抗生素負載型二硫化鉬-糖基苝酰亞胺自組裝體系構建及抗菌研究

吳 棒， 胡習樂， 陳國榮

（華東理工大學結構可控先進功能材料及其制備教育部重點實驗室，費林加諾貝爾獎科學家聯合研究中心，上海 200237）

細菌耐藥性如今已呈現出愈發多樣化和頑固化的趨勢，這為細菌的臨床治療帶來了大量新的威脅和挑戰[1-3]。近年來，具有抗菌藥物載體性能和功能性抗菌活性的新一代材料實現了光動力/光熱效應協同傳統抗生素的協同抗菌效果[4-6]。光動力治療（Photodynamic Therapy, PDT）中的光敏劑分子與抗生素藥物一樣具有共軛化學結構，能負載在自組裝體系表面，通過特定波長光的敏化作用激活周邊環境中的氧，激活后的高能態氧通常被稱為活性氧簇（Reactive Oxygen Species, ROS），由于其強氧化性和高能態毒性，能有效殺傷細菌。相比于傳統藥物治療方法，PDT 往往不易使細菌產生耐藥性，也大大減少了對宿主組織的損傷[7-9]。然而，單獨使用光敏劑進行PDT 的劣勢在于ROS 半衰期較短，導致ROS易在環境中耗散，因而達不到很好的抗菌效果。出于這一原因，在構建光敏治療載體時常常需要將光敏劑負載在材料體系表面并與少量的抗生素類藥物協同作用[10-11]。功能化的石墨烯納米材料作為藥物載體已經被廣泛地應用[12]，負載小分子的材料能夠控釋或緩釋光敏藥物以及傳統的抗生素藥物，從而使得所有治療分子靶向簇集在患處。

二維片層二硫化鉬（MoS2）是一種具有易制備、易分散、穩定性好、負載載體能力強等優點的材料[13-14]。熒光團苝酰亞胺（Perylenediimide, PDI）是常用的光敏劑，PDI 在光輻射下可顯著產生ROS 從而實現PDT，且該化合物的熒光特性也可進一步被應用于疾病的光學診斷[15-16]。然而，外源性的光敏劑及功能材料往往對于人體組織有強烈的細胞毒性和促炎作用。因此，提升材料的生物相容性十分重要。糖基是能夠顯著改善材料親水性的基團，還是生物體自身具有的不可或缺的生物分子。糖基的引入能降低細胞毒性和提高材料的生物相容性。更為特異的是，糖基同時還能夠作為常見的生物靶向識別基團以此來識別特定凝集素。有些細菌也和細胞同樣，能夠特異性分泌某種凝集素或蛋白而被特定糖所靶向識別[17-18]。例如，半乳糖基能夠特異性結合綠膿桿菌表面凝集素從而識別綠膿桿菌。此外研究還發現，小分子的糖基自身對細菌的識別能力較弱，往往需要聚集起來形成糖簇結構，才能提高糖對細菌的識別效果[19]。

本文探究兩種分別修飾了半乳糖基以及甘露糖基的不同糖型PDI 糖綴合物，通過π-π 堆疊作用，兩種PDI 糖綴合物被負載在片層MoS2上構建了糖簇自組裝體系，以此構建靶向綠膿桿菌的半乳糖光動力抗菌體系，同時甘露糖的體系作為參照被證明無明顯的綠膿桿菌靶向性。二硫化鉬材料表面還能夠進一步負載少量抗生素分子，在PDI 實現靶向光動力抗菌的同時實現協同釋藥。該載藥光動力抗菌自組裝體系的構建，實現了光動力治療協同抗生素的抗菌效果。

1 實驗部分

1.1 實驗材料

綠膿桿菌（ATCC27853）購自北京中原公司，半乳糖基苝酰亞胺化合物（PDI-Gal4）和甘露糖基苝酰亞胺化合物（PDI-Man6）為已知化合物[20]。二硫化鉬粉末（純度99%）購于上海百靈威有限公司。

1.2 主要儀器

超凈工作臺購于無錫凈化設備廠；Centrifuge5415D臺式離心機購于Eppendorf 公司；電子天平購于上海舜宇恒平科學儀器有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器購于上海申安醫療器械廠；恒溫培養箱購于OLYMPUS公司；超低溫冰箱購于SANYO 公司；恒溫搖床購于Forma Scentific 公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 二硫化鉬分散溶液的制備 實驗中使用二硫化鉬的粉末作為原料，通過超聲、凍干等步驟制備得到單層或少層的二硫化鉬材料：向25 mL 的棕色玻璃瓶中加入20 mL 的乙醇和超純水混合溶液（體積比為1∶1），然后加入100 mg 的二硫化鉬粉末，攪拌均勻后放入超聲清洗儀中，冰浴條件下（控制溫度在20 °C左右）超聲12 h（功率為100 Hz），得到混合的懸浮液。使用離心機對懸浮液進行離心12 min，使用移液槍吸取離心后的上層溶液，凍干機凍干過夜，最終得到10 mg 粉末狀的二硫化鉬（產率為10%），將其溶于去離子水中，超聲30 min 得到二硫化鉬分散液。

1.3.2 化合物PDI-Gal4/PDI-Man6與二硫化鉬的自組裝 糖基苝酰亞胺PDI-Gal4/PDI-Man6化合物的結構如圖1 所示。

負載頭孢他啶體系的構建步驟：取1 mL40μmol/L的PDI-Gal4或PDI-Man6與1 mL100μg/mL 的 二 硫化鉬分散溶液分別置入5 mL 的棕色瓶中，放入超聲清洗儀中超聲30 min，得到二硫化鉬與糖基化合物的自組裝體系PDI-Gal4@MoS2或PDI-Man6@MoS2。進一步向自組裝體系中加入256 μg/mL 頭孢他啶（Ceftazidime, CAZ）溶液，攪拌12 h 后，離心除去未負載的藥物，將底部離心物重新溶于緩沖液中，得到負載頭孢他啶的抗菌體系PDI-Gal4@MoS2@CAZ 或PDI-Man6@MoS2@CAZ。采用動態光散射分析（DLS）和紫外-可見光譜分析（UV-Vis）驗證苝酰亞胺分子與二硫化鉬之間是否實現成功自組裝。

1.3.3 細菌培養 將LB（Luria Bertani）固相培養基培養的綠膿桿菌（ATCC27853）單菌落挑出，接種到1 mL LB 液體培養基中，設定搖床溫度為37 °C 并搖晃12 h 過夜待菌液完全渾濁。將菌液用LB 液體培養基稀釋至每毫升106個細胞的濃度。

圖1PDI-Gal4 和PDI-Man6 的結構Fig.1Structures of compound PDI-Gal4 and PDI-Man6

1.3.4 自由基的檢測 糖基PDI 分子中的PDI 母核是有效的光敏劑，在白光的光照下能釋放ROS 以此殺滅細菌。二氫羅丹明123（DHR123）是一種自由基捕獲劑，其本身沒有顯著的熒光，但卻能夠在ROS 存在下被氧化產生熒光性羅丹明分子，從而顯示出熒光，利用這種特性檢測了在梯度時間光照下不同體系溶液中的ROS 釋放，以此驗證不同體系的光敏化作用。

1.3.5 抗菌活性的測試 抗菌活性測試的組別共有：空白組、CAZ 組、PDI-Man6@CAZ 組、PDI-Man6@MoS2@CAZ 組、PDI-Gal4@CAZ 組、PDI-Gal4@MoS2@CAZ組。空白組是在96 孔板的一排8 個孔中加入LB 培養基中的綠膿桿菌菌液（濃度為每毫升菌液有106個細胞，下同）。CAZ 組是在LB 菌液的1 排8 個孔中分別加入質量濃度為128、64、32、16、8、4、2、1 μg/mL 的CAZ，每個實驗重復3 遍。PDI-Man6@CAZ組是在LB 菌液的1 排8 個孔中各自加入20 μmol/L的PDI-Man6和質量濃度分別為128、64、32、16、8、4、2、1 μg/mL 的CAZ，每個實驗重復3 遍。PDI-Man6@MoS2@CAZ 組是在含有LB 菌液的1 排8 個孔中先加入PDI-Man6@MoS2自組裝體系，其中PDI-Man6濃度為20 μmol/L，MoS2質量濃度為50 μg/mL，然后分別加入質量濃度為128、64、32、16、8、4、2、1 μg/mL的CAZ，每個實驗重復3 遍以驗證準確性。對于半乳糖體系的PDI-Gal4@CAZ 組和PDI-Gal4@MoS2@CAZ 組，實驗方法與用量分別與PDI-Man6@CAZ 組和PDI-Man6@MoS2@CAZ 組相同。

材料制備完成后，若需光照則在白光下光照40 min，若不需要光照則置于暗處，之后將孔板置于培養箱中，37 °C 下培養18 h 過夜，最后觀察最小抑菌濃度（Minimum Inhibitory Concentration, MIC）。

圖2片層MoS2 和PDI-Gal4（a）與PDI-Man6（b）自組裝前后的粒徑變化Fig.2Particle size change before and after self-assemblies of MoS2 complex with PDI-Gal4（a）and PDI-Man6（b）

1.3.6 抗菌性能的表征 通過π-π 堆疊作用，分別將PDI-Gal4和PDI-Man6與二硫化鉬片層自組裝構成PDI-Gal4@MoS2和PDI-Man6@MoS2，然后將CAZ 進一步負載到材料表面構成PDI-Gal4@MoS2@CAZ 與PDI-Man6@MoS2@CAZ。利用白光光照條件下基于PDI 母核的抗菌材料體系在載入MoS2前后的自由基釋放性能驗證了材料的光動力殺菌活性。利用PDIGal4@MoS2和PDI-Man6@MoS2對于CAZ 的負載率驗證了材料負載藥物的能力；最后為驗證本文所構建的所有體系的抗菌效果，利用綠膿桿菌標準菌株、單獨的抗生素及自組裝體系作為抗菌對照組，檢驗了白光光照下PDI-Gal4@MoS2@CAZ 及PDI-Man6@MoS2@CAZ 體系的MIC。

2 結果與討論

2.1 糖基苝酰亞胺與二硫化鉬自組裝體系的構建

由DLS 實驗分析可以看出，由于π-π 堆疊作用，PDI-Gal4和PDI-Man6與二硫化鉬自組裝構建為PDIGal4@MoS2和PDI-Man6@MoS2后，相較于單獨的二硫化鉬材料，自組裝后體系的粒徑增大（圖2）。同時在UV-Vis 光譜分析中，化合物PDI-Gal4和PDI-Man6的紫外吸收信號在組裝成為PDI-Gal4@MoS2和PDIMan6@MoS2體系之后，紫外吸收峰分別在594 nm 和596 nm 處發生了4～5 nm 左右的紅移，并伴隨有微小的紫外吸收強度提升（圖3），說明苝酰亞胺糖綴合物與二硫化鉬材料之間通過π-π 堆疊發生了自組裝[21]。

2.2 糖基苝酰亞胺與二硫化鉬自組裝體系的ROS釋放

圖3PDI-Gal4（a）和PDI-Man6（b）與MoS2 組裝前后的紫外-可見吸收光譜變化Fig.3Ultraviolet-visible absorption spectroscopy analysis of MoS2 complex with PDI-Gal4（a）and PDI-Man6（b）

圖4空白PBS（a），PDI-Gal4（b）和PDI-Gal4@MoS2（c）在白光光照下ROS 釋放以及ROS 釋放量與光照時間的線性關系（d）Fig.4ROS release of PBS blank (a), PDI-Gal4 (b), PDI-Gal4 @ MoS2 (c) under white light illumination and linear relationship between ROS release and light time (d)

組裝體系的ROS 釋放的結果如圖4 和圖5 所示。根據梯度光照下的熒光信號變化能夠發現，空白的磷酸鹽緩沖溶液（PBS）不會釋放ROS，而單獨的PDI-Gal4、PDI-Man6以及自組裝后的PDI-Gal4@MoS2和PDI-Man6@MoS2體系則都具有顯著而穩定的光敏化產生ROS 的效應（圖4 和圖5）。值得注意的是，根據熒光譜圖變化對比和定量計算觀察到，當PDI-Gal4和PDI-Man6與片層二硫化鉬自組裝之后，PDI-Gal4@MoS2和PDI-Man6@MoS2的ROS 釋 放 量比起單獨游離的PDI-Gal4和PDI-Man6分子有所提高，表明了二維材料的負載也能夠一定程度提升苝酰亞胺的PDT 釋放ROS 的效果（圖4(d)，圖5(d)）。

2.3 糖基苝酰亞胺與二硫化鉬自組裝體系對于頭孢他啶的負載能力

實驗中CAZ 藥物被載入PDI-Gal4@MoS2和PDIMan6@MoS2體系后，分別測定了其藥物負載能力。未負載藥物總量可以通過測定PDI-Gal4@MoS2和PDI-Man6@MoS2上清液中游離藥物的UV-Vis 吸收值和單體MoS2載藥體系的空白對照計算得到。自組裝體系的載藥率=（藥物總量?未負載藥量）/藥物總量×100%。實驗結果表明，自組裝體系PDI-Gal4@MoS2和PDI-Man6@MoS2具有優良的負載抗生素頭孢他啶的性能（圖6）。

圖5空白PBS 體系（a），PDI-Man6 體系（b）和PDI-Man6@MoS2 體系（c）的白光光照下ROS 釋放以及ROS 釋放量與光照時間之間的線性關系（d）Fig.5ROS release of PBS blank (a), PDI-Man6 (b) and PDI-Man6@MoS2 (c) under white light illumination and linear relationship between ROS release and light time (d)

圖6MoS2、PDI-Gal4@MoS2 和PDI-Man6@MoS2 對于藥物CAZ 的負載率（a）和負載量（b）Fig.6Loading rates (a) and loading quantification (b) of MoS2, PDI-Gal4 @ MoS2 and PDI-Man6 @ MoS2 to drug CAZ

2.4 糖基苝酰亞胺與二硫化鉬自組裝體系的抗菌活性

PDI-Gal4@MoS2@CAZ 和PDI-Man6@MoS2@CAZ 對于綠膿桿菌的抗菌活性被進一步評價，結果表明，甘露糖體系作為參照組，半乳糖體系對綠膿桿菌具有靶向性。利用綠膿桿菌標準菌株，實驗中分別測定了單獨抗生素藥物CAZ 和負載抗生素的PDI-Gal4@MoS2@CAZ 和 PDI-Man6@MoS2@CAZ 抗菌體系在有無白光照射條件下的抗綠膿桿菌的活性（MIC），以驗證載藥體系的光動力協同藥物抗菌活性的強化效果，結果如表1 所示。從抗菌活性MIC 結果可以看出，單獨的CAZ 作為傳統抗生素藥物對于細菌有穩定抑制效果，并且藥物的作用是不受到外界光源的影響的。在CAZ 與PDI-Man6組裝形成載藥體系后，在非光照條件下，載藥體系并未產生對細菌的增效殺傷效果，在白光光照下，PDI 化合物產生的ROS 能夠協同負載的藥物增強治療效果，卻并未有明顯靶向增效性；在引入二硫化鉬材料構建形成的抗菌體系PDI-Man6@MoS2@CAZ 中，藥物在二硫化鉬表面的裝載起到了藥物遞送的作用，在非光照條件下表現出抗菌增效效果，在白光光照下，PDIMan6@MoS2@CAZ 體系將CAZ 原先對于綠膿桿菌的MIC 從32 μg/mL 降低到8 μg/mL，抗菌能力提升了3 倍。基于半乳糖基體系中的半乳糖基能夠靶向綠膿桿菌表面分泌的蛋白LecA，實驗中觀察到在非光照條件下，CAZ 與PDI-Gal4自組裝載藥體系對于綠膿桿菌的靶向效果便已經初步體現。在白光光照下，即便未與二硫化鉬材料自組裝，PDI-Gal4與CAZ的復合體系借助半乳糖基的靶向性將體系中CAZ 對于綠膿桿菌的MIC 顯著降低到2 μg/mL，該結果明顯區別于沒有靶向性的PDI-Man6@CAZ 體系。負載抗生素的PDI-Gal4@MoS2@CAZ 體系在非光照條件下的靶向效果與游離態PDI-Gal4@CAZ 相似，在白光光照下，半乳糖基對綠膿桿菌的靶向作用促使藥物的高選擇性低損耗的裝載，完成敏化ROS 和藥物的全方位菌內釋放，使得PDI-Gal4@MoS2@CAZ體系將CAZ 原先對于綠膿桿菌的MIC 從32 μg/mL 降低到1 μg/mL（表1）。我們通過自組裝體系攜帶抗生素，大幅度提高了抗生素 CAZ 殺滅綠膿桿菌的效果，將其抗菌能力提升了31 倍，表現出明顯的增效效果。

表1CAZ 聯合自組裝體系對于綠膿桿菌（ATCC27853）的MICTable1Determination of MIC of CAZ combined self-assembly system treatment for P. aeruginosa (ATCC27853)

3 結 論

為有效治療綠膿桿菌并且減少細菌的抗生素耐藥性，利用菲酰亞胺熒光母核及二維材料的光動力性質，將兩種分別帶有半乳糖糖基或甘露糖殘基的菲酰亞胺分子通過π-π 堆疊作用負載在具有優異物理性能的二維片層二硫化鉬材料表面，并同時負載抗生素CAZ，構建了具有優良抗菌活性的載藥光動力抗菌體系PDI-Gal4@MoS2@CAZ 和PDI-Man6@MoS2@CAZ。進一步在分子水平綜合評價了抗菌體系光照下的活性氧簇釋放性能和自組裝體系的載藥性能。最后，使用綠膿桿菌的菌液，采用最小抑菌濃度實驗評價了構建體系的抗菌性能，發現 PDIGal4@MoS2@CAZ 在白光照射下對于綠膿桿菌的高效靶向抗菌活性非常顯著。半乳糖基的引入，不僅為抗菌材料提供了靶向基團，使之能夠靶向表面具有特異性凝集素的綠膿桿菌，也進一步提升了基于二維材料體系的生物相容性。本文工作為開發一類具有生物靶向性、高生物相容性等優勢的抗菌材料提供了新的方向，也為能夠避免抗生素的使用，完全借助材料的光學性能來實現抗菌效果的自組裝體系的構建提供研究基礎。

致 謝：本研究得到了法國里昂第一大學Sébastien Vidal 教授的大力支持與幫助!