瀘州老窖大曲中高產纖溶酶菌株的分離及鑒定

張立強，冉茂芳，王松濤，劉光錢，馬 卓，任劍波，沈才洪，許 濤

(1.瀘州品創科技有限公司，四川瀘州 646000；2.瀘州老窖股份有限公司，四川瀘州 646000；3.國家固態釀造工程技術研究中心，四川瀘州 646000)

血栓疾病是一種由大量纖維蛋白和血小板凝集造成的嚴重性血管疾病，主要分為動脈性、靜脈性和毛細血管性血栓，常常會引起人體中風、腦梗死、心源性猝死等疾病。隨著生活節奏的加快及工作壓力的增加，人們的飲食和作息規律發生改變，血栓發病率逐年增加，嚴重威脅人類的身體健康[1-2]。治療血栓疾病主要有外科手術、抗血小板凝集、抗凝血藥及纖溶酶（鏈激酶、尿激酶、組織型纖溶酶原激活劑）等4 種療法，但是，這些療法費用高昂、用量大、半衰期短、專一性差、副作用較多且醫療效果有限[3]。1987 年，日本科學家Sumi 等[4-5]首次從日本納豆中發現了納豆激酶，一種具有很高纖溶活性的絲氨酸蛋白酶，不僅可以直接分解纖溶蛋白，而且可以刺激細胞釋放組織纖溶酶原激活劑。與其他纖溶酶如尿激酶、鏈激酶及其他溶栓藥物相比，納豆激酶具有安全性高、成本低、纖溶活性強、可口服和作用時間長等優點[6]。納豆激酶的發現將纖溶酶的篩選來源引向了微生態環境，經過30 多年的研究，產纖溶酶的微生物尤以耐熱的芽孢桿菌為最多，如枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌等[1]。芽孢桿菌合成的纖溶酶為絲氨酸及金屬肽酶，可以水解纖維蛋白、纖維蛋白原和合成的物質，在pH5～12 及10～75 ℃條件下仍保持一定的活性[7]。

大曲為白酒釀造過程中的酶制劑、微生物及香味物質來源，分低溫大曲、中溫大曲和高溫大曲。瀘州老窖大曲為中高溫大曲，其發酵頂溫可達50～60 ℃，經過發酵，其中富集了大量的耐熱芽孢桿菌，可合成大量的淀粉酶、蛋白酶等水解酶類。此外，其代謝合成的生理活性物質如吡嗪類化合物、地衣素、氨基酸活性短肽等可能會通過蒸餾進入到白酒中，使白酒具有一定的養生保健功能[8-9]。因此，中高溫大曲中可能存在潛在的合成耐受性較高的纖溶酶的微生物。本研究擬以瀘州老窖中高溫大曲為樣品，從中篩選纖溶活性較高的芽孢桿菌，為溶栓藥物的開發、功能性保健酒及保健食品的開發提供功能性微生物資源，有利于充分挖掘釀酒微生物資源和揭示白酒預防動脈粥樣硬化等的養生保健功能。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

樣品：中高溫大曲，瀘州老窖股份有限公司。

試劑及耗材：氫氧化鈉、葡萄糖、麥芽糖、牛肉膏、蛋白胨、瓊脂、酵母提取物、蝦殼粉、氯化鈉、草酸銨結晶紫染液、盧戈氏碘液、番紅、乙醇、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、氯化鈣分析純，本地化學試劑商店；瓊脂糖Sigma-Aldrich；脫脂牛奶、牛血纖維蛋白原、尿激酶、牛凝血酶，上海源葉生物科技有限公司；Tris-HCl、DNA 提取液、蛋白酶K、蝸牛酶、溶菌酶、Tris-HCl、EDTA、CTAB，上海生工生物工程有限公司；VITEK-2 革蘭氏陽性芽孢桿菌鑒定卡，法國梅里埃公司。

儀器設備：超凈工作臺SW-CJ-2G，上海諾萱科學儀器有限公司；高速冷凍離心機CR22N，日本日立；高壓滅菌鍋344，日本三洋；恒溫搖床培養箱，上海世平實驗設備有限公司；水浴鍋HH-6，金城碩華儀器廠；VITEK 2 COMPACT 全自動微生物鑒定系統，法國梅里埃公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養基和溶液

初篩培養基[10]：脫脂奶粉6.0%、牛肉膏0.5%、蛋白胨0.5 %、氯化鈉0.5%、瓊脂1.5 %～2.0 %，pH7.0，115 ℃滅菌15 min。

復篩培養基：瓊脂糖-纖維蛋白原平板。

斜面培養基（LB 固體培養基）：胰蛋白胨1.0 %、酵母提取物0.5 %、氯化鈉1.0 %、瓊脂1.5%～2.0%，pH 7.0～7.5，121 ℃滅菌20 min。

發酵培養基：蛋白胨1.0%，磷酸氫二鉀0.2%，硫酸鎂0.1 %，麥芽糖2.0 %，酵母提取物1.0 %，葡萄糖0.2%，蝦殼粉1.0%，脫脂牛奶2.0%，pH7.2～7.4，121 ℃滅菌20 min。

磷酸鹽緩沖液（0.2 mol/L，PBS，pH7.2）：將72.0 mL 0.2 mol/L 的Na2HPO4水溶液與28.0 mL 0.2 mol/L 的NaH2PO4水溶液混勻，配制成0.2 mol/L的PBS，121 ℃滅菌20 min。

工作液：將0.2 mol/L 的PBS 用無菌水稀釋成0.01 mol/L 的PBS，然后，準確量取100.0 mL 與1700.0 mL 的0.9 %無菌生理鹽水混勻配制成工作液。

凝血酶溶液：將1240 U 的牛凝血酶加入到1.24 mL 無菌超純水中，充分溶解后配成母液。然后，準確量取1.0 mL母液，用0.9%的無菌生理鹽水定容到100 mL 配制成10 U/mL，保藏于-20 ℃待用。

纖維蛋白原溶液：準確稱取一定量的牛血纖維蛋白原溶液溶于工作液中配制成1.50 mg/mL 的纖維蛋白原溶液。纖維蛋白原溶液需現配現用，使用前，于55 ℃水浴中預熱1 min。

瓊脂糖溶液：準確稱取5.40 g 瓊脂糖溶于360 mL 工作液中，分裝到20 支大試管中，每支分裝18 mL，121 ℃滅菌20 min。

1.2.2 高產纖溶酶菌株的初篩

稱取5.00 g 中高溫大曲樣品，置于盛有45 mL無菌生理鹽水且底部鋪滿玻珠的250 mL 三角瓶中，80 ℃水浴處理10～15 min 后，180 r/min 振蕩搖勻30 min，獲得菌懸液。菌懸液用無菌生理鹽水梯度稀釋后，取10-6、10-7、10-8的稀釋液0.2 mL，加入到無菌培養皿中。然后，將冷卻到50 ℃左右的初篩培養基注入到含有稀釋液的培養皿中，使培養基鋪滿皿底即可，充分混勻后，靜置凝固15 min，于37 ℃條件下倒置培養24 h。從培養皿中挑選菌落形態不同且水解圈較大的菌落，在初篩培養基平板上進行連續劃線分離至純，挑取水解圈較大的單菌落，保藏到斜面培養基，編號為QM1～QM13。然后，將微生物在初篩培養基上分3 個區域接種，以37 ℃培養12 h，觀察其菌落形態，并經革蘭氏染色觀察細胞形態。

1.2.3 高產纖溶酶菌株的復篩

1.2.3.1 纖溶酶粗酶液的制備

用接種環挑取2～3 環斜面培養基上的菌落到50 mL LB 液體培養基中，37 ℃條件下180 r/min 活化培養18 h，用血球計數板計數后，調整菌濃為1.0×108cfu/mL。然后吸取1 mL 接種到24 mL 發酵培養基中，37 ℃條件下180 r/min 培養24 h。將發酵液8000 r/min 冷凍離心（4 ℃）5 min，收集上清液獲得纖溶酶粗酶液。

1.2.3.2 瓊脂糖-纖維蛋白原平板的制備[11]

將裝有18 mL 1.5%瓊脂糖的試管放入沸水浴中使瓊脂糖完全溶解，冷卻至50～55 ℃。準確加入2 mL 牛血纖維蛋白原溶液(1.50 mg/mL)，充分振蕩混勻后倒入無菌培養皿中（Φ：9 cm）。然后，迅速加入1 mL 牛凝血酶溶液(10 U/mL)，輕輕晃動培養皿使其充分混勻，靜置1 h 后，用直徑2 mm 的無菌打孔器在平板上均勻打3個孔。

1.2.3.3 尿激酶標準曲線

將尿激酶標品用無菌水稀釋成1000 IU/mL、800 IU/mL、600 IU/mL、400 IU/mL、200 IU/mL 和100 IU/mL 等6 個梯度的標準液。準確吸取10 μL尿激酶標準液注入瓊脂糖-纖維蛋白原平板孔中，一個濃度做3個平行。然后，靜置吸附15～20 min，37 ℃培養18 h，從3 個方向用游標卡尺測定溶解圈的直徑，取平均值計算各溶解圈面積（mm2）。以溶解圈的面積為橫坐標（x），以尿激酶酶活為縱坐標（y），制作尿激酶標準曲線。

1.2.3.4 纖溶酶活力的測定

準確吸取10μL 纖溶酶粗酶液注入瓊脂糖-纖維蛋白原平板孔中，一個濃度做3 個平行。然后，靜置吸附15～20 min，37 ℃培養18 h，從3 個方向用游標卡尺測定溶解圈的直徑，取平均值計算各溶解圈面積，由尿激酶標準曲線計算纖溶酶的活力。

1.2.4 高產纖溶酶菌株的鑒定

1.2.4.1 生理生化實驗鑒定

利用VITEK 2 COMPACT 全自動微生物鑒定系統對纖溶酶活性較高的菌株進行生理生化實驗鑒定。具體流程如下：將纖溶酶活性較高的菌株接種到斜面培養基上，37 ℃條件下培養12 h，用無菌接種環挑取菌體到裝有3 mL 的0.9 %無菌生理鹽水的小試管中，渦旋振蕩打散后，用無菌生理鹽水將菌濃調整到0.3～0.5 麥氏濁度。然后，將小試管放到卡架上與VITEK-2 革蘭氏陽性芽孢桿菌鑒定卡連接，把卡架放入儀器填充室中進行自動填充并放入到培養室中培養檢測。最后，將鑒定卡信息錄入到VITEK 2 COMPACT 全自動微生物鑒定系統工作站，培養檢測14～15 h 后經工作站導出生理生化反應結果及最終的鑒定結果。

1.2.4.2 16S rDNA測序鑒定

為進一步鑒定纖溶酶活性較高的菌株，將菌株接種到LB 液體培養基中，37 ℃培養12 h 后，10000 r/min 冷凍離心（4 ℃）10 min，去除上清液收集菌體。然后，用傳統DNA 提取方法提取微生物的基因組DNA[8]，經核酸蛋白儀測定濃度及純度后移交上海生工生物工程有限公司測定16S rDNA 全長序列。

表1 分離的細菌的菌落形態

1.3 數據處理

利用Adobe Photoshop 軟件對菌落圖及革蘭氏染色圖進行處理。使用OriginPro 9.0 軟件繪制尿激酶標準曲線。使用SPSS statistics 19.0 軟件對不同菌株的纖溶酶活力進行顯著性分析。菌株的16S rDNA 序列經NCBI 網站Blast 功能檢索同源性序列，然后利用MEGA-X軟件作系統發育樹分析。

2 結果與討論

2.1 高產纖溶酶菌株的初篩、菌落形態及細胞形態

纖溶酶是一種絲氨酸肽鏈內切酶，可以水解初篩培養基中的酪蛋白形成水解圈[7，12]。基于此，從中高溫大曲中初步篩得13 株酪蛋白水解活力較高的細菌，編號為QM1—QM13（表1）。將13 株細菌分別接種到初篩培養基平板上，培養后觀察其菌落形態，如表1 所示，QM1、QM2、QM3、QM4、QM6、QM7、QM8、QM9 和QM10 的菌落形態一致，均為乳白色、圓形、邊緣整齊、顆粒感、致密、有褶皺突起、黏液少、不透明，與培養基結合緊密，可能為同一種細菌。QM5 的菌落形態為乳白色、邊緣不規則、顆粒感、不致密、褶皺凸起、黏液較多、不透明、與培養基結合較緊密，可能為另一種細菌。QM11、QM12 和QM13 的菌落形態一致，與其他微生物的菌落形態差異明顯，為米白色、邊緣不規則、光滑、不致密、凸起、黏液很多、微透明，與培養基結合較緊密，可能為同一種細菌。部分細菌的菌落圖如圖1 所示。為進一步研究各細菌的細胞形態，經革蘭氏染色后，油鏡下觀察其形態，如表2 所示。結果表明，篩得的細菌均為革蘭氏陽性芽孢桿菌、短桿、單聯或二聯，孢子為橢圓形中生孢子。部分微生物的革蘭氏染色圖如圖2所示。

圖1 分離的細菌的菌落形態圖

2.2 高產纖溶酶菌株的復篩

2.2.1 尿激酶標準曲線

不同酶活梯度的尿激酶標準液在瓊脂糖-纖維蛋白原平板上反應結束之后，以溶解圈直徑的平均值計算的面積為橫坐標（x，mm2），以尿激酶酶活為縱坐標（y，IU/mL），繪制尿激酶標準曲線，如圖3 所示。擬合的線性回歸方程為y=0.1041x+5.9879，R2=0.9919，結果表明，方程線性關系良好，可用于纖溶酶活性的測定。

2.2.2 芽孢桿菌的纖溶酶活力

表2 分離的細菌的細胞形態

圖2 分離的細菌細胞形態圖

圖3 尿激酶酶活標準曲線

將10 μL 纖溶酶粗酶液加入到瓊脂糖-纖維蛋白原平板孔中，培養至與尿激酶反應時間一致后，用游標卡尺測定3 個平行的水解圈直徑，計算水解圈的面積。然后，經尿激酶標準曲線計算各纖溶酶粗酶液的纖溶酶活力（均值±標準偏差，IU/mL），如圖4 所示。結果表明，不同芽孢桿菌發酵液的纖溶酶活力差異顯著性（p＜0.05），QM12 和QM5的纖溶酶活力最高，分別為4270.83 IU/mL±563.52 IU/mL和3711.48 IU/mL±418.93 IU/mL，其次為QM4（3508.84 IU/mL±531.72 IU/mL），QM1 和QM7 的最低，分別為2379.71 IU/mL±69.38 IU/mL 和2447.82 IU/mL±53.79 IU/mL。目前，研究學者主要從納豆[13-14]、豆豉[15]、臭豆腐[11]、豆醬[16]、鷹嘴豆[17]和土壤[2，18]等微生態環境中篩選高產纖溶酶的菌株。但是，文獻中的纖溶酶活力的單位眾多，如FU/mL、U/mL、IU/mL、FU/g、U/mg、mU/mg 等[1，18]，難以比較不同菌株間的酶活力大小。酶活力單位為IU/mL的菌株的纖溶酶活力多為300～2100 IU/mL[19-24]，極少數菌株通過發酵條件優化、誘變育種或基因改造可使纖溶酶活力達到4000～5500 IU/mL[25-26]。本研究從中高溫大曲中篩選的芽孢桿菌的纖溶酶活力均＞2400 IU/mL，且為野生型菌株，未進行培養基及發酵條件優化，表明篩選的芽孢桿菌為高產纖溶酶菌株，特別是QM5 和QM12。Nidialkova 等[7]指出芽孢桿菌合成的纖溶酶為絲氨酸及金屬肽酶，可以水解纖維蛋白、纖維蛋白原和合成的物質，可在pH5～12 及10～75 ℃條件下保持活性。白酒中也檢出了一定含量的地衣素、脯氨酸-組氨酸-脯氨酸等的活性肽，表明這些物質可經過蒸餾進入到白酒中，并保有一定的功能活性[9]。本試驗從釀酒大曲中篩得纖溶酶活力較高的芽孢桿菌，有利于揭示白酒的預防動脈粥樣硬化等養生保健作用，后續研究工作仍需要對這些纖溶酶的種類進行系統性研究。

圖4 分離的芽孢桿菌纖溶酶活力

2.3 高產纖溶酶芽孢桿菌的菌種鑒定

2.3.1 生理生化鑒定

VITEK 2 COMPACT 全自動微生物鑒定系統可有效對微生物進行鑒定[27]，經該方法對纖溶酶活力最高的兩株芽孢桿菌QM5 和QM12 進行了鑒定，其生理生化反應結果見表3。QM5 菌株的β-木糖苷酶、丙氨酸-苯丙氨酸-脯氨酸芳胺酶和丙酮酸鹽反應呈現陽性，而QM12 的則呈現陰性，其次，QM12 的L-賴氨酸芳胺酶、亮氨酸芳胺酶、β-半乳糖苷酶、丙氨酸芳胺酶、酪氨酸芳胺酶、環糊精、糖元、己醇、ELLMAN、麥芽三糖、氨基酸芳胺酶、N-乙酰-D-葡萄糖氨、α-葡萄糖苷酶、D-塔格糖、紅四氮唑、多粘菌素B 耐受反應呈現陽性，QM5 則呈現陰性。QM5 與QM12 的其他反應結果一致。結果表明，QM5 和QM12 生理生化反應差別明顯，為兩種不同的芽孢桿菌，與形態學觀察結果一致。QM5 BCL 卡鑒定編碼為1260140415446220，結果為Bacillus amyloliquefaciens，為可接受的鑒定結果。QM12 BCL 卡鑒定編碼為2373271755076261，結果為Bacillus licheniformis，可信度達96 %，為很好的鑒定結果。

2.3.2 16S rRNA鑒定

為進一步鑒定QM5 和QM12 的種屬，將基因組DNA 提取后，擴增其16S rDNA 并進行測序，分別得到片段長度為1394 bp 和1449 bp 的序列。經NCBI BLAST 軟件搜索其在GenBank 中的同源性序列，結果表明，QM5 的16S rDNA 序列與Bacillus velezensis的同源性為99 %，QM12 的16S rDNA 序列與Bacillus licheniformis的同源性為100%。基于搜索的同源性序列，利用MEGA X 軟件的Neighbor-Joining 功能構建系統發育樹，結果見圖5。QM5 與Bacillus velezensis聚為一簇，相似性高達99%（圖5A），QM12 與Bacillus licheniformis聚為一簇，相似度高達100 %（圖5B）。Bacillus velezensis的基因與Bacillus amyloliquefaciens的基因相似度很高，曾被歸類同一種微生物[28]，可能是VITEK 2COMPACT 全自動微生物鑒定系統將QM5 鑒定為Bacillus amyloliquefaciens的原因。最新的研究表明Bacillus velezensis與Bacillus amyloliquefaciens的ANI 和dDDH 值低于種水平的閾值，應該保持各自的命名[29-30]。因此，結合VITEK 2 COMPACT 全自動微生物鑒定系統的鑒定及16S rDNA 測序結果，QM5 鑒定為Bacillus velezensis，QM12 鑒定為Bacillus licheniformis。

表3 QM5和QM12 在BCL鑒定卡上的生化反應結果

圖5 菌株QM5和QM12的系統發育樹

3 結論

本研究通過稀釋平板混菌法從瀘州老窖高溫大曲中分離純化得到13 株蛋白酶高產菌株QM1—QM13，經形態學鑒定，均為革蘭氏陽性芽孢桿菌。將其接種到發酵培養基中，37 ℃、180 r/min 條件下培養24 h，離心獲得粗酶液，由瓊脂糖-纖維蛋白原平板測定纖溶酶活性，獲得2 株纖溶酶活力較高的菌株QM5 和QM12，纖溶酶活力分別為3711.48 IU/mL±418.93 IU/mL 和4270.83 IU/mL±563.52 IU/mL，與已有的研究結果相比，其屬于纖溶酶高產菌株。結合VITEK 2 COMPACT 全自動微生物鑒定系統、16S rDNA 全序列測定及系統發育樹分析結果，QM5 為貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis），QM12 為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）。