大黃對(duì)MCAO模型大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用

孫春曉，黃嘉慧，譙 麗，劉俊杰，唐宇恒，許阿娟，聶婧雯，黃私迎，羅 銳，楊澤霖，賴(lài)文芳，洪桂祝

(福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122)

缺血性腦卒中是醫(yī)學(xué)史上未解的難題之一，致病機(jī)理主要是由于腦動(dòng)脈血管栓塞進(jìn)而誘發(fā)炎癥反應(yīng)的級(jí)聯(lián)過(guò)程[1]。大腦中動(dòng)脈閉塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型是對(duì)臨床上常見(jiàn)的缺血性腦卒中疾病的模擬，它具有較低的侵入性，同時(shí)也是最接近人類(lèi)缺血性中風(fēng)的一種技術(shù)[2]。

大黃在我國(guó)擁有悠久的藥用歷史，根據(jù)2015版藥典描述，大黃是蓼科植物掌葉大黃、唐古特大黃或藥用大黃的干燥根和根莖，通常用于清熱瀉火、涼血解毒等作用，同時(shí)，藥典中收錄的大黃蟄蟲(chóng)丸、逐瘀通脈膠囊以及麝香腦脈康膠囊等諸多制劑也顯示著大黃在治療腦中風(fēng)方面有著獨(dú)特的作用[3]。有學(xué)者認(rèn)為，大黃作為瀉火、涼血熱藥，具有抗炎、抗毛細(xì)血管凝血和止血的作用，具有直接作用于腦部的可能性[4]。此外，大黃素、大黃酚作為其主要活性成分，也是大黃藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的重要標(biāo)志物之一。Ye等[5]指出，不同劑量的大黃素連續(xù)作用于SD大鼠13周，無(wú)明顯毒性。課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)大黃素可明顯抑制腦中風(fēng)的炎性損傷[6]，趙薇等[7]指出大黃酚可以調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng)，抑制細(xì)胞凋亡起到神經(jīng)保護(hù)作用。而關(guān)于大黃提取物對(duì)腦損傷的研究目前較少，本文主要通過(guò)研究大黃提取物對(duì)MCAO大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用，并進(jìn)一步探討其作用機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)(Sprague Dawley(SD)大鼠，♂，體質(zhì)量(260-280)g，購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[合格證號(hào)：2015000510392，許可證號(hào)：SCXK(滬)2012-0002]，并于福建中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心喂養(yǎng)[許可證號(hào)：SYXK(閩)2014-0005]。

1.2 藥物與試劑大黃，經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定學(xué)教研室鑒定。DAPI染色液(貨號(hào)：C1006)，抗熒光淬滅封片液(貨號(hào)：P0126)均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；PBS磷酸鹽緩沖液粉末(貨號(hào)：17032701)，檸檬酸鹽緩沖液粉末(貨號(hào)：17021404)均購(gòu)自邁新生物技術(shù)有限公司；尼氏染色液(北京雷根生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：DK0022)；NeuN 抗體 (貨號(hào):ab104224)；BDNF 抗體 (貨號(hào)：ab205067)均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；NGF抗體(sc-365944)均購(gòu)自Santa Cruz公司； cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Thermo公司，貨號(hào)：K1622)；兔抗(貨號(hào)：31460)，鼠抗(貨號(hào)：31430)均購(gòu)自Thermo Scientific公司；β-action抗體(貨號(hào)AF0003)購(gòu)自碧云天生物科技有限公司。

1.3 儀器基礎(chǔ)電泳儀電源(美國(guó)Bio-Rad公司)；小型轉(zhuǎn)印槽(美國(guó)Bio-Rad公司)；倒置熒光顯微鏡(德國(guó)Leica公司，型號(hào)：DMI8)；凝膠成像分析系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司，型號(hào)：ChemiDocXRS+)；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(Thermo Fisher公司，型號(hào)：ND2000C)；普通PCR儀(美國(guó)Bio-Rad公司，型號(hào)：C1000)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)Applied Biosystems公司，型號(hào)：7900H-PCR)；石蠟切片機(jī)(Thermo Fisher公司，型號(hào)：HM325)；生物組織石蠟包埋機(jī)(Thermo Fisher公司，型號(hào)：YB-6LF)；3600AAA，3800AAA尼龍線(xiàn)栓(廣州佳靈生物技術(shù)有限公司)。

2 方法

2.1 大黃提取物制備稱(chēng)取大黃干燥根莖200 g，粉碎后裝入500 mL圓底燒瓶，采用250 mL 95%乙醇加熱回流提取2 h，取2次上層提取液合并減壓濃縮揮干即得相應(yīng)的粉末(1 g相當(dāng)于生藥含量10 g)[8]。使用含有質(zhì)量濃度為10 g·L-1的羧甲基纖維素鈉的生理鹽水溶解粉末使成30 g·L-1懸濁液備用[9]。

2.2 動(dòng)物分組與處理健康成年♂實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為假手術(shù)組(sham)、模型組(MCAO)、大黃給藥組(MCAO+大黃)，每組15只。經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周以后，2%的戊巴比妥鈉(2 mL·kg-1)腹腔注射麻醉后，采用線(xiàn)栓法制備模型，沿大鼠頸線(xiàn)中部切開(kāi)，分離出頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈，將頸總動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈用醫(yī)院縫合線(xiàn)結(jié)扎，用動(dòng)脈夾夾住頸內(nèi)動(dòng)脈，用動(dòng)脈剪在頸總動(dòng)脈遠(yuǎn)心端剪一個(gè)V形切口，將線(xiàn)栓自頸總動(dòng)脈切口處插入頸內(nèi)動(dòng)脈，至大腦中動(dòng)脈起始端，用縫合線(xiàn)縫合切口。2 h后拔出線(xiàn)栓實(shí)現(xiàn)再灌注。假手術(shù)組做相同處理除不插線(xiàn)栓。大鼠清醒后進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，評(píng)分在2-3分視為造模成功[14]。大黃給藥組灌服大黃提取物溶液200 mg·kg-1·d-1，其余組則灌服等體積生理鹽水。連續(xù)給藥6 d后取材。

2.3 取材及前處理給藥治療6 d后，2 %的戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，每組7只動(dòng)物腹主動(dòng)脈取血后于心尖上剪一小缺口，將灌胃針自缺口插入動(dòng)脈，在右心耳剪一缺口，滴注生理鹽水至右心耳流出無(wú)色液體滴注甲醛至大鼠腦僵硬，取腦于4 %多聚甲醛中室溫固定24 h后，使用專(zhuān)門(mén)的腦模具和切片刀將腦組織平均分為6片，保存于70 %的乙醇中，待后續(xù)進(jìn)行免疫熒光實(shí)驗(yàn)。每組7只動(dòng)物腹主動(dòng)脈取血后斷頭取腦，將大腦分左右腦，分裝于液氮中保存?zhèn)溆谩Ｈ∽竽X腦組織磨成粉末，分裝待用。

2.4 尼氏染色法檢測(cè)尼氏體的表達(dá)將保存的腦組織脫水、包埋，即可獲得組織蠟塊。將組織蠟塊以3 μm厚度切片，平整攤在40 ℃蒸餾水中，待組織片無(wú)褶皺后用載玻片撈片，55 ℃烤片，待無(wú)水分時(shí)移至60 ℃暗箱內(nèi)6 h待用。取用準(zhǔn)備好的組織片經(jīng)過(guò)脫蠟復(fù)水，在56 ℃溫箱內(nèi)，于含有焦油紫的染缸中浸染30 min，之后在酒精燈上加溫至切片冒泡約10 min，用去離子水洗去染液后用尼氏分化液分化1-3 min，之后使用無(wú)水乙醇脫水，經(jīng)二甲苯透明，晾干后用中性樹(shù)脂封片，在鏡下觀察結(jié)果并拍照留存，使用圖像分析軟件Motic Med 6.0測(cè)定腦梗死體積。

2.5 免疫熒光法檢測(cè)腦組織中NeuN、NF200的表達(dá)將保存好的組織片脫蠟復(fù)水，在檸檬酸緩沖液中抗原修復(fù)，待自然冷卻到室溫后，用5 %BSA室溫封閉2 h后，稀釋的一抗4 ℃孵育過(guò)夜，次日取出組織片待復(fù)溫40 min后，用PBS洗3次，每次10 min，二抗室溫孵育2 h后(之后避光操作)，PBS洗3次，每次10 min，之后DAPI染核8 min，再次使用PBS洗3次，每次10 min，最后滴加抗淬滅劑后封片，結(jié)果使用熒光倒置顯微鏡觀察。

2.6 RT-qPCR法檢測(cè)Egr1、Egr2、Egr4 mRNA的表達(dá)取30 mg組織采用TRIzol提取總RNA，-80 ℃保存待用。根據(jù)cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，放于-80 ℃保存待用。使用RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)Egr1、Egr2、Egr4 mRNA的表達(dá)的表達(dá)水平。GADPH的上游引物：5′-ACGGCAAGTTCAACGGCACAG-3′，下游引物：5′-GAAGACGCCAGTAGACTVVACGAC-3′；Egr1的上游引物：5′-AAAATGGAATCTCTACGAAGGTCA-3′，下游引物：5′-AGTCGCAGGTCAATGAAGAAGTC-3′；Egr2的上游引物：5′-ACCAGGAGAATCCATACCAGAACC-3′，下游引物：5′-AGGAGGACACGATAGACAGACAAAG-3′；Egr4的上游引物：5′-AAGCTGGAGCAGGAAGAGGTTG-3′，下游引物：5′-GCAGGGAGGAGGTTTTGGATAG-3′，RT-qPCR所用引物由尚亞生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成。以GAPDH為內(nèi)參校正每個(gè)樣品的Ct值，計(jì)算2-ΔΔCt值從而對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行定量分析。

2.7 Western blot檢測(cè)NGF、BDNF蛋白的表達(dá)取100 mg組織提取總蛋白，根據(jù)SDS-PAGE凝膠電泳配置說(shuō)明書(shū)選擇合適濃度配比的分離膠。電泳，轉(zhuǎn)膜，將目標(biāo)蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)膜上，5 % BSA室溫封閉2 h，稀釋的一抗4 ℃搖床孵育過(guò)夜，Tris-HCI Buffer Solution Tween (TBST)洗3次，每次10 min，稀釋的二抗室溫?fù)u床孵育2 h，TBST洗3次，每次10 min，之后使用凝膠成像分析系統(tǒng)Image Lab 6.0成像并檢測(cè)分析目標(biāo)條帶灰度值，計(jì)算條帶與β-actin灰度值的比值并統(tǒng)計(jì)分析各組差異。

3 結(jié)果

3.1 大黃提取物對(duì)MCAO模型大鼠的缺血側(cè)腦梗死體積的影響MCAO模型大鼠再灌注1 h后，經(jīng)大黃提取物連續(xù)給藥6 d，尼氏染色結(jié)果顯示，與sham組相比，MCAO模型大鼠梗死冠狀切面梗死面積及梗死體積升高，經(jīng)大黃提取物作用后，MCAO模型大鼠腦梗死體積被明顯改善(P<0.05)，見(jiàn)Fig 1。

Fig 1 Effect of rhubarb extract on ischemic lateral cerebral infarction volume in MCAO model **P<0.10 vs Sham

3.2 大黃提取物對(duì)MCAO模型大鼠的缺血側(cè)神經(jīng)生長(zhǎng)因子NeuN表達(dá)的影響MCAO模型大鼠再灌注1 h后，經(jīng)大黃提取物連續(xù)給藥6 d，免疫熒光結(jié)果顯示，與sham組相比，MCAO模型大鼠NeuN的數(shù)目減少，經(jīng)大黃提取物作用以后，NeuN的數(shù)目增多，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)Fig 2。

Fig 2 Effect of rhubarb extract on expression of nerve growth factor NeuN in ischemic side of MCAO #P<0.01 vs sham

3.3 大黃提取物對(duì)MCAO模型大鼠的缺血側(cè)腦組織NF200表達(dá)的影響MCAO模型大鼠再灌注1 h后，經(jīng)大黃提取物連續(xù)給藥6 d，免疫熒光結(jié)果顯示，與sham組相比，MCAO模型大鼠NF200的數(shù)目降低，經(jīng)大黃提取物作用以后，NF200的數(shù)目增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)Fig 3。

3.4 大黃提取物對(duì)MCAO模型大鼠缺血側(cè)腦組織Egr1，Egr2，Egr4 mRNAMCAO模型大鼠再灌注1 h后，經(jīng)大黃提取物連續(xù)給藥6 d，RT-qPCR的結(jié)果顯示，與sham組相比，MCAO模型大鼠Egr1、Egr2、Egr4 mRNA表達(dá)降低，經(jīng)大黃提取物作用以后，Egr1、Egr2、Egr4 mRNA表達(dá)升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)Fig 4。

3.5 大黃提取物對(duì)MCAO模型大鼠缺血側(cè)腦組織NGF、BDNF蛋白表達(dá)的影響MCAO模型大鼠再灌注1 h后，連續(xù)給藥6 d，Western blot結(jié)果顯示，與sham組相比，MCAO模型大鼠NGF、BDNF蛋白表達(dá)量降低，經(jīng)大黃提取物作用后，該作用被逆轉(zhuǎn)且差異具有顯著性(P<0.05)，見(jiàn)Fig 5。

Fig 3 Effect of rhubarb extract on expression of NF200 on ischemic brain tissue of MCAO model rats(×400) **P<0.01 vs sham

Fig 4 Effects of rhubarb extract on expression of Egr1,Egr2 and Egr4 mRNA in ischemic brain tissue #P<0.01 vs sham

Fig 5 Effect of rhubarb extract on expression of NGF(A) and (B) BDNF protein in ischemic brain tissue of MCAO model #P<0.01 vs sham

4 討論

本實(shí)驗(yàn)中使用線(xiàn)栓法制造模型，線(xiàn)栓法造模具有操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性好、可控制缺血/再灌注時(shí)間、損傷小等優(yōu)點(diǎn)[10]。造模成功后的實(shí)驗(yàn)大鼠表現(xiàn)出行走時(shí)向病灶對(duì)側(cè)跌倒或原地轉(zhuǎn)圈，甚至不能自發(fā)行走，意識(shí)功能障礙，經(jīng)大黃提取物連續(xù)給藥6 d，發(fā)現(xiàn)與MCAO模型組相比，大黃給藥組能明顯改善MCAO模型大鼠神經(jīng)功能障礙損傷。同時(shí)我們采用尼氏染色檢測(cè)大鼠腦梗死體積發(fā)現(xiàn)，MCAO模型大鼠的腦梗死體積明顯增加，而經(jīng)大黃提取物連續(xù)治療6 d后腦梗死體積明顯改善。

神經(jīng)核蛋白(neuronal nuclear protein，NeuN)是有絲分裂后和新生的成熟神經(jīng)元的標(biāo)志物，可以在大多數(shù)神經(jīng)元中檢測(cè)到。大量研究表明其在腦缺血/再灌注損傷后表達(dá)量明顯下降[11]。免疫熒光結(jié)果顯示，經(jīng)大黃提取物治療以后可以增加缺血側(cè)腦組織NeuN的表達(dá)，表明大黃提取物對(duì)于MCAO模型大鼠的神經(jīng)元損傷具有抑制作用。為了進(jìn)一步證明大黃提取物對(duì)于MCAO模型大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用，我們檢測(cè)了MCAO模型大鼠缺血側(cè)腦組織區(qū)域成熟神經(jīng)細(xì)胞表型標(biāo)記物高分子量神經(jīng)絲蛋白200(neurofilament 200，NF200)的表達(dá)。NF200主要存在于神經(jīng)元細(xì)胞質(zhì)及軸突中，具有髓鞘軸突并對(duì)機(jī)械刺激作出反應(yīng)，神經(jīng)元細(xì)胞的數(shù)量及其功能狀態(tài)被它的表達(dá)量的高低所反映[12]。結(jié)果顯示，MCAO模型后，大鼠神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)NF200表達(dá)量減少，大黃提取物連續(xù)作用6 d后，該作用被逆轉(zhuǎn)，表明大黃提取物可以保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞。

早期生長(zhǎng)反應(yīng)蛋白( early growth responses，Egrs)是鋅指轉(zhuǎn)錄因子家族，包括Egr1、Egr2和Egr4，它們共享幾乎相同的鋅指DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并結(jié)合到一個(gè)共同的Egr反應(yīng)元件共有序列[13-14]。文獻(xiàn)報(bào)道，Egr1、Egr2和Egr4與神經(jīng)元存活密切相關(guān)[15]。同時(shí)神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor，NGF)和腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)對(duì)神經(jīng)的發(fā)生和可塑性也具有重要的作用[14]。Wang等[12]發(fā)現(xiàn)胚胎期缺乏NGF會(huì)增加小鼠神經(jīng)節(jié)中神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。Song等[16]表明增加的NGF和BDNF表達(dá)可能有助于在急性腦損傷和中風(fēng)早期觀察到的神經(jīng)炎癥誘導(dǎo)的神經(jīng)保護(hù)作用。根據(jù)RT-qPCR及Western blot結(jié)果分析，我們發(fā)現(xiàn)大黃提取物可以顯著促進(jìn)MCAO大鼠缺血側(cè)腦組織的Egr1、Egr2、Egr4、NGF及BDNF的表達(dá)，促進(jìn)神經(jīng)元的再生。

綜上，大黃提取物可以通過(guò)促進(jìn)Egrs、NGF及BDNF的表達(dá)，促進(jìn)神經(jīng)元的再生，進(jìn)而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，為大黃治療缺血性腦損傷的研究提供新的基礎(chǔ)。