNA和蛋白表達變化。如Figure 1D所示，與對照組相比，給予PE刺激12 h，Nampt的mRNA水平呈升高趨勢。進一步檢測Nampt的蛋白水平，發現給予PE不同時間點處理，Nampt的蛋白表達升高，且呈時間依賴性(Figure 1E)。

2.2 大鼠心肌肥大及心衰模型的建立及Nampt的表達變化為了在動物水平進一步驗證Nampt的表達變化，分別構建了AAC及ISO誘導的大鼠心肌肥大和心衰模型。與對照組相比，AAC組或者ISO處理后，大鼠心臟體積明顯增大、心肌細胞體積增大、排列紊亂(Figure 2A-D)。分別提取心臟組織mRNA和蛋白，檢測Nampt的表達變化。如Figure 2E-F所示，RT-qPCR和 Western blot結果顯示：與Sham組比，AAC組Nampt的mRNA及蛋白水平均明顯升高。在ISO處理下，與對照組相比，無論是肥大還是衰竭的心臟中，Nampt的mRNA及蛋白水平均明顯升高，且隨病理模型的嚴重程度而越明顯(Fugure 2G - H)。以上研究結果與細胞實驗結果相一致，心肌肥大刺激能明顯升高Nampt的表達，提示Nampt可能是重要的心肌肥大調控因子。

2.3 Nampt對PE誘導的心肌細胞肥大的影響為了探究Nampt在PE誘導的心肌肥大的作用，分別采用功能獲得和缺失的手段干預其表達。首先在原代心肌細胞中轉染載體為pcDNA 3.1(+)并攜帶大鼠Nampt編碼區的質粒以過表達Nampt，并檢測心肌肥大指標的變化情況。Figure 3A的結果顯示，相較于對照組，PE處理組胚胎基因ANF和BNP 的蛋白表達明顯增加，而過表達Nampt能明顯抑制PE誘導的胚胎基因的蛋白表達升高。利用RNA干擾序列敲低心肌細胞中Nampt的表達。根據RT - qPCR和 Western blot結果(Figure 3B - C)，第3和第4條干擾序列均能有效地降低Nampt的表達，故選用這兩條siRNA進行后續實驗。與對照組相比，單獨敲低Nampt可升高胚胎基因ANF和BNP的mRNA水平(Figure 3D)。加入FK866抑制Nampt酶活性之后，其結果與敲低Nampt類似(Figure 3E)。以上結果提示，過表達Nampt在一定程度上可緩解由PE誘導的心肌肥大作用，Nampt是心肌肥大的負性調控因子。

2.4 Nampt對NAD+含量和ERK1/2 的調控作用為了進一步探討Nampt發揮心肌保護作用的具體機制，通過采用功能獲得和缺失的手段干預其表達，考察細胞內NAD+含量和ERK1/2的變化。結果顯示，單獨過表達Nampt會升高胞內NAD+的水平，但這一效應可被FK866逆轉(Figure 4A)。進一步檢測發現，PE刺激原代心肌細胞后明顯降低細胞內NAD+含量，而這一效應可被過表達Nampt逆轉(Figure 4B)。使用siRNA敲低Nampt或單獨抑制其酶活性，均能明顯降低心肌細胞內NAD+的水平(Figure 4C，D)。這些結果提示，Nampt可以酶活性依賴性地調控心肌細胞內NAD+水平，抑制PE誘導的心肌肥大反應。以往報道顯示，ERK1/2在血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)誘導的心肌肥大中發揮了重要作用[10]。根據我們的實驗結果，PE處理后能明顯增加ERK1/2的磷酸化水平，而過表達Nampt明顯抑制了PE引起的ERK1/2的激活(Figure 4E)。敲低或抑制Nampt則可明顯地誘導ERK1/2的激活(Figure 4E，F)。以上結果提示，Nampt通過增加心肌細胞內NAD+的含量及抑制ERK1/2的磷酸化，進而發揮抵抗心肌肥大的作用。

Fig 4 Effects of Nampt on NAD+ level and extracellular regulated protein kinases (ERK1/2) phosphorylation on PE-induced cardiomyocyte hypertrophy in NRCMsNRCMs were transfected with Nampt plasmid or siRNA,and co-incubated with PE (100 μmol·L-1) for 12 h (for mRNA extraction) or 24 h (for protein extraction); FK866 (5 μmol·L-1,24 h) was used to inhibit the enzyme activity of Nampt. (A,B,C and D) The NAD+ level was determined by NAD/NADH Assay Kit (colorimetric assay). (E and F) The protein expression levels of ERK1/2 including t-ERK1/2,p-ERK1/2,were determined by Western blot. *P<0.05 vs pcDNA 3.1 group or Control group;#P<0.05 vs pcDNA3.1+PE group,n=3.

Fig 3 Nampt alleviated phenylephrine (PE)-induced cardiomyocyte hypertrophy in NRCMsNRCMs were transfected with Nampt plasmid or siRNA,and co-incubated with PE (100 μmol·L-1) for 12 h (for mRNA extraction) or 24 h (for protein extraction); FK866 (5 μmol·L-1,24 h) was used to inhibit the enzyme activity of Nampt. (A) Western blot analysis was conducted to show the total protein expression of ANF and BNP simultaneously. (B) RT-qPCR was used to detect the mRNA of Namptin in transcriptional level. (C) Western blot analysis was applied to present the protein changes of Nampt. (D and E) RT-qPCR was used to observe the mRNA levels of ANF and BNP. *P<0.05 vs pcDNA 3.1 group,#P<0.05 vs pcDNA 3.1+PE group,n=3.

Fig 1 Changes of nicotinamide phosphoribosyltransferase (Nampt) expression in phenylephrine (PE) -induced cardiomyocyte hypertrophy in primary neonatal rat cardiomyocytes(NRCMs)NRCMs were incubated with PE (100 μmol·L-1) for the indicated time point. A: The cell surface area was measured by high content screening analysis. Scale bar:100 μm; B: The mRNA levels of hypertrophic biomarkers including ANF,BNP and β-MHC,were determined by RT-qPCR; C: The nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) level was determined by NAD+/NADH Assay Kit; D: RT-qPCR was used to determine the mRNA transcriptional level of Nampt; E: Western blot was conducted to detect the protein level of Nampt. *P<0.05, **P<0.01 vs control group (n=3).

Fig 2 Changes of Nampt expression in cardiac hypertrophy caused by isopropylarterenol (ISO) and abdominal aortic constriction (AAC)Sprague-Dawley (SD) rats were intraperitoneally injected with ISO (2.5 mg·kg·d-1) for 1 or 3 weeks,or SD rats were subjected to AAC for 8 weeks. (A and C) Representative images of gross heart were shown. (B and D) Representative hematoxylin-eosin (HE) staining images of heart tissues were shown. Scale bar:50 μm. (E) The mRNA level of Nampt was detected by RT-qPCR in AAC-induced cardiac hypertrophy. (F) The protein changes of Nampt was measured by Western blot in AAC-induced cardiac hypertrophy. (G) The mRNA level of Nampt was detected by RT-qPCR in ISO-induced cardiac hypertrophy and heart failure. (H) The protein changes of Nampt were observed by Western blot in ISO-induced cardiac hypertrophy and heart failure. *P<0.05 vs control group,n=3.

3 討論

心肌肥大通常最終會導致心力衰竭，目前其發病率及致死率仍是導致臨床死亡的主要病因。因此，維持心臟功能處于代償期及以前，使其免于發展為心力衰竭，可有效降低心血管疾病的死亡率。然而，病理性心肌肥大的發生發展過程極其復雜，涉及的信號通路和理化因子等仍需要進一步研究闡明[1]。研究表明，心肌細胞發生氧化應激時，線粒體內活性氧的升高會影響電子呼吸傳遞鏈，損害線粒體氧化磷酸化功能，進而導致一系列肥厚相關信號通路的改變，使心臟出現病理性肥大并引起心肌細胞凋亡[1,11]。

過量的兒茶酚胺會在體內和體外引起心肌肥大。而兒茶酚胺類主要是作用于腎上腺素能受體，從而參與了對心臟的調控作用。研究報道，心肌細胞中存在多種腎上腺素能受體，包括α1-腎上腺素能受體(α1A、α1B和α1D)和β-腎上腺素能受體(β1、β2和β3)[12]。PE一方面可以激動α1腎上腺素受體，另一方面是其也具有弱的β受體激動作用[13]，所以PE是心肌細胞良好的肥大刺激劑。而ISO 則通過非選擇性激動β受體，從而達到刺激心臟的效果。因此，我們分別選用PE和ISO作為心肌肥大的誘導劑。根據實驗室前期研究基礎[14]，采用100 μmol · L-1的PE刺激原代心肌細胞，成功復制了PE誘導的心肌肥大模型。分別采用皮下ISO給藥3周及AAC手術8周的方式，成功建立了SD大鼠心肌肥大和心衰模型。

細胞內NAD+的合成途徑包括從頭合成和補救合成。在原核生物和低等真核生物中，主要有利用喹啉酸經從頭途徑和利用煙酸經補救途徑合成NAD+兩種方式；在哺乳動物中，則主要是由色氨酸和天冬氨酸通過從頭途徑合成NAD+[6,15]。研究表明，擴張型心肌病(dilated cardiomyopathy，DCM)伴有心衰的患者心臟組織中NAD+水平和NAD+/ NADH比值均降低；在 AngⅡ 引起的高血壓和ISO誘導的心衰模型中，也觀察到NAD+水平的下降。外源添加的NAD+能激活SIRT1，減少心衰患者的氧化應激和細胞凋亡；能提高心衰患者SIRT3活性，從而改善心臟功能；能激活SIRT7，調節其轉錄活性并抑制肥大相關基因表達從而抑制心肌肥大[16]。這些表明NAD+在心臟中主要發揮保護作用，與我們的實驗結果也是一致的。

Nampt在心臟保護中發揮了重要作用。內源性Nampt上調可以保護心臟免受缺血/再灌注的損傷，Nampt下調則明顯增加了心肌細胞的凋亡，其潛在機制可能是通過增加細胞NAD+水平，從而激活與NAD+相關的蛋白信號通路[7]。在本實驗中，我們發現心肌肥大刺激下Nampt的表達增加、NAD+含量降低，過表達Nampt一定程度上減輕了PE誘導的心肌肥大；相反地，干擾 Nampt表達或抑制其酶活性則會導致心肌細胞出現肥大效應。我們猜測，可能是Nampt酶活性依賴性地升高心肌細胞內NAD+含量，進而發揮抵抗心肌肥大的作用。

此外，ERK1/2 磷酸化可導致多種信號通路發生改變。研究表明，在AngⅡ 誘導的心肌肥大模型中，ERK1/2磷酸化水平明顯升高[10]。而磷酸化的ERK1/2可能激活肥厚相關信號通路。本研究發現，過表達Nampt可以抑制PE誘導的ERK1/2的磷酸化水平，而干擾Nampt合成或抑制其酶活性則會誘導ERK1/2激活。據文獻報道，胞內NAD+可增強SIRT1和SIRT3的去乙酰化酶活性。SIRT3可通過抑制MAPK、ERK1/2和PI3K/Akt通路來阻斷心肌肥大反應[17]；SIRT1可以NAD+依賴性地抑制與抗氧化損傷相關的Ras/ERK1/2通路[18]。本研究中，Nampt抑制ERK1/2磷酸化的具體機制并未詳細闡明，基于上述研究背景及本實驗室的前期研究基礎，我們猜測Nampt可能通過調控細胞內NAD+含量進而改變了SIRTs(特別是SIRT1、SIRT3)的去乙酰化酶活性，進而間接調控了ERK1/2的磷酸化水平。

在本實驗中，我們發現Nampt通過調控心肌細胞內NAD+含量及ERK1/2磷酸化水平，有效地抵抗病理性心肌肥大，為病理性心肌肥大的防治提供了科學的理論依據。