銀杏黃素抑制IκB-α的降解緩解LPS誘導的巨噬細胞炎癥損傷

劉 倩,蘭 欽,李 敏,鄭旭勇,陳高幟,張秀華

(1.溫州醫科大學第一臨床醫學院、信息與工程學院，浙江 溫州 325035；2.溫州醫科大學附屬第一醫院，浙江 溫州 325000；3.溫州醫科大學藥學院，浙江 溫州 325000)

銀杏葉具有益心斂肺、化濕止瀉的功效[1]。銀杏葉具有良好的藥用價值，已有研究證實，它在心血管疾病、腦缺血再灌注損傷和腎功能衰竭等疾病模型中均發揮較好的治療效果[2-4]，但銀杏葉中的哪一主要成分起到了緩解疾病進展的主要作用尚待研究。銀杏葉的主要有效成分為銀杏黃酮類化合物和萜類化合物，其中有研究證實銀杏黃酮類具有良好的抗炎及免疫調節活性，包括對急性胰腺炎的抗炎作用和對肺損傷的抗氧化作用等[5-6]。銀杏黃素是一種從銀杏葉中提取的新型黃酮類化合物[7]，據報道，銀杏黃素可能通過抑制促炎基因的表達例如COX-2(環氧合酶-2)和誘導NO合成酶(iNOS)，緩解關節炎和肺炎等炎癥疾病[7-9]。但銀杏黃素對經典炎癥通路的調控機制尚不清楚。因此，該研究使用經典的炎癥刺激物脂多糖(LPS)作用于小鼠腹腔原代巨噬細胞，來探究銀杏黃素的抗炎效果及其調控經典炎癥通路的分子機制，為天然化合物的的開發及抗炎候選藥物的遴選提供理論支撐和實驗依據。

1 材料

1.1 細胞株采用C57BL/6J小鼠原代腹腔巨噬細胞。

1.2 主要試劑與材料銀杏黃素(由陶素生化提供，貨號：481-46-9)；RPMI 1640培養基、胎牛血清、青霉素-鏈霉素混合液、0.25%胰蛋白酶(美國Gibco賽默飛公司)；PBS(美國HyClone公司)；DMSO、LPS(美國Sigma生物技術公司)；TNF-α ELISA試劑盒、IL-6 ELISA試劑盒(美國Invitrogen 公司)；RNA逆轉錄試劑盒(日本TaKaRa 公司)；ECL曝光液(碧云天生物科技有限公司)；MTT試劑盒(索萊寶生物有限公司)；p-ERK抗體(CST,貨號：4695S)；p-JNK抗體(CST,貨號：4668S);p-P38抗體(CST,貨號：9211S)；IκB-α抗體(proteintech，貨號：10268-1-AP)；GAPDH抗體(Cell Signaling 公司)。

1.3 儀器熒光定量PCR-Q3儀(Thermo公司);SpectraMaxM5型酶標儀(Molecular Devices生物科技公司);ChemiDoc XRS+凝膠成像系統(Bio-Rad)；熱循環PCR儀T100(Thermo公司)。

2 方法

2.1 小鼠腹腔原代巨噬細胞提取將150 mg牛肉膏，250 mg NaCl以及500 mg胰蛋白加入50 mL蒸餾水中，水浴加熱至溶液均勻透明，使用0.22 μm的濾膜過濾溶液殘渣，得到的溶液作為小鼠腹腔注射物用途。將2.5 mL該溶液腹腔注射入小鼠腹腔。2天后，頸部脫臼處死小鼠，使用RPMI 1640培養基灌洗腹腔，直至灌洗液澄清，使用15 mL離心管收集灌洗液。將離心管于1 100 r·min-1離心3 min，并用RPMI 1640培養基重懸[10-12]。之后進行細胞計數和鋪盤處理，此時RPMI 1640培養基應含有10% FBS，100 U/mL青霉素和100 g·L-1鏈霉素。2 h后除去未貼壁細胞，放置在相對濕度適宜的恒溫培養箱中(37 ℃，5% CO2)。

2.2 細胞毒性檢測使用細胞毒性檢測試劑盒(Solarbio，M1020)檢測銀杏黃素對原代巨噬細胞的毒性。離心管收集原代腹腔巨噬細胞，調整細胞懸液濃度，分于96孔板，每孔100 μL，60 000-80 000個細胞/孔，鋪盤時，注意多次重懸，保證每孔細胞的數量差異較小。置于含5% CO2的37 ℃恒溫箱培養使細胞貼壁。d 2，用不同濃度的銀杏黃素(80、40、20、10、5、2.5、1.25、0.625 μmol·L-1)孵育細胞24 h。之后，小心吸去上清，加入100 μL新鮮培養液，再加入20 μL /孔的5 g·L-1MTT溶液，繼續培養4 h。4 h后，棄去培養基，加入150 μL DMSO。低速振蕩使紫色結晶物充分溶解。490 nm波長測量樣品吸光值。

2.3 酶聯免疫吸附測定實驗原代腹腔巨噬細胞用銀杏黃素(20、10、5、2.5、1.25 μmol·L-1)預處理1 h， 使用LPS(500 μg·L-1)刺激24 h。次日，收集細胞培養基，4 ℃，1 000 r·min-1離心5 min，分裝上清于EP管在-20 ℃冰箱下保存。實驗前，將酶聯免疫吸附測定試劑盒放于室溫30 min回溫試劑。配置洗滌液和Elisa標準品，并梯度稀釋標準品作為檢測對照物。根據ELISA試劑盒說明書操作進行后續步驟。使用graphpad7.0繪制蛋白標準曲線計算相應指標蛋白質水平。

2.4 Western blot實驗原代腹腔巨噬細胞用銀杏黃素(10、5 μmol·L-1)預處理1 h，使用LPS(500 μg·L-1)刺激15 min。之后棄掉培養基，用1 mL PBS洗1次，然后將細胞裂解于60-80 μL含1 mmol·L-1PMSF的蛋白裂解緩沖液中。裂解完全后，將蛋白樣品配平放于控溫離心機4 ℃, 12 000 r·min-1離心10 min。使用BCA試劑盒測定樣品的蛋白濃度。配置蛋白濃度相等的各組樣品，加入5×蛋白上樣指示劑，置于100 ℃水浴中加熱變性10 min。蛋白樣品離心后，快速冷卻至室溫，取20 μL上樣并進行電泳。70 V恒壓至Marker分離完全后，加壓至120 V，待Marker跑至分離膠底部時結束電泳，進行電轉。將適宜大小的PVDF在甲醇中浸泡60 s后使用。將轉膜液倒入事先準備好的轉膜盒中，使用轉膜夾夾緊PVDF膜和凝膠，放入轉膜槽內300 mA，90 min轉膜。轉膜結束后，將PVDF膜置于5% BCA中封閉50 min，TBST洗4次，一抗孵育，4 ℃搖床過夜。第二日，回收抗體，TBST洗4次，加入相應種屬二抗，室溫搖床孵育90 min后，TBST洗4次，Bio-Rad凝膠成像系統顯影。

2.5 qRT-PCR原代腹腔巨噬細胞用銀杏黃素(10、5 μmol·L-1)預處理1 h，使用LPS(500 μg·L-1)刺激6 h。之后棄掉培養基，用1 mL PBS洗1次，然后將腹腔原代巨噬細胞置于1 mL TRIzol裂解液中，充分裂解并在冰上靜置3 min。然后加入200 μL氯仿，振蕩20 s，冰上靜置3 min，4 ℃離心(12 000×g/min-1)15 min。將RNA相液體吸出，移至另一EP管中，等體積加入異丙醇，輕微振蕩靜置10 min，4 ℃離心(12 000×g/min-1)10 min，棄上清。使用1 mL無水乙醇洗滌EP管底部沉淀，4 ℃ 7 500 g離心5 min，棄上清，待樣品完全干燥后使用適量DEPC水溶解。將RNA逆轉錄得到cDNA。并以cDNA作為模板，使用熒光定量PCR-Q3儀檢測系統進行實時定量PCR。β-actin作為內參對照物。PCR引物由美國Invitrogen公司合成。TNF-α引物上游序列5′- TGATCCGCGACGTGGAA-3′，下游序列5′- ACCGCCTGGAGTTCTGGAA -3′。IL-6引物上游序列5′- AAGTCCGGAGAGGAGACTTC-3′，下游序列5′- TGGATGGTCTTGGTCCTTAG -3′。β-actin引物上游序列5′- CCGTGAAAAGATGACCCAGA-3′,下游序列5′- TACGACCAGAGGCATACAG -3′。

3 結果

3.1 銀杏黃素對小鼠腹腔原代巨噬細胞的細胞毒性較小銀杏黃素的化學結構式如圖所示(Fig 1A)，為了探究銀杏黃素對MPM細胞的是否有毒性，給予不同濃度的銀杏黃素(80、40、20、10、5、2.5、1.25、0.625 μmol·L-1)孵育MPM細胞24 h，使用MTT試劑盒。MTT結果顯示(Fig 1B)，銀杏黃素對小鼠MPM細胞表現出較低的細胞毒性(IC50=19.63 to 20.37 μmol·L-1) 。

3.2 銀杏黃素可以緩解LPS誘導小鼠腹腔原代巨噬細胞的炎癥反應為了確定銀杏黃素是否能夠減輕LPS誘導的炎癥反應，應用ELISA法和qPCR法檢測了LPS誘導的小鼠腹腔原代巨噬細胞的TNF-α和IL-6的分泌水平和轉錄水平。Elisa結果顯示(Fig 2A)，經不同濃度的銀杏黃素處理后，可以顯著降低LPS誘導下MPM細胞的TNF-α和IL-6的分泌，且呈濃度依賴性。5 μmol·L-1和10 μmol·L-1銀杏黃素的抗炎效果最好，且對MPM細胞基本無毒。qPCR結果顯示(Fig 2B)，經5、10 μmol·L-1銀杏黃素作用后，能夠明顯降低LPS誘導下MPM細胞中TNF-α和IL-6的mRNA表達水平，且呈濃度依賴性。

Fig 1 The relatively small toxicity of Ginkgetin on mouse primary peritoneal macrophages n=3)

3.3 銀杏黃素通過抑制IκB-α的降解來發揮抗炎作用以上的實驗結果表明銀杏黃素對LPS誘導的炎癥反應具有良好的抑制效果，為了探究銀杏黃素發揮抗炎作用的分子機制，首先檢測了銀杏黃素對LPS誘導的經典炎癥信號通路MAPK和NF-κB通路的影響。Western blot實驗結果顯示銀杏黃素可以緩解NF-κB信號通路中IκB-α的降解(Fig 3A)，但是其對MAPK通路的磷酸化水平沒有緩解作用(Fig 3B-D)。所以，銀杏黃素是通過抑制NF-κB信號通路中IκB-α的降解來發揮抗炎作用。

Fig 3 The anti-inflammatory effect of Ginkgetin by alleviating IκB-α degradation n=3)*P<0.05, **P<0.01 vs control group; #P<0.05, ##P<0.01 vs LPS alone group.

Fig 2 The inflammatory response of lPS-induced in mouse primary peritoneal macrophages alleviated by Ginkgetin n=3)*P<0.05, **P<0.01 vs control group; #P<0.05, ##P<0.01 vs LPS alone group.

4 討論

固有免疫是機體抵御外來微生物入侵的重要保護屏障[13]。適當的炎癥反應能夠清除病原體達到保護機體的目的。但若是炎癥反應過于劇烈或是慢性持續存在，則會對機體產生意想不到的負面作用，甚至會導致器官功能紊亂、衰竭、甚至死亡[14]。如何控制機體內炎癥發生的“度”以減少對機體的傷害，一直是科學研究的熱點。

抗炎藥物干預是控制炎癥反應的常見措施[15]。大量研究表明，抗炎藥物可以改善急慢性炎癥性疾病的發生發展，例如穿心蓮內酯通過下調MAPK和NF-κB途徑改善脂多糖誘導的小鼠急性肺損傷[15]、姜根莖提取物可減輕高血糖引起大鼠糖尿病腎病損害[16]。因此，尋找到具有良好抗炎特性同時具備低毒性的先導化合物對預防及治療炎癥性疾病意義深遠。植物次生代謝提供了化學上多樣化的生物活性和藥理活性化合物，為我們開闊了尋找抗炎藥物的廣闊來源[17]。在我國，從古至今銀杏葉均被人們認為是具有很高入藥價值的植物[18]。銀杏葉具有降壓、降脂、抗炎、改善微循環等藥理作用[8]。而銀杏黃素是銀杏葉的次生代謝主要產物之一，檢驗它是否具有抗炎作用對我們尋找合適來源的抗炎藥物具有指導意義。

經典炎癥刺激物脂多糖(LPS)誘導的原代巨噬細胞炎癥損傷模型是用于篩選抗炎新藥的常用細胞模型[11]。在本研究中，我們使用TLR4受體經典激動劑LPS誘導小鼠腹腔原代巨噬細胞炎癥信號通路激活，致使大量炎癥細胞因子表達釋放并損害細胞。實驗結果顯示，在LPS的刺激下巨噬細胞中炎癥細胞因子TNF-α和IL-6的mRNA轉錄水平及分泌水平均顯著升高。與之對比，銀杏黃素干預模型組卻產生了意想不到的抗炎效果。LPS誘導的細胞損傷模型，激活經典的MAPK和NF-κB炎癥信號通路，因此，我們進一步探究了銀杏黃素是通過哪條炎癥通路來發揮良好的抗炎效果，結果發現銀杏黃素可以抑制NF-κB信號通路中IκB-α的降解，從而發揮其抗炎作用。

綜上所述，銀杏黃素通過抑制NF-κB信號通路中IκB-α 的降解，明顯降低LPS誘導的小鼠腹腔原代巨噬細胞中TNF-α和IL-6的分泌水平及其mRNA表達水平，從而緩解LPS誘導的小鼠腹腔原代巨噬細胞炎癥損傷反應。該研究將為天然化合物銀杏黃素后續抗炎研究提供理論依據，為候選藥物的遴選提供實驗基礎。

(致謝：感謝溫州醫科大學提供資金和技術的幫助，感謝師兄、師弟和師妹對我的鼓勵和幫助，感謝導師張秀華老師對實驗的指導和幫助。)