鈣感受器STIM1在小鼠主動脈平滑肌收縮反應中的作用研究

周夢園，張 利，曾 鵬，秦曉玥，鄭丹琳，李穗敏，鄺素娟，楊慧，饒芳，鄧春玉,3,4

[1.華南理工大學生物科學與工程學院，廣東 廣州 510006；2.廣東省人民醫院(廣東省醫學科學院)醫學研究部臨床藥理重點實驗室，廣東 廣州 510080；3.華南理工大學醫學院，廣東 廣州 510006;4.廣東省心血管病研究所心血管內科，廣東 廣州 510080]

血管平滑肌收縮和舒張功能異常是多種心血管疾病的重要病理變化，如：高血壓、糖尿病以及動脈粥樣硬化等。Ca2+是平滑肌細胞內的重要的第二信使，在平滑肌收縮和舒張中扮演著重要角色，其發生調節紊亂可導致平滑肌舒縮功能異常[1]。正常血管平滑肌細胞內Ca2+濃度的調節依賴兩種方式：① 細胞內外Ca2+的交換；② 細胞內鈣庫的調節。通常，在細胞膜控制細胞內外Ca2+交換主要有3種通道：① 電壓操縱性鈣通道，如：L-型鈣通道；② 鈣庫操縱性鈣通道(Store-operated calcium channels，SOCC)；③ 受體操縱的鈣通道。其中，近年確定了SOCC分子基礎為: STIM1(stromal interacting molecules)和Orai1蛋白。STIM1是內質網鈣庫耗竭誘導外鈣內流的感受器，能夠感受內質網內Ca2+濃度變化；Orai1是形成SOCC通道孔的跨膜蛋白。其激活機制為：當內質網鈣庫耗竭后，STIM1感受信號，在內質網上進行重新分配，聚集并遷移到內質網膜和細胞膜結合點上，募集細胞膜上的Orai1，將信號傳遞給Orai1，Orai1發生構象變化，形成功能性鈣庫排空激活的鈣通道，介導細胞外鈣內流[2]。隨后在兩個不同的實驗室同時研究發現，STIM1還同時直接抑制L-型鈣通道電流[3-4]。

SOCC最早是在不可興奮性細胞上，如：免疫細胞、內皮細胞、血小板等[5-6]，主要參與“興奮-轉錄偶聯”過程，激活多種轉錄因子，包括：血清反應因子、活化T細胞核因子和環磷酸腺苷反應元件結合蛋白。近年越來越多的研究表明，在興奮性細胞上如：神經細胞、心肌細胞、平滑肌細胞等，也存在SOCC[7-8]。然而，在血管平滑肌上，SOCC的器官分布和功能表達等，是否參與平滑肌細胞收縮過程，即“興奮-收縮偶聯”，都有待進一步闡明。因此，本研究借助平滑肌特異性STIM1敲除小鼠，探索STIM1介導的SOC在主動脈平滑肌收縮功能調控中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物C57BL/6(sm-STIM1-WT)和平滑肌STIM1敲除(sm-STIM1-KO)8周齡雄性小鼠，SPF級，各20只，購于江蘇集萃藥康生物科技有限公司，許可證號：SCXK(蘇)2018-0008，在華南理工大學實驗動物中心喂養至20周備用。本研究所有動物實驗已通過廣東省人民醫院(廣東省醫學科學院)的動物實驗倫理審查(No.GDRE201208a)。

1.2 試劑與儀器苯腎上腺素(phenylephrine，Phe，039K1453) 、5-羥色胺 (serotonin，5-HT，091M5163V) 、U46619(血栓素TXA2類似物)、二甲基亞砜(DMSO，015K0151)、硝苯地平(57H1139)、乙酰膽堿(Ach，115K0706)、毒胡蘿卜素 (thapsigargin，TG，049M4032V)、咖啡因(caffeine，71K1877)、EGTA(111K5411)均購于Sigma公司；其余試劑均為國產分析純。610M 型多通道血管張力測定儀(DMT公司，丹麥)；Power Lab 8/30生物信號采集處理系統(AD公司，澳大利亞)；XTL250型體式顯微鏡；DK-8D型電熱恒溫水槽(上海醫用恒溫設備廠)；蛋白電泳儀、轉膜儀(北京市六一儀器廠)；抗GAPDH鼠多克隆抗體(Proteintech公司)；抗STIM1兔多克隆抗體(Proteintech公司)。

1.3 實驗溶液Krebs Henseleit(K-H)溶液(mmol·L-1)：NaCl 119、NaHCO325、MgCl2·6H2O 1、KCl 4.7、KH2PO41.2、CaCl22.5、D-glucose 11.1；高鉀K-H溶液(mmol·L-1)：KCl 60、NaCl 63.7、NaHCO325、MgCl2·6H2O 1、KH2PO41.2、CaCl22.5、D-glucose 11.1。無鈣 K-H溶液(mmol·L-1)：NaCl 119、NaHCO325、MgCl2·6H2O 1、KCl 4.7、KH2PO41.2、D-glucose 11.1、EGTA 0.05。實驗所用溶液配好后均通混合氣(95% O2+5% CO2)充分飽和。

1.4 平滑肌STIM1敲除鼠的制備采用Cre-lox重組技術制備平滑肌特異性STIM1敲除小鼠，利用平滑肌特異性SM22α-CreKI+小鼠與STIMfl/fl小鼠雜交，導致平滑肌細胞中的STIM1的外顯子2特異性完全缺失，構建sm-STIM1-KO小鼠。SM-22α-CreKI+/-/STIMWT(sm-STIM-WT) 作為對照組。觀察sm-STIM1-WT和sm-STIM1-KO小鼠外觀形態變化。提取小鼠主動脈組織蛋白，Western blot技術檢測STIM1表達變化，驗證STIM1敲除鼠制備成功。

1.5 小鼠離體主動脈環制備血管環制備方法同以前發表文獻處理[9-10]。采用頸椎脫臼方法處死小鼠，迅速取出主動脈，并置于4 ℃ K-H溶液中。在體式顯微鏡下去除多余的脂肪和結締組織，并剪成2.0 mm的血管環，機械法去除內皮。顯微鏡下將血管環直接固定于血管張力測定儀浴槽內的兩個鉗夾上，平衡30 min，調節基礎張力至3 mN，每隔15 min 換液1次，并使張力維持在3 mN，平衡60 min后開始加入藥物進行實驗，計算機程序控制下完成記錄。浴槽內的溶液在實驗過程中溫度一直保持穩定在(37±0.5)℃，且持續通入95% O2和5% CO2混合氣體。

1.6 實驗藥物對離體小鼠主動脈血管環張力變化的影響血管功能性及內皮完整性檢測同以前發表文獻處理[9-10]。對于血管功能性檢測合格且去內皮完全的血管，平衡完成后，用1 μmol·L-1Phe誘導血管收縮，達到收縮平衡后，用無鈣K-H溶液洗脫4次，隨后用2 μmol·L-1毒胡蘿卜素(TG，肌漿網鈣泵抑制劑)和1 μmol·L-1硝苯地平(Nifedipine, L-型鈣通道阻斷劑)孵育30 min，加入2.5 mmol·L-1CaCl2，觀察sm-STIM1-WT和sm-STIM1-KO小鼠主動脈血管收縮反應性差異。

采用累積濃度給藥方法，觀察Phe(0.001-10 μmol·L-1)、5-HT(0.001-10 μmol·L-1)和U46619 (0.000 1-1 μmol·L-1)誘導的兩組小鼠主動脈環收縮反應差別。當收縮反應達到最大值，用K-H液洗脫4次，并給予1 μmol·L-1硝苯地平孵育30 min，重復以上Phe和5-HT累積濃度給藥，觀察硝苯地平對兩組血管收縮的影響；隨后用無鈣K-H液洗脫4次，給予1 μmol·L-1硝苯地平孵育30 min，重復Phe和5-HT累積濃度給藥，進一步觀察在硝苯地平孵育下，無鈣K-H液中兩組血管收縮的變化。

用高鉀溶液刺激血管，待達到最大收縮反應不再變化后，加入1 μmol·L-1硝苯地平孵育30 min。加入1 μmol·L-1Phe，收縮穩定后用高鉀洗脫4次，再加入30 μmol·L-1SKF96365孵育30 min，再次加入1 μmol·L-1Phe刺激血管，比較Phe誘導sm-STIM1-WT和sm-STIM1-KO小鼠主動脈血管環收縮差異。血管平衡完成后，直接向浴槽中依次加入5 mmol·L-1、10 mmol·L-1和20 mmol·L-1無鈣K-H溶液配制的咖啡因，統計咖啡因誘導的血管收縮峰值、達峰時間和下降的時間常數(τ)。

2 結果

2.1 平滑肌STIM1敲除鼠制備成功sm-STIM1-KO和sm-STIM1-WT小鼠，以及C57BL/6小鼠之間的外觀形態無明顯差異。Western blot結果顯示，sm-STIM1-KO小鼠主動脈STIM1蛋白的表達水平基本消失，提示平滑肌STIM1敲除鼠制備成功，見Fig 1。

2.2 sm-STIM1-KO小鼠主動脈SOC鈣通道介導的血管收縮變化Phe引起sm-STIM1-KO和sm-STIM1-WT小鼠血管收縮，用無鈣K-H洗脫，硝苯地平和 TG孵育30 min后，在sm-STIM1-KO小鼠中發現CaCl2引起的血管收縮消失。提示STIM1參與小鼠主動脈SOCC介導的血管收縮，見Fig 2。

2.3 sm-STIM1-KO小鼠主動脈對血管收縮劑Phe、5-HT和U46619的反應性變化Phe誘導小鼠主動脈呈濃度依賴性收縮；和野生型小鼠相比，sm-STIM1-KO小鼠對Phe的收縮反應沒有變化，收縮量效曲線pD2和Emax均沒有明顯差異。經L-型鈣通道阻滯劑硝苯地平孵育后，兩組小鼠血管收縮均被抑制，且sm-STIM1-KO小鼠血管收縮顯著低于野生型小鼠(Emax：32.23±3.69vs3.38±2.48；pD2：6.95±0.16vs7.05±0.40，n=4-11；P<0.01)。在硝苯地平孵育的無鈣K-H溶液中，sm-STIM1-KO小鼠幾乎未引起血管收縮(Emax：19.90±5.64vs1.34±0.37；pD2：7.04±0.49vs6.12±0.42，n=6-11；P<0.01)，提示肌漿網鈣釋放介導的血管收縮受損，見Fig 3。

Fig 1 Generation of smooth muscle-targeted STIM1-KO miceA:Scheme of cre-lox technology of smooth muscle-targeted STIM1-knockout. B:Appearance of sm-STIM1-WT mice,sm-STIM1-KO mice,and C57/B6 at 20 weeks of age. C:The protein expression levels of STIM1 in aorta tissues from SM-STIM1-WT and SM-STIM1-KO mice.

5-HT引起小鼠主動脈呈濃度依賴性收縮；sm-STIM1-KO小鼠對5-HT的反應較野生型小鼠沒有顯著性變化；硝苯地平孵育后，血管收縮明顯降低，且sm-STIM1-KO小鼠血管收縮低于野生型小鼠(Emax：63.95±13.05vs13.75±9.16；pD2：6.59±0.08vs6.76±0.75，n=4-8；P<0.01)；在硝苯地平孵育的無鈣K-H溶液中，sm-STIM1-KO小鼠血管收縮低于野生型小鼠(Emax：29.31± 7.96vs6.00±3.49；pD2：6.64±0.15vs6.56±0.27，n=6-11；P<0.01)，見Fig 4。

Fig 2 Alteration in vasoconstriction of sm-STIM1-KO mouse aortic rings mediated by SOCCA:Representative traces showing vasoconstriction of mouse aortic rings mediated by SOCC. B:A summary graph of Ca2+-induced contraction mediated by SOCC. Results are expressed as sm-STIM1-KO:n=4; **P<0.01 vs sm-STIM1-KO group.

Fig 3 Response of aorta to Phe in sm-STIM1-KO miceA,C:Representative traces of Phe-induced concentration-dependent contraction in aortic rings in the presence or absence of nifedipine (1 μmol·L-1). B,D:Concentration-response curves were constructed. Results are expressed as sm-STIM1-KO:n=4-14; **P<0.01 vs sm-STIM1-WT+nifedipine group,##P<0.01 vs sm-STIM1-WT+nifedipine+Ca2+-free K-H group.

U46619引起小鼠主動脈呈濃度依賴性收縮；sm-STIM1-KO小鼠和野生型小鼠對U46619的反應差異無統計學意義；在有鈣和無鈣的K-H溶液中，經硝苯地平孵育后，兩組血管收縮均被抑制，sm-STIM1-KO小鼠血管收縮低于野生型小鼠(在有鈣的K-H溶液中，Emax：149.60±13.31vs54.02±4.97；pD2：7.95±0.07vs7.36±0.27，n=10-12；P<0.01。在無鈣K-H溶液中，Emax：84.18±21.39vs38.63±14.05；pD2：7.49±0.15vs7.18±0.50，n=10-12；P<0.01)，見Fig 5。

2.4 STIM1參與非L-型鈣通道介導主動脈收縮反應性變化高鉀溶液引起小鼠主動脈持續收縮；硝苯地平完全阻斷了高鉀溶液引起的血管收縮，加入血管收縮劑Phe，sm-STIM1-WT小鼠主動脈持續收縮，而sm-STIM1-KO小鼠迅速收縮(快相)隨后下降至平穩收縮(慢相)。統計兩相血管收縮值發現，sm-STIM1-KO快相收縮峰值降低但差異無有統計學意義，慢相收縮低于sm-STIM1-WT小鼠(31.60±3.42vs3.38±1.86，n=5-8；P<0.01)。兩組血管收縮均被SOCC非特異性抑制劑SKF96365抑制，見Fig 6。

Fig 4 Response of aorta to 5-HT in sm-STIM1-KO miceA,C:Representative traces of 5-HT-induced concentration-dependent contraction in aortic rings in the presence or absence of nifedipine (1 μmol·L-1). B,D:Concentration-response curves were constructed. Results are expressed as sm-STIM1-KO:n=4-12; **P<0.01 vs sm-STIM1-WT+nifedipine group,##P<0.01 vs sm-STIM1-WT+nifedipine+Ca2+-free K-H group.

Fig 5 Response of aorta to U46619 in sm-STIM1-KO miceA,C:Representative traces of U46619-induced concentration-dependent contraction in aortic rings in the presence or absence of nifedipine (1 μmol·L-1). B,D:Concentration-response curves were constructed. Results are expressed as x±s,sm-STIM1-WT:n=9-12; sm-STIM1-KO:n=10-14; **P<0.01 vs sm-STIM1-WT+nifedipine group,##P<0.01 vs sm-STIM1-WT+nifedipine+Ca2+-free K-H group.

Fig 6 STIM1 involved in non-L-type calcium channel-mediated vasoconstrictionA:Representative trace of vasoconstriction in mouse aorta with different Ca2+ channel blockers treatment. B:A summary graph of the maximal response to Phe (fast phase) in a 60 mmol·L-1 KCl,nifedipine (1 μmol·L-1) solution. C:A summary graph of slow phase of constant vasoconstriction in a 60 mmol·L-1 KCl,nifedipine (1 μmol·L-1) solution. Results are expressed as sm-STIM1-KO:n=8; **P<0.01 vs sm-STIM1-WT.

Fig 7 Response of aorta to caffeine in sm-STIM1-KO miceA:Representative trace of vasoconstriction induced by caffeine of different concentrations in mouse aorta. B:A summary graph of caffeine-evoked contraction. C:A summary graph of time reaching Emax of vasoconstriction. D:τ of vasoconstriction in sm-STIM1-WT and sm-STIM1-KO mice. Results are expressed as sm-STIM1-KO:n=9; *P<0.05 vs sm-STIM1-WT.

2.5 sm-STIM1-KO小鼠主動脈對咖啡因的反應性變化咖啡因引起血管迅速收縮，隨著咖啡因濃度增加，其誘導的收縮增加，最大收縮值統計結果顯示，各濃度咖啡因誘導的最大收縮值在sm-STIM1-WT和sm-STIM1-KO小鼠主動脈反應中沒有差異；但兩組達峰時間結果顯示，10 mmol·L-1和20 mmol·L-1咖啡因誘導的血管收縮達峰時間在sm-STIM1-KO小鼠主動脈中均快于sm-STIM1-WT小鼠。同時，sm-STIM1-KO小鼠主動脈收縮下降速度也明顯快于sm-STIM1-WT小鼠，見Fig 7。

3 討論

本研究我們成功地建立平滑肌特異性STIM1敲除小鼠模型，結果發現STIM1敲除小鼠鈣庫操縱性鈣通道介導的收縮完全消失，但是，不同收縮劑(Phe、5-HT和U46619)誘導STIM1敲除小鼠主動脈平滑肌總的收縮無明顯變化，進一步研究，發現STIM1敲除對非電壓依賴性鈣通道和肌漿網鈣釋放誘導的收縮有明顯抑制作用。

Ca2+是平滑肌細胞內的重要的第二信使，在平滑肌收縮中扮演著重要角色。血管收縮主要受細胞內Ca2+濃度變化影響，細胞內Ca2+濃度增加時，Ca2+與鈣調蛋白結合，激活肌球蛋白輕鏈激酶，使肌球蛋白輕鏈磷酸化引起平滑肌收縮。Phe、5-HT和U46619通過分別結合平滑肌細胞膜上的α1受體、5-HT2A受體和TXA2受體，偶聯G蛋白信號通路引起血管收縮。一方面直接激活L-型鈣通道開放，引起細胞外鈣離子內流；另一方面激活磷脂C (PLC)，使磷脂酰肌醇二膦酸( PIP2)水解為三磷酸肌醇(IP3) 和二脂酰甘油( DAG)。DAG可激活蛋白激酶C( PKC)，增加血管平滑肌對鈣離子敏感性；IP3則與肌漿網膜上IP3受體結合，誘導肌漿網內Ca2+釋放，引起血管收縮，當肌漿網內鈣庫耗竭，SOCC通道打開，細胞外Ca2+流入[12]。目前研究證據表明，在血管平滑肌細胞中存在SOCC，也已確定Orai1和STIM1是其兩個關鍵的組成成分。較多的證據表明[13-14]，在高血壓和血管損傷再狹窄中發現STIM1和Orai1表達明顯上調，SOCC鈣信號增強，Calcineurin(CaN)/ NFAT通路活化，在參與平滑肌細胞增殖和遷移等功能中發揮著重要作用。但是，SOCC在平滑肌細胞是否參與收縮功能，在不同的器官和疾病模型上仍存在爭議。

Yang等[15]研究發現，老年大鼠腸系膜小動脈SOCC介導的收縮增強，SOCC相關蛋白表達增加，其介導的血管平滑肌細胞鈣內流明顯增強，主動脈上SOCC的表達變化則相反。Giachini等[13]研究發現，在自發性高血壓大鼠主動脈血管平滑肌上 STIM1 蛋白表達明顯增加，TG誘導的SOCC介導的收縮反應也明顯增加；當用 STIM1 蛋白抗體阻斷后，其收縮反應恢復正常，提示SOCC介導的鈣內流增加，參與誘發高血壓血管收縮高反應。另外研究顯示，在冠狀動脈SOCC介導的血管收縮并不明顯[16]。本研究我們建立平滑肌特異性敲除STIM1小鼠模型，通過蛋白檢測，證明平滑肌特異性STIM1敲除成功，同時也提示，STIM1介導SOCC參與主動脈收縮反應，與之前的研究一致。同時，在平滑肌特異性敲除STIM1小鼠主動脈上，發現Phe、5-HT和U46619誘導的收縮量效曲線pEC50和Emax均沒有明顯變化；但是在L-型鈣通道阻斷劑Nifedipine存在情況下，非電壓依賴性鈣通道介導的收縮明顯減少；其次，在無鈣條件下，激動劑誘導的收縮也是明顯降低的。

為進一步探究鈣調控在平滑肌特異性STIM1敲除主動脈血管收縮變化中的機制，用高鉀溶液(60 mmol·L-1KCl)刺激血管，引起血管收縮，提示L-型鈣通道參與血管收縮。高鉀溶液使細胞膜去極化，進而激活與膜電位有關的L-型鈣通道，引起細胞內Ca2+濃度增加；我們進一步探討了平滑肌特異性STIM1敲除對非L-型鈣通道介導的主動脈收縮的變化。在高鉀溶液引起血管最大收縮后，加入硝苯地平完全阻斷了高鉀溶液引起的血管收縮，隨后加入Phe仍可引起血管收縮，此時血管收縮主要由非L-型鈣通道介導，Phe引起的血管收縮明顯降低，對快相的收縮沒有明顯影響，但是，對持續相有明顯的抑制作用，進一步提示SOCC參與血管收縮。

最后，探討了平滑肌特異性STIM1敲除對小鼠主動脈肌漿網鈣釋放的影響。咖啡因誘導平滑肌收縮主要由細胞肌漿網內釋放的Ca2+介導，結果表明其收縮幅度變化不明顯，但上升速度和下降的速度均加快，提示，STIM1敲除后平滑肌細胞肌漿網鈣釋放和回收功能均受到影響，導致鈣調控異常。

綜上所述，本實驗通過對離體平滑肌特異性STIM1敲除小鼠主動脈張力的測定，發現L-型鈣通道、肌漿網鈣釋放和SOCC均參與小鼠主動脈平滑肌收縮，STIM1參與SOCC和肌漿網鈣釋放介導的血管收縮，這一發現為血管病變的治療提供新的靶點。另外，可能主動脈存在代償機制，當STIM1介導的SOCC依賴性收縮較少時，L-型鈣通道依賴的收縮信號通路進行代償，維持血管穩態和功能。但本實驗僅對離體小鼠主動脈血管收縮張力進行了分析，下一步將在細胞和分子水平上，以及其它器官血管和疾病模型上，進一步探討STIM1參與平滑肌細胞鈣調控的病理生理機制。