牛蒡子苷元通過SIRT1/NLRP3途徑減輕哮喘小鼠氣道炎癥

樸藝花，宋藝蘭，王知廣，姜京植，李良昌，樸紅梅，延光海

(1.延邊大學附屬醫院 重癥醫學科，吉林 延吉 133000；2.吉林省過敏性常見疾病免疫與靶向研究重點實驗室，吉林 延吉133002；3.延邊大學醫學院解剖教研室，吉林 延吉 133002；4.延邊大學附屬醫院呼吸與危重病醫學科，吉林 延吉 133000)

支氣管哮喘是呼吸系統常見氣道慢性炎癥疾病之一。近年來，隨著空氣污染等環境因素的改變，支氣管哮喘等過敏性呼吸系統疾病的發病率越來越高[1]。哮喘的主要病理表現為氣道炎癥、氣道高反應性和氣道重塑，其中氣道炎癥是哮喘的本質特征。目前認為輔助性T淋巴細胞(T helper cell，Th)兩種亞型Th1、Th2之間的平衡失調也是是哮喘發作的機制之一[2]。因此，研究哮喘的發病機制及治療藥物具有十分重要的意義。

沉默信息調節因子1(silent information regulator 1，SIRT1)是Sirtuins家族(SIRT1-7)的一員，是最近發現的III型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依賴性組蛋白去乙酰化酶[3]。SIRT1主要位于哺乳動物的細胞核中，通過乙?；钚园l揮其功能[3]。最近的研究表明，SIRT1可以調節NOD (nucleotide binding oligomerization domain)樣受體家族3(NOD-like receptors，NLRP3)來抑制炎癥的發生并延緩炎癥反應[4]。NLRP3炎癥小體是一種細胞內蛋白復合體，可以調節機體的炎癥反應[5]。NLRP3炎癥小體在激活需要半胱氨酸的天冬氨酸蛋白酶-1(caspase-1)中起關鍵作用?；罨腸aspase-1進一步介導促炎細胞因子及白細胞介素-1β (interleukin-1β，IL-1β)和白細胞介素-18 (interleukin-18，IL-18)的成熟和分化，最后會誘發機體的炎癥反應[6]。

牛蒡子苷元(arctigenin，ATG)是從菊科二年生草本植物牛蒡的干燥成熟果實牛蒡子中提取的木脂素類化合物[7]，具有多種生物活性，包括抗炎、抗氧化、抗癌和抗病毒[8-10]。有研究表明，牛蒡子苷元可以通過抑制核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)活化從而降低哮喘小鼠氣道炎癥，NF-κB已被證實可以激活NLRP3炎癥小體加重炎癥反應[11]。Pu等[4]研究發現，牛蒡子苷元通過SIRT1抑制NLRP3炎癥小體減輕葡聚糖硫酸鈉鹽誘導的急性結腸炎的炎癥反應。由此推斷，牛蒡子苷元在卵清蛋白(ovalbumin，OVA)誘導的哮喘小鼠模型中有可能通過調控SIRT1抑制NLRP3炎癥小體抑制氣道炎癥，為進一步治療支氣管哮喘提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑牛蒡子苷元(批號:HB-01110)，純度≥98.0%，購自武漢科斯坦生物科技有限公司；卵清蛋白(ovalbumin，OVA，批號：9006-59-1)、氫氧化鋁粉(批號：24623-77-6)，美國 Sigma 公司；β-actin抗體(#3700)，購自美國 Cell Signaling Technology(CST)公司，SIRT1(ab18239)、Caspase-1(ab19672)、IL-18(ab19954)和IL-1β(ab16805-15)，購自美國Abcam公司。NLRP3(#768319)、膠原酶A(#17100017，Gibco，US)，DNase I(#D5025-150KU，Sigma-Aldrich，US)，FITC-CD4(#11-0041-82)、PE-CY7-IL-4(#25-7042-41)、APC-IFN-γ(#17-7319-41)、Goat anti-Mouse IgG1 Cross-Adsorbed Secondary Antibody,Alexa Fluor 488(#A-21121)及透化試劑盒(#88-8824-00)，購自美國invitrogen公司。全蛋白提取試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、迪夫快速染色液(Diff-Quik Stain)，購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器JZ-8B 霧化器，北京九州晟欣科技有限公司；2135型輪轉式切片機，德國 Leica 公司；Cytation5細胞成像微孔板檢測系統，美國Biotek公司；15K高速冷凍臺式離心機，美國Sigma公司；CytoFLEX流式細胞儀，美國Beckman Coulter公司；電泳儀及電泳槽(批號：E-C)，美國Apparatus Corporation公司；Western blot轉膜儀，美國Bio-Rad公司；TXD3細胞涂片離心機，廣州瀘瑞明儀器有限公司。

1.3 實驗動物及分組實驗動物為♀清潔級 BALB/c小鼠40只，鼠齡4-6周，體質量(20±2)g，由延邊大學實驗動物中心提供，合格證號為 [SYXK(吉)2020-0010]。在整個研究過程中，所有動物均在12 h光照-黑暗周期、溫度(22±2)℃和相對濕度(55±5)%的條件下飼養。本實驗已通過延邊大學醫學院倫理委員會的批準(批號：IACUC- 20170105039)，并按照《實驗動物管理條例》，盡可能做到減輕小鼠痛苦。

將40只BALB/c小鼠隨機分為5組，每組8只，分為正常對照組(control)、OVA 誘導的哮喘模型組(OVA)、ATG 5 mg·kg-1、ATG 10 mg·kg-1和ATG 20 mg·kg-1組。

1.4 小鼠哮喘模型的制備BALB/c小鼠在層流室飼養 1 周，隨后d 1、7、14，正常對照組小鼠每只腹腔注射200 μL生理鹽水，其余4組小鼠均腹腔注射200 μL致敏液(致敏液的組成為 10 μg卵清蛋白，1 mg氫氧化鋁佐劑和生理鹽水)。從d 17開始，正常對照組和OVA組每天腹腔注射二甲基亞砜(DMSO)200 μL，ATG組分別腹腔注射溶于DMSO的ATG(5、10、20 mg·kg-1)200 μL。于d 21，在每日腹腔注射給藥1 h后，除了正常對照組使用生理鹽水霧化吸入，OVA組和ATG組激發使用3% OVA 10 mL霧化液，30 min·d-1，連續激發3 d。最后一次注射后，小鼠24 h內被處死(Fig 1)。

Fig 1 Model preparation diagram

1.5 標本收集小鼠在末次給藥激發24 h后，采用吸入過量乙醚至死，手術部位用乙醇消毒，消毒后使用手術剪刀剪開小鼠頸部皮膚并剝離，暴露氣管，在氣管中上段剪“-”型切口，并置入軟管接1 mL注射器，氣管內注入緩慢注入1 mL冷生理鹽，同時輕柔小鼠胸部，逐漸回抽，重復沖洗2次，回抽的液體即支氣管肺泡灌洗液，肺泡灌洗液3 000 r·min-1離心10 min，提上清液置-80 ℃凍存。剩余的沉淀用于細胞涂片，再將小鼠兩側肺組織剝離，左肺置4%甲醛中固定，右肺-80 ℃凍存。

1.6 支氣管肺泡灌洗液( bronchoalveolar lavage fluid，BALF) 中炎癥細胞分類及計數BALF以3 000 r·min-1離心10 min后的剩余沉淀中加入生理鹽水，至600 μL，充分混均勻后，取200 μL用于細胞涂片，置入細胞涂片離心機，以1 000 r·min-1離心5 min制備細胞涂片。采用迪夫快速染色液(Diff-Quik Stain)染色，在光學顯微鏡下進行炎癥細胞分類及計數。

1.7 肺組織學檢查置于4%甲醛中的左肺依次給予脫水、浸蠟、包埋等步驟，并分別進行HE、PAS染色。

1.8 流式細胞術將小鼠肺組織切成小塊放入6孔板中，加入1 g·L-1膠原酶A和1 500 kU·mL-1DNase I以及0.025 mol·L-1CaCl2，并在37 ℃孵育4 h進行消化獲得的單細胞懸液，選取1×106細胞用于流式檢測。染色步驟為：首先行細胞表面染色，用FITC-CD4抗體，4 ℃孵育30 min；再利用細胞固定和透化試劑盒進行破膜打孔；最后進行胞內染色，抗體選用PE-CY7-IL-4和APC-IFN-γ，在4 ℃孵育30 min。在CD4陽性T細胞群中分析IL-4和IFN-γ陽性細胞的比例。

1.9 蛋白免疫印跡法(Western blot)按照全組織蛋白提取試劑盒說明書，提取各組小鼠右肺組織蛋白，采用BCA法蛋白定量后按比例添加雙蒸水、上樣緩沖液(5×)，并在100 ℃沸水上變性5 min。自然冷卻至室溫。每個泳道加20 μL蛋白樣品，用8%-12% SDS-PAGE 凝膠在90 V電壓下電泳90 min左右，分離后，轉移到PDVF膜中，加入5%脫脂奶粉封閉液中，室溫封閉2 h，TBST緩沖液洗膜，加入按1 ∶1 000比例稀釋的一抗(SIRT1、NLRP3、caspase-1、IL-1β、IL-18、β-actin)4 ℃過夜后TBST緩沖液洗膜，然后加相應的二抗，室溫孵育1 h。最后加入ECL發光試劑，利用Amersham Imager 600采集圖像。

1.10 免疫熒光步驟如下: (1)將各組肺組織石蠟切片在60 ℃烤片機上烤片1 h，在室溫放置 5 min; (2)常規石蠟切片脫蠟至水后，放入一蒸水中2 min; (3)在枸櫞酸鹽溶液浸泡切片，微波高火修復 5 min 后，室溫自然冷卻至30 ℃，PBS緩沖液(×1)洗5 min × 3次; (4)加3%BSA溶液，封閉 60 min，PBS緩沖液(×1) 洗5 min × 3次，加1 ∶50稀釋的NLRP3抗體，4 ℃過夜; (5)拿出濕盒室溫孵育1 h，PBS緩沖液(×1)洗5 min × 3次; (6)加1 ∶100稀釋的羊抗鼠熒光二抗，避光孵育1 h，PBS緩沖液(×1)洗 5 min × 3次; (7)加DAPI染核3 min，PBS緩沖液(×1)洗5 min × 3次; (8)最后用熒光防淬滅封片劑封片后鏡下觀察。

2 結果

2.1 ATG對OVA誘導的哮喘小鼠肺組織病理改變的影響如Fig 2所示，肺HE染色顯示，與正常對照組相比，OVA組小鼠肺可見細支氣管周圍的炎癥細胞的浸潤，而ATG治療組顯著減輕炎癥細胞浸潤。PAS染色顯示，ATG對OVA 誘導的氣道上皮的黏液分泌增多和杯狀細胞的增生抑制作用。以上結果提示ATG可以減輕哮喘小鼠氣道周圍炎性改變。

2.2 ATG抑制OVA誘導的哮喘小鼠模型BALF中炎癥細胞的生成如Fig 3所示，除正常對照組以外，余OVA組、ATG組小鼠BALF中總細胞數(Total)與嗜酸性粒細胞(eosinophil，EOS)、中性粒細胞(neutrophil，NEU)、淋巴細胞(lymphocyte，LYM)的細胞數均不同程度升高。與OVA組相比，ATG組的總細胞數與EOS、NEU、LYM均明顯減少。由此得出，ATG可以緩解氣道炎癥反應。

2.3 ATG抑制OVA誘導的哮喘小鼠肺組織中炎癥細胞因子的含量如Fig 4所示，與正常對照組相比，OVA組哮喘模型小鼠肺組織中Th1型細胞因子干擾素-γ(IFN-γ)水平明顯下降，Th2細胞因子(IL-4)的水平明顯升高，ATG治療能夠顯著升高IFN-γ水平同時降低IL-4的水平。以上結果提示哮喘小鼠模型中Th1亞群功能低下，Th2亞群亢進有關。經ATG治療能夠明顯改善OVA誘導的哮喘小鼠肺組織中Th1、Th2功能失衡。

2.4 ATG通過SIRT1抑制OVA誘導的哮喘小鼠肺組織中NLRP3炎癥小體的表達如Fig 5A所示，Western blot結果中可以觀察到OVA組肺組織中SIRT1蛋白表達與正常對照組相比，明顯被抑制，但NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18蛋白表達明顯升高。與OVA組相比，ATG組SIRT1蛋白表達明顯升高，且抑制NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18蛋白的高表達。Fig 5B肺組織免疫熒光結果同樣提示，經OVA誘導后NLRP3熒光強度明顯增強，經ATG治療后NLRP3熒光強度顯著下降。結果表明，牛蒡子苷元激活SIRT1信號通路抑制OVA誘導的哮喘小鼠肺組織的NLRP3炎癥小體。

Fig 5 (A) Detection of SIRT1,NLRP3,caspase-1,IL-1β and IL-18 protein by Western blot;(B) Fluorescence intensity of NLRP3 in lung tissues determined by immunofluorescence(×200). ##P<0.01 vs control; *P<0.05,**P<0.01 vs OVA.

Fig 4 Effect of ATG on levels of IFN-γ and IL-4 cytokines in lung tissues of

Fig 3 Effect of ATG on number of different inflammatory cells in BALF of EOS: Eosinophil; NEU: Neutrophil; MAC: Macrophage; LYM: Lymphocyte. ##P<0.01 vs control; *P<0.05,**P<0.01 vs OVA.

Fig 2 Effect of ATG on pathological changes of lung tissues(×200)

3 討論

哮喘是一種反復發作的慢性炎癥性疾病，不僅發病率高，且難以有效治愈，其最有效的治療方式仍是使用激素類藥物。牛蒡子苷元(ATG)廣泛應用于炎性疾病的治療中。既往研究表明，ATG在急性肺損傷模型中顯著抑制LPS引起的肺組織炎癥反應，且減少由LPS引起的白蛋白、中性粒細胞、巨噬細胞、淋巴細胞增多的現象[7]。本研究結果提示，HE染色、PAS染色結果顯示，OVA誘導后支氣管周圍杯狀細胞明顯增生、大量黏液的分泌，炎癥細胞浸潤、滲出明顯。OVA誘導的哮喘模型BALF中淋巴細胞、嗜酸性粒細胞、中性粒細胞等炎癥細胞明顯增多。而且OVA誘導的小鼠肺組織中Th1細胞因子IFN-γ的水平降低，同時伴隨著Th2細胞因子IL-4的水平明顯升高，提示OVA哮喘小鼠模型中Th1與Th2之間已失去平衡。ATG治療后明顯改善支氣管周圍黏液的分泌及炎癥細胞的浸潤，并降低肺泡灌洗液中總細胞數、中性粒細胞、淋巴細胞和嗜酸性粒細胞的數量。同時ATG治療能夠明顯改善OVA 誘導的哮喘小鼠肺組織中Th1/Th2失衡。以上結果提示ATG通過減少炎癥細胞總數和各分類細胞數、炎癥細胞因子的含量，且同時減少哮喘小鼠氣道周圍的炎癥細胞浸潤和杯狀細胞增生來抑制OVA誘導的哮喘模型小鼠氣道炎癥。

SIRT1是一種重要的抗衰老因子，SIRT1可調節炎性反應、調節基因表達、參與糖脂代謝等許多病理生理過程[12]。Peng等[13]研究發現，在慢性阻塞性肺疾病中，上調SIRT1可以抑制NLRP3炎癥小體激活，抑制炎癥反應。已證實SIRT1是NLRP3的負調控上游因子，SIRT1/NLRP3信號通路廣泛研究于炎癥性疾病、心腦血管疾病等[4,14]。值得注意的是，在哮喘模型中給予NLRP3抑制劑可抑制AHR和肺部炎癥[15]。本實驗Western blot結果提示，OVA可以抑制SIRT1蛋白表達，同時誘導NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18蛋白高表達，經ATG治療后被抑制的SIRT1表達逐漸升高，上調的NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18蛋白表達明顯被抑制。同樣，肺組織熒光結果表明，ATG治療可以明顯減弱被OVA激活的NLRP3熒光強度。

綜上所述，ATG可有效減輕OVA誘導的哮喘小鼠氣道炎癥細胞的浸潤并降低其炎癥細胞因子水平，并通過上調SIRT1蛋白表達，抑制NLRP3炎癥小體，從而起到改善氣道炎癥的作用。以上實驗結果表明，ATG改善氣道炎癥可能是與SIRT1/NLRP3通路密切相關。