響應(yīng)面優(yōu)化超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定有機肥中14 種磺胺類抗生素

錢詩穎， 藍雅瓊， 劉 倩， 司文帥， 孫明星， 王魯梅， 沈國清

（1. 上海交通大學農(nóng)業(yè)與生物學院，上海 200240；2. 上海海關(guān)工業(yè)品與原材料檢測技術(shù)中心，上海 200135；3. 上海市農(nóng)業(yè)研究院，上海 201403）

磺胺類抗生素（Sulfonamide,SAs）是一類人工合成的廣譜抗菌藥物，因其成本低廉，且具有較高穩(wěn)定性及較強親水性的特性，常被用作飼料添加劑以預防、治療動物疾病，是我國目前生產(chǎn)、使用量最大的抗生素種類之一[1-2]。SAs 在動物腸道內(nèi)吸附能力較差，大部分以原藥形態(tài)隨動物糞便和尿液排出體外[3]，并隨之以主要原料為禽畜糞便的有機肥進入農(nóng)田土壤中，在土壤表層累積或隨徑流進入地表水和地下水[4]。殘留的SAs 在環(huán)境中的穩(wěn)定性較好，易被植物吸收富集，并可導致病原菌的耐藥性增強，食用動物產(chǎn)生抗生素抗性基因(ARGs)[5-7]。因此，近年來有機肥中抗生素檢測越來越受到關(guān)注。

有機肥料的基質(zhì)非常復雜，目標抗生素不易分離提取出來，因此樣品的前處理過程十分重要。目前常用的提取技術(shù)有固液振蕩提取法、超聲提取法和加壓溶劑萃取法等，其中，固液振蕩提取法因具有設(shè)備簡單、操作方便等優(yōu)點而被廣泛使用。然而，在使用振蕩法進行提取過程中，提取溶劑和緩沖液的pH、體積、振蕩時間等因素對提取效果影響很大[8-10]，需要對提取條件進行優(yōu)化。傳統(tǒng)的前處理優(yōu)化方式只反映單個因素的影響，難以分析自變量之間的相互作用，且實驗繁瑣，效率低[11-12]。響應(yīng)面分析法（RSM）是一種通過實驗設(shè)計、數(shù)學建模來預測最優(yōu)工藝參數(shù)的研究方法，相對于傳統(tǒng)的實驗方法，具有計算簡便、實驗量少等優(yōu)點，因此廣泛應(yīng)用于環(huán)境、制藥與化工等領(lǐng)域[13-14]。

本文針對目前畜禽業(yè)常用的磺胺吡啶、磺胺噠嗪等14 種磺胺類抗生素，采用溶劑提取法，結(jié)合固相萃取凈化，利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UHPLCMS/MS）進行測定，并通過響應(yīng)面優(yōu)化法確定振蕩時間、緩沖液pH 和緩沖液體積這三個實驗因素的最優(yōu)條件，建立了一種靈敏、高效的測定商品有機肥中14 種磺胺類抗生素殘留的分析方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

ACQUITY UPLC XEVO TQ-S 超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國Waters 公司）；HY-5A 型回旋振蕩器（常州翔天實驗儀器廠）；DT5-2B 型低速臺式離心機（北京時代北利離心機公司）；Organomation NEVAP112型氮吹儀（北京成萌偉業(yè)公司）；500G 型渦旋混合器（上海安譜實驗科技公司）。

1.2 試劑與材料

甲醇、乙腈（ACN）：色譜純，德國默克公司；甲酸（FA）、檸檬酸、磷酸氫二鈉、乙二胺四乙酸二鈉、乙酸（HAc）、磷酸、三乙胺、氨水，均為分析純，上海化學試劑有限公司。

磺胺吡啶(SPD）、磺胺噠嗪(SDZ)、磺胺甲惡唑(SMX)、磺胺噻唑(STZ)、磺胺甲基嘧啶(SMI)、磺胺二甲異惡唑(SIZ)、磺胺甲噻二唑(SMT)、磺胺二甲嘧啶(SMZ)、磺胺-6-氧嘧啶(SMM)、磺胺對甲氧嘧啶(SM)、磺胺甲氧噠嗪(SMPZ)、磺胺氯噠嗪(SCP)、磺胺鄰二甲氧嘧啶(SDO)、磺胺間二甲氧嘧啶(SDM)，均購于Sigma Aldrich（德國），純度≥95%。

Waters BEH C18 色譜柱(1.7 μm×2.1 mm×100 mm)（美國Waters 公司）；GPD PURIFY MCX 固相萃取柱（北京市廣普達科技公司）。

1.3 溶液的配制

標準貯備液：稱取各類抗生素標準物質(zhì)，用甲醇配制成1000mg/L 的溶液。

混合標準溶液：取上述標準貯備液，用甲醇稀釋成1 mg/L，?20 ℃下避光密封保存。

標準工作溶液：用φ=50%甲醇溶液稀釋混合標準溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

分析定容液：取5.5 mL 磷酸、6.2 mL 三乙胺和150 mL 乙腈，用水稀釋定容到1000mL。

1.4 前處理的優(yōu)化

1.4.1 前處理 樣品采集與制備：樣品來源于上海農(nóng)資市場出售的商品有機肥。取樣品真空冷凍干燥48 h后研磨并過0.35 mm 孔徑網(wǎng)篩，將樣品儲存在棕色瓶中，4 ℃條件下避光保存。

通過查閱文獻[15]，初步確定肥料樣品的前處理方案為：取(2.0 ± 0.02) g 肥料試樣于50 mL 聚丙烯離心管中，加100 μL、1 mg/L 混合標準溶液混勻，加入一定體積（5 、10 、15 mL）的乙二胺四乙酸二鈉（Na2EDTA）-Mcllvaine 緩沖液（pH 為3.0、4.0、5.0），渦動混勻，再加入20 mL、乙腈與乙酸的混合液（V(ACN)∶V(HAc)=80∶20），渦動2 min，在振蕩器上振搖一定時間（20、30、40 min）。在4000r/min 下離心10 min 后吸取2.5 mL 上清液，加入10 mL 純水進行稀釋，混勻后待凈化。使用GPD PURIFY MCX固相萃取柱進行凈化，分別用5 mL 甲醇和5 mL、50 mmol/L 檸檬酸溶液對萃取小柱進行活化，然后將待凈化液過柱，棄去濾液，隨后用3 mL 純水和3 mL甲醇溶液淋洗，棄去淋洗液，將小柱抽干，最后用3 mL、φ=50%氨化甲醇溶液洗脫，并收集洗脫液。洗脫液用氮氣吹干，用1 mL 分析定容液溶解，過0.22 μm 濾膜后上機待測定。

1.4.2 提取溶劑的選擇 乙腈作為提取溶劑可以減少抗生素與有機肥基質(zhì)中無機元素和有機質(zhì)的螯合作用，減少基質(zhì)干擾[16]。同時，提取溶劑的酸化也有利于抗生素的提取[17]。因此，選擇乙腈、乙腈與乙酸混合液（V（ACN）∶V（HAc）分別為95∶5，90∶10，85∶15，80∶20）和乙腈、乙酸、水的混合液（V（ACN）∶V（H2O）∶V（FA）=800∶199∶1）6 種提取溶劑，研究比較其對有機肥中抗生素的提取回收率。

1.4.3 響應(yīng)面優(yōu)化 選取緩沖液體積（X1）、緩沖液pH值（X2）以及振蕩時間（X3）作為響應(yīng)面實驗中待優(yōu)化的因素，以平均提取回收率（Y）為預測的響應(yīng)值。實驗利用Design-expert 8.0 軟件，選擇Box-Behnken Design（BBD）實驗設(shè)計方法設(shè)計優(yōu)化實驗，實驗因素及水平編碼如表1 所示，最后共得到17 個實驗方案。

表1實驗因素及水平編碼Table1Experimental factors and horizontal coding

使用該軟件進行擬合、方差分析及最優(yōu)條件的預測。二次多項式的表達式如下：

式中：Y 表示響應(yīng)的預測值，即平均提取回收率（%）；A0表示常數(shù)；Ai為線性項系數(shù)；Aii為二次項系數(shù)；Aij為交互項系數(shù)；?表示殘差；Xi和Xj為各因素水平的編碼值（i=1～3，j=1～3）。

1.5 檢測條件

1.5.1 色譜條件[18]色譜柱柱溫：35 ℃；進樣體積：3 μL；流動相：甲醇和10 mmol/L 乙酸銨?0.1%（體積分數(shù)）甲酸水溶液；梯度洗脫程序：0～4.0 min，甲醇10%～30%（體積分數(shù)，下同）；4.0～5.0 min，甲醇30%～50%；5.0～5.2 min，甲醇50%；5.2～5.5 min，甲醇50%～10%；5.5 min～7.0 min，甲醇10%；流速：0.4 mL/min，柱溫：35 ℃。

1.5.2 質(zhì)譜條件 離子源：電噴霧離子源；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測；電離電壓：3.0 kV；源溫：150 ℃；脫溶劑溫度：550 ℃；脫溶劑氣流速：1000L/h；碰撞氣流速：0.17 mL/min；14 種磺胺類抗生素的母離子(Parent ion)、定量/定性離子(Daughter ion)及相應(yīng)碰撞能量(Collision energy)、錐孔電壓(Cone voltage)見表2。

1.5.3 線性范圍和方法檢出限 配制質(zhì)量濃度為10、20、50、100、200 μg/L 的14 種磺胺類抗生素混合標準溶液，在上述條件下進樣，所得14 種磺胺類抗生素質(zhì)量濃度（X'）與色譜峰面積（Y'）的線性關(guān)系如表3所示，相關(guān)系數(shù)R2均在0.999 以上。分別以3 倍及10 倍信噪比確定14 種磺胺類抗生素的儀器檢出限（LOD）與定量限（LOQ），14 種抗生素的LOD 與LOQ 分為0.1～0.5 μg/L 與0.2～1 μg/L。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取液的選擇

14 種磺胺抗生素在ACN 溶液、ACN 與HAc 體積比分別為95∶5、90∶10、85∶15、80∶20 的混合溶液和ACN、水與FA 體積比為800∶199∶1這6 種提取液條件下的提取回收率如表4 所示。結(jié)果顯示，當以V(ACN)∶V(HAc)=80∶20 的ACN 與HAC 的混合溶劑作為提取溶劑時，各抗生素的提取回收率為53.78%～90.29%，此時14 種磺胺類抗生素平均提取回收率最高，為68.56%，因此選其作為提取溶劑。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化實驗

通過Design-expert 8.0 軟件設(shè)計的17 個實驗方案及結(jié)果如表5 所示，14 種抗生素的平均提取回收率為43.51%～70.83%，其中，當緩沖液體積為5 mL、pH 為3、振蕩時間為30 min 時，平均提取回收率最高，達到70.83%。

對實驗方案設(shè)計及實驗后得到的數(shù)據(jù)采用二次多項式方程進行擬合，并且根據(jù)方差分析結(jié)果對模型進行手動優(yōu)化調(diào)整，使模型達到最優(yōu)。最終，以平均提取回收率Y 作為因變量，緩沖液體積（X1）、緩沖液pH 值（X2）和振蕩時間（X3）作為自變量，得到擬合方程如下：

模型擬合完畢后，用Design-expert 8.0 軟件對該模型進行方差分析，檢驗?zāi)Ｐ偷臄M合程度，結(jié)果如表6所示，所擬合的二次多項式模型的P 值為0.000 3，P<0.05，表明所擬合的模型極顯著。模型失擬P 值為0.491 8（P>0.05），失擬不顯著，表明模型擬合較好。該模型的信噪比為14.277（大于4），表明模型可取。同時該模型的校正決定系數(shù)(Adj R2)和預測決定系數(shù)（Pred R2）分別為0.9168和0.852 1，且差值在0.2 之內(nèi)，表明該模型與實測值擬合較好，可用于肥料中14 種抗生素平均提取回收率的預測和分析。

表214 種磺胺類抗生素的母離子、定量/定性離子及相應(yīng)碰撞能量、錐孔電壓Table2Parent ion, daughter ion, collision energy and cone voltage of14kinds of sulfonamide antibiotics

表314 種磺胺類抗生素的線性回歸方程、檢測限和定量限Table3Linear regression equations, detection limits and quantitative limits of14kinds of sulfonamide antibiotics

表4不同提取液條件下抗生素平均提取回收率Table4RER of antibiotics using different extraction solvents

表5響應(yīng)面優(yōu)化實驗結(jié)果Table5Result of response surface experiment

回歸模型的方差分析表顯示，緩沖液體積（X1）和緩沖液pH（X2）對肥料中14 種抗生素的平均提取回收率的影響極顯著（P<0.05），而緩沖液體積（X1）和緩沖液pH（X2）的交互影響以及緩沖液pH（X2）和振蕩時間（X3）的交互影響對平均提取回收率的影響不顯著（P>0.05）。

表6響應(yīng)面模型方差分析表Table6Analysis of variance for response surface quadratic model

殘差與方程預測值的對應(yīng)關(guān)系圖如圖1(a)所示，本實驗中得到的殘差圖顯示預測值的殘差均在±2.00 的范圍內(nèi)變化，且無規(guī)律地分散排布，但未超出±3.00，表明本實驗所得到的回歸方程對于預測值的擬合較理想。平均提取回收率的實驗值與預測值的對應(yīng)關(guān)系如圖1(b)所示，圖中各點代表了實測值，擬合直線代表了預測值，圖中17 個點都分布在直線的附近，且偏離程度不大，表明本實驗中所獲得的回歸模型能夠比較準確地預測平均提取回收率，真實地反映出緩沖液體積、緩沖液pH 和振蕩時間對平均提取回收率的影響情況。

圖1殘差與預測值（a）以及實驗值與預測值（b）對比圖Fig.1Internally studentized residuals versus predicted responses (a) and actual versus predicted responses (b)

為了更加直觀地展示兩兩因素之間對平均提取回收率的交互作用，實驗分析中利用Design-expert 8.0 軟件繪制出了相應(yīng)的響應(yīng)面3D 圖，如圖2 所示。

圖2(a)反映出當振蕩時間不變時，平均提取回收率隨緩沖液體積與緩沖液pH 變化的趨勢，從圖中可以直觀地看到最高回收率在緩沖液pH 為3.0 和緩沖液體積為5 mL 附近取得。圖2(b)反映出當緩沖液pH 不變時，平均提取回收率隨緩沖液體積的減小而增大，隨振蕩時間的增加先減小后增大。圖2(c)反映出當緩沖液體積不變時，平均提取回收率隨緩沖液pH 的減小而增大。最終，通過模型擬合預計，當加入6.15 mL Na2EDTA-Mcllvaline 緩沖液（pH 3.0），振蕩時間為20 min 時，14 種抗生素的提取回收率最高，可達73.46%。

圖2不同因素相互作用對平均提取回收率的影響Fig.2Effects of binary interactions among different factors on the average recovery

2.3 回收率驗證

按照添加標準物質(zhì)的量與待測樣品中存在的分析物質(zhì)濃度范圍相近的原則，設(shè)置肥料添加量為25、50 μg/kg 和100 μg/kg 這3 個低、中、高比例梯度[19-20]，在上述最佳前處理條件下，對肥料樣品分別進行3 次重復實驗，得到肥料中14 種抗生素的平均提取回收率，如表7 所示。

從表7 可以看到，驗證實驗中對添加量分別為25、50 μg/kg 和100 μg/kg 的肥料進行提取后得到的平均提取回收率分別為69.31%、73.89%、76.39%，與模型擬合預測的最佳平均提取回收率（73.46%）相比，分別相差4.15%、0.43%、2.93%，差值控制在5%之間，同時相對標準偏差RSD≤3.04%，說明所擬合的方程預測的平均提取回收率具有很強的實際應(yīng)用性，即經(jīng)過響應(yīng)面實驗優(yōu)化確定的前處理條件可以作為最佳前處理條件。

表7最優(yōu)前處理方法檢驗結(jié)果Table7Validation of optimal pretreatment method（n=3）

2.4 實際樣品檢測

應(yīng)用經(jīng)優(yōu)化后的檢測方法對6 個實際樣品進行了測定，樣品為豬糞、雞糞和鴨糞肥3 種畜禽糞便以及3 種植物源有機肥，采自本地肥料銷售點和生產(chǎn)廠家。結(jié)果重復性良好，在豬糞肥中檢出608.08 μg/kg磺胺甲惡唑，鴨糞肥中檢測到12.67 μg/kg 磺胺二甲異惡唑。

3 結(jié) 論

（1）建立了一種超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜，同時測定有機肥中14 種磺胺類抗生素的方法，比較了不同提取劑的種類對提取效果的影響，通過響應(yīng)面法對緩沖液體積、緩沖液pH 和振蕩時間這3 個因素進行優(yōu)化。模型擬合結(jié)果表明，當加入6.15 mL Na2EDTAMcllvaline 緩沖液（pH 3.0），振蕩時間為20 min 的條件下提取14 種抗生素的提取回收率最高，為73.46%。

（2）對優(yōu)化后的前處理方案進行驗證，平均提取回收率為69.31%～76.39%，與預測值的差值在5%內(nèi)，同時重現(xiàn)性較好（RSD≤3.04%），表明優(yōu)化所得檢測方法具有較強的實用性。應(yīng)用本方法對6 個樣品進行了測定，其中一個樣品檢出608.08 μg/kg 磺胺甲惡唑，另一個樣品檢出12.67 μg/kg 磺胺二甲異惡唑。