水楊酸甲酯糖苷對阿爾茨海默病模型鼠學習記憶的影響

馬曉瑋， 顧紅燕，栗 芳，張天泰

(1.首都醫科大學附屬北京世紀壇醫院，北京 100038；2.臨床合理用藥評價北京市重點實驗室，北京 100038；3.臨床合理用藥評價國際合作聯合實驗室，北京 100038；4.中國醫學科學院藥物研究所，北京 100050)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種以獲得性記憶減退、認知功能障礙等為主要特征的中樞神經系統退行性疾病，記憶力減退，認知功能障礙是AD的重要特征，與腦內學習記憶部位神經元的損傷有關。基于AD主要的特征性病理改變，科學家們提出了許多相關的病理假說，包括著名的β淀粉樣蛋白假說、tau蛋白過度磷酸化假說，以及神經元突觸丟失等假說，這些假說都與AD密切相關[1-2]。但是，這些假說都是AD發生中后期的病理表現，并不能全面清楚地闡述AD發生的原因和內在機制。近年來，越來越多的證據表明，神經炎癥反應在AD發生發展中發揮了重要的作用，神經炎癥機制學說逐步被領域內科學家所認可。

自1982年Eikelenboom等[3]首次發現AD病人Aβ斑塊中有炎性相關蛋白(補體因子，急性期反應蛋白)以來，人們開始認識到了先天性免疫和炎癥反應在AD中的作用。此后的一系列研究顯示AD中有多種炎性細胞參與，包括小神經膠質細胞、星形膠質細胞等炎性細胞，尤其是小神經膠質細胞是腦內炎性反應的主要參與者[4]。由于神經炎癥機制在AD的發生發展中扮演了重要的角色，抗炎治療AD成為了一種可能的選擇。神經病理學、臨床流行病學、以及轉基因動物等的研究提示非甾體抗炎藥治療AD具有非常積極的作用[5]，但是，臨床治療研究尚未表現出理想的療效[6]，NSAIDs的抗AD作用機制還不十分明確。

水楊酸甲酯糖苷(methyl salicylate 2-O-β-D-lactoside，MSL)是來源于傳統民族中藥滇白珠的天然產物衍生物，我們前期的研究顯示其具有明確的抗類風濕關節炎作用，且沒有胃腸道副作用，是一種新型的非甾體抗炎藥[7-9]。本研究擬基于APP/PS1轉基因小鼠AD模型，考察其對學習記憶改善的作用。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑MSL由北京協和藥廠提供(批號：20110323)，純度為99.8%。阿司匹林、羧甲基纖維素鈉購自美國Sigma公司；多聚甲醛、乙醇等購自北京化工廠；Thioflavin T購自英國Abcam公司。

1.2 儀器灌流儀(LongerPump公司，BT100-1/0602)；水迷宮實驗裝置(中國醫學科學院藥物研究所研制)；冰凍切片機(德國徠卡，CM1860)；透射電鏡(Hitachi，日本日立公司)；正置熒光顯微鏡(NIKON ECLIPSE 80i)；光學顯微鏡(XSZ-HS3普通光學顯微鏡，重慶光學儀器廠)。

1.3 動物及實驗分組APP/PS1(APPswe/PSEN1dE9)雙轉基因小鼠，野生型C57BL/6小鼠均購自南京大學模式動物研究所，8月齡，體質量(28±2) g，許可證號：SCXK(蘇)2010-0001，合格證號：0006903。自由攝食、飲水，室溫(2±3) ℃，相對濕度40%-50%，安靜，通風干燥，12 h光照周期飼養。將APP/PS1小鼠及同窩野生型小鼠(Wide type，WT)按體重隨機分為8個組，分別為WT control，WT MSL 150 mg·kg-1，WT MSL 300 mg·kg-1，WT aspirin 80 mg·kg-1，APP/PS1 control，APP/PS1 MSL 150 mg·kg-1，APP/PS1 MSL 300 mg·kg-1，APP/PS1 aspirin 80 mg·kg-1，n=8。野生型對照組和APP/PS1對照組灌胃給予0.5% CMC-Na，野生型藥物對照組和APP/PS1治療組分別灌胃給予以0.5% CMC-Na溶解的MSL和阿司匹林，每天1次，每周6次，連續給藥5個月。

1.4 Morris水迷宮實驗Morris水迷宮實驗裝置由圓形水池，圖像自動采集和軟件分析系統構成，圖像自動采集和軟件分析系統主要由攝像機、計算機、圖像監視器組成，動物放入水中后啟動監測裝置，實驗完畢自動分析報告結果參數，包括實驗動物的運行軌跡，找到平臺的時間，游泳速度等。水迷宮直徑100 cm，高度35 cm，水池水深約為15.5 cm。水溫維持在(23±1) ℃。在其中一個象限放置一個直徑為4.5 cm，高度14.5 cm的平臺，保證平臺在水面之下1 cm。在水池上緣等距離地設東、西、南、北4個標記作為動物入水點，同時依據這4個入水點在水面和水池底部的投影點，將整個裝置平均分為4個象限。實驗過程中，保持環境安靜并且水迷宮周圍的物品位置和光源固定不變[10]。

水迷宮實驗分為定位航行實驗和空間探索實驗兩部分，定位航行實驗用于考察小鼠學習和記憶的獲取能力。每只小鼠每天從2個不同象限面向池壁入水，記錄搜尋并登上平臺所用時間，即潛伏期(s)，如果在60s的時間內小鼠沒能找到隱匿平臺，則將小鼠引導至平臺，并停留30 s，以此類推。同時記錄下每只小鼠的游泳速度，如此連續訓練5 d即完成定位航行試驗。d 6進行空間探索試驗，用于考察小鼠學會尋找平臺后對平臺空間位置記憶的保持能力。將水下平臺撤掉，每只小鼠自由游泳60 s，記錄小鼠在目標區域(前5 d放置水下平臺的區域)的停留時間和穿越平臺次數。所有數據均用計算機系統自動記錄。

1.5 灌流、取材、固定及大腦切片制作小鼠于末次行為學測試后，禁食12 h，不禁水，次日進行腦組織取材。小鼠用干冰麻醉。取仰臥體位，打開小鼠胸腔，充分暴露心臟，自左心室插入鈍針頭至主動脈，剪開右心耳，快速灌注生理鹽水50 mL以沖洗血液，4%多聚甲醛溶液灌注至肝臟發白，全身僵硬為止。快速斷頭取出全腦，冰浴中分離腦組織，用于冰凍切片的腦組織置于4%多聚甲醛溶液中于4 ℃后固定1 d，換入含30%蔗糖的4%多聚甲醛溶液中。用于石蠟切片的腦組織放入4%多聚甲醛中后固定。制作冰凍切片和石蠟切片。

1.6 尼氏染色冰凍切片置于丙酮中固定30 min，PBS沖洗，3 min×3次。然后，甲苯胺藍染料中染色20-30 min，水洗15 min。最后，酒精梯度脫水(依次70%、95%、100%)，二甲苯透明，中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察、照相。

1.7 透射電鏡(TEM)檢測小鼠麻醉后暴露心臟，自左心室灌注0.9%生理鹽水，隨后灌注4%多聚甲醛。快速斷頭取出全腦，冰浴中分離皮層和海馬，置固定液(2%多聚甲醛-戊二醛)中固定2 h；磷酸緩沖液(pH 7.2)10 min×3次；1%鋨酸4 ℃后固定2 h；雙蒸水沖洗10 min×3次；梯度乙醇脫水，環氧丙烷置換，純樹脂包埋，聚合；制備超薄切片，醋酸鈾-檸檬酸鉛雙染色。干燥后的切片于電鏡下觀察，拍照。

1.8 硫磺素T(Thioflavin T)染色熒光染料硫磺素T通過與淀粉樣蛋白中β折疊結合，從而標記組織中沉積的纖維樣斑塊。冰凍切片經PBS清洗后浸入蘇木精溶液中染色，再經PBS水洗、1% Thioflavin T溶液染色、PBS清洗，于中性甘油中封片。切片于正置熒光顯微鏡下觀察、拍照，通過Image Pro Plus軟件計算熒光強度，以平均熒光強度表示老年斑數量及面積的變化。

2 結果

2.1 MSL對AD小鼠空間學習能力的影響水迷宮實驗用來測試MSL用藥小鼠的學習記憶情況，該實驗潛伏期數據采用重復測量資料的方差分析。結果顯示，在前5 d的定位航行試驗中，小鼠逃避潛伏期隨訓練次數增加而逐漸縮短(P<0.001)，潛伏期的變化因分組的不同而表現出差異(P<0.001)。事后分析不同處理組的比較結果顯示，與WT對照組相比，APP/PS1模型組小鼠的潛伏期明顯延長，與模型組相比，MSL中高劑量組潛伏期明顯縮短，而阿司匹林對潛伏期的影響差異沒有顯著性，提示MSL對APP/PS1小鼠的學習記憶障礙有一定的改善作用，而阿司匹林對APP/PS1小鼠的學習記憶能力無明顯影響(Tab 1)。

Tab 1 Latency (s) of APP/PS1 mice during training days in Morris water

此外，口服MSL沒有改變野生型小鼠的逃避潛伏期，提示MSL僅能明顯提高AD小鼠的學習能力，長期口服同等劑量MSL對正常小鼠學習能力沒有影響。

同時評價了MSL 對AD 小鼠游泳速度的影響，結果顯示在前5d定位航行實驗中，隨著訓練天數的變化，各組小鼠的游泳速度趨勢相同(P>0.05)，并且各組小鼠之間差異無顯著性(P>0.05)，排除了小鼠個體間由于外周神經運動障礙、漂浮等因素所引起的潛伏期差異。

2.2 MSL對AD小鼠空間記憶能力的影響于實驗的d 6撤掉平臺進行空間探索實驗，結果如Fig 1A所示，野生型和用藥組能夠依靠空間記憶尋找平臺，其運動軌跡多位于原平臺所在象限，而模型組軌跡沒有趨向性，隨機分布于各象限。

與野生型小鼠相比，APP/PS1小鼠在平臺象限的停留時間及穿越平臺所在位置的次數明顯減少。經MSL治療后，模型小鼠在目標象限停留時間延長(P<0.01)，穿越平臺所在位置的次數增加。長期口服等量MSL未改變野生型小鼠的停留時間和穿越次數，提示MSL可提高AD小鼠的空間記憶能力，而對正常小鼠沒有影響(Fig 1B)。

2.3 MSL對AD小鼠皮層和海馬區神經損傷的影響在皮層組織中，WT對照組神經細胞體積較大，形態規則，尼氏體致密，而APP/PS1模型組神經細胞體積較小，尼氏體稀疏、部分缺失提示神經細胞出現損傷或功能障礙，由此導致尼氏小體溶解、缺失或合成障礙。經MSL 150 mg·kg-1、300 mg·kg-1治療后，神經細胞形態較為正常，尼氏體染色較為致密，無明顯缺失(Fig 2A)。尼氏染色陽性區域平均光密度統計結果顯示，與WT對照組相比，APP/PS1模型組的平均光密度值明顯降低(P<0.01)，與APP/PS1模型組比較，MSL 300 mg·kg-1組平均光密度值明顯升高(P<0.05)(Fig 2B)。而阿司匹林治療組在神經細胞形態學和平均光密度值兩方面均沒有明顯改變神經細胞的損傷。此外，口服MSL沒有改變野生型小鼠皮層組織尼氏染色陽性區域的平均光密度值。

Fig 1 Spatial learning and memory in APP/PS1 mice improved by MSLA:Moving trajectory of APP/PS1 mice on sixth day by Morris water maze test; B:The time spent in target quadrant and number of crossings of APP/PS1 mice in Morris water maze test ##P<0.01 vs WT control group;**P<0.01 vs APP/PS1 model group.

在海馬組織中，APP/PS1模型組神經細胞內尼氏體稀疏，MSL治療對神經細胞尼氏體缺失的改善不明顯(Fig 2A)，與WT比較，尼氏染色陽性區域平均光密度差異無統計學意義(Fig 2B)。口服MSL沒有改變野生型小鼠海馬組織尼氏染色陽性區域的平均光密度值。

2.4 MSL對AD小鼠皮層和海馬區神經氈的影響透射電鏡結果顯示，WT對照組小鼠皮層和海馬組織中神經元胞體較大，胞核呈圓形，核膜清晰，核內染色質分布均勻，胞質內含有豐富的內質網、線粒體等細胞器；神經氈軸索、微管形態正常。APP/PS1模型組小鼠神經氈中出現大量帶有核心斑塊和變性軸索的老年斑，神經氈內神經細胞與膠質細胞的突起呈現空泡化，軸索密集、變性，老年斑周邊的神經元發生不同程度的固縮，胞核皺縮、變形，核染色質聚集，間質水腫。與模型組相比，MSL 150 mg·kg-1、300 mg·kg-1治療后，APP/PS1小鼠腦內老年斑面積減小，神經氈空泡化減輕，神經氈排列較為緊密，多數神經元得到修復，神經細胞胞核扭曲變形及染色質聚集均得到改善。阿司匹林治療組對上述神經氈的病變改善作用不明顯。口服MSL對野生型小鼠皮層和海馬組織神經氈區域未見明顯影響(Fig 3)。

Fig 2 Effect of MSL on neuronal dysfunction in APP/PS1 mice with Nissl stainingA:Representative photographs of tissue sections stained with cresyl violet in the cerebral cortex and hippocampus (×200); B:The mean density of positive area in cerebral cortex and hippocampus ##P<0.01 vs WT cortex control group,*P<0.05 vs APP/PS1 cortex model group.

2.5 MSL對AD小鼠皮層和海馬區Aβ沉積的影響硫磺素T染色可以標記APP/PS1小鼠腦組織中Aβ的沉積。在大腦皮層及海馬組織中，WT鼠均未檢測到明顯的老年斑出現。與WT對照組相比，APP/PS1模型組小鼠在皮層和海馬組織均呈現大量陽性綠色熒光，提示腦組織中有大量Aβ斑塊沉積，即老年斑形成(Fig 4A)。同時，硫磺素T染色陽性區域平均熒光密度統計結果顯示，與WT對照組相比，APP/PS1模型組皮層和海馬區域的平均熒光密度均明顯增大(P<0.01)；與APP/PS1模型組相比，MSL治療組對皮層Aβ沉積所形成的綠色熒光明顯減少，硫磺素T染色陽性區域平均熒光密度明顯減小，在海馬組織中，老年斑的熒光密度雖有所降低，但差異無統計學意義；阿司匹林治療對老年斑沉積的改善作用不明顯(Fig 4B)。

Fig 4 Effects of MSL on Aβ deposition in cerebral cortex and hippocampus with Thioflavin T stainingA:Representative photographs of the Thio-T positive plaques in cerebral cortex and hippocampus of APP/PS1 mice. (×200); B:The proportion of Thio-T positive plaque in cerebral cortex and hippocampus ##P<0.01 vs WT cortex control group,**P<0.01 vs cortex APP/PS1 group.

3 討論

雖然以記憶力減退和認知功能障礙為特征的AD發病機制還未完全闡明，但神經炎癥反應貫穿著疾病發生發展的整個過程，通過抗炎改善AD的癥狀能否成為可行的治療措施還需要多方面的深入研究。本研究基于APP/PS1小鼠建立AD模型探討了來源于天然產物的新型非甾體抗炎藥MSL對AD模型鼠學習記憶的影響，發現MSL具有明顯的改善AD鼠空間記憶和學習的能力，這種作用可能與保護神經細胞炎癥損傷和減少Aβ沉積等有密切關系。

AD病理進展過程中Aβ沉積導致的小膠質細胞活化是神經系統炎癥反應重要原因，小膠質細胞的活化誘發了大量前炎性因子的分泌，從而誘發神經元的凋亡，神經元凋亡和突觸丟失是AD病人學習記憶減退的主要原因[11-13]。雖然神經炎癥反應在AD中的作用已經被廣泛認可，但針對腦內神經炎癥反應的抗炎治療改善AD癥狀還沒有確切的定論，所以探索通過抗炎治療改善AD癥狀的機制研究和新藥發現不失為一種積極的策略。本研究水迷宮實驗結果顯示，長期口服等量MSL未改變野生型小鼠的逃避潛伏期、停留時間和穿越次數等指標，說明長期口服MSL對正常小鼠的學習記憶能力沒有影響。經MSL治療后，模型小鼠的逃避潛伏期明顯縮短，找到平臺所用訓練次數減少，路線更為理想，其在目標象限停留時間延長，穿越平臺所在位置的次數增加，這些指標均提示MSL對APP/PS1小鼠的學習記憶障礙有較好的改善作用。另外，值得注意的是各組小鼠之間的游泳速度沒有明顯差異，一方面排除了游泳速度可能對潛伏期造成影響，另一方面說明MSL對潛伏期的影響源于MSL對大腦中樞神經系統的直接作用，該作用與改善外周運動神經的傳導因素無關。

盡管AD的特征性病變包括區域性細胞缺失、神經元內纖維纏結和細胞外β淀粉樣蛋白沉積，但最終決定AD患者認知功能障礙的是神經細胞的數目減少及功能缺失。尼氏體是神經細胞的一種正常結構，分布于胞質和樹突，由大量平行排列的粗面內質網和核糖核蛋白體組成，可作為觀察神經細胞功能狀態的靈敏指標，當神經元損傷或代謝機能發生障礙時，尼氏體即出現形態變化，甚至消失[14]。在本研究中，APP/PS1模型小鼠大腦皮層和海馬區域尼氏體著色稀疏、形態模糊、體積較小，呈現不同程度的缺失，提示神經細胞出現損傷或功能障礙。經MSL治療后，尼氏體著色程度增加，明顯提高了尼氏染色的平均光密度值，提示MSL對APP/PS1小鼠神經細胞的功能性損傷具有一定的改善作用。在對神經細胞及神經氈的超微結構檢測中，我們觀察到了APP/PS1小鼠腦中伴有老年斑沉積的神經退行性變化。口服MSL可使APP/PS1小鼠腦內老年斑面積減小，使神經氈空泡化減輕并緊密排列。此外，上述治療組中的多數神經元的形態損傷得到了修復，說明MSL既可能從形態學上緩解神經損傷，又可能在代謝機能等方面改善神經功能。此外，由于長期口服同等劑量MSL對野生型對照小鼠沒有影響，進一步說明MSL對AD病變小鼠具有防治作用。

Aβ是AD的特征性生物學指標，Aβ沉積也同樣是檢測AD顱內神經退行性變化的有效窗口，同時Aβ在腦內的沉積也是誘發神經系統炎癥反應的重要因素[15]。本研究通過硫磺素T染色及電鏡檢測特異性觀察了APP/PSl小鼠腦組織的Aβ沉積及MSL的作用，證實MSL對APP/PS1小鼠皮層Aβ沉積及老年斑的形成有一定的改善作用。提示MSL可能延緩Aβ沉積，亦或對Aβ的產生過程及代謝通路具有一定緩解作用。然而，海馬組織與空間位置的學習有關，是學習記憶的關鍵區域，但MSL僅在降低皮層Aβ沉積中發揮了較好的作用，而對海馬區域的Aβ沉積作用較弱，由此提示，MSL抑制Aβ沉積機制在治療AD的作用中較為有限，MSL或許只能在局限部位發揮抑制Aβ沉積作用，那么其在APP/PS1小鼠行為學實驗中呈現出的學習記憶改善作用，很有可能還有另外機制的參與，而電鏡結果中神經元周圍大量老年斑的出現及Aβ本身的致炎性提示，我們應該考慮到由其引發的神經炎癥損傷及MSL通過抗神經炎癥機制發揮神經保護作用的可能性。

綜上，通過對AD鼠動物模型的行為學評價，以及腦組織神經元功能性損傷、形態學變化及Aβ沉積等指標的考察，發現來源于天然產物的新型非甾體抗炎藥MSL具有明顯的改善APP/PS1轉基因小鼠的學習記憶能力，這種作用可能與MSL發揮抗炎作用而保護神經細胞、減少Aβ沉積等有關。