宣酒釀造微生態系統中高產中性蛋白酶功能菌株的篩選與鑒定

朱國星，田 源，司冠儒，梅 婕，張衛衛，張溫清，高傳強

（1.江南小窖釀造工藝研究所，安徽宣城 242000；2.安徽宣酒集團股份有限公司科研中心，安徽宣城 242000）

芝麻香型白酒是中國白酒十二大香型之一，芝麻香型白酒香氣的典型特征是具有幽雅的類似于烘焙芝麻的焦糊香氣[1]。在工藝上，芝麻香型白酒生產是在醬香型白酒生產工藝的基礎上，融合了清香型和濃香型白酒生產工藝衍生而來。芝麻香用曲的構成十分復雜，由5 個種類的曲所構成：功能麩曲包括河內白曲，細菌曲，酵母曲；包包曲；高溫大曲，稱之“大麩結合”[2]。

白酒釀造原料中蛋白質的分解需要蛋白酶，細菌曲是主要蛋白酶的來源之一，因此細菌曲中蛋白酶對于白酒釀造有十分重要的作用[3-4]。蛋白酶的主要作用有3 種：一是有效地水解包裹發酵原料富含蛋白質的殼，提高微生物可利用的糖含量，進而提高產酒率；二是蛋白酶降解增加了可以被酵母利用的氨基酸，促進酵母生長代謝，節約其他用于生長的能源；三是蛋白酶降解得到的氨基酸可以參與美拉德反應，產生吡嗪類、呋喃類等香味物質，也可以被不同微生物及酶的代謝作用產生多種香味物質。白酒釀造微生物中，芽孢桿菌屬是一類重要的產蛋白酶菌屬，且具有良好的環境耐受性和乙醇耐受性等優質特征[5-6]。

本研究以宣酒高溫大曲為篩選材料，通過測量平板透明圈和檢測中性蛋白酶活力，篩選及鑒定了宣酒釀造微生態系統中高產中性蛋白酶的功能菌株，并應用于細菌麩曲的生產。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

菌株分離材料：宣酒高溫大曲。

試劑與耗材：細菌基因組DNA 快速提取試劑盒，上海捷瑞生物公司。福林酚試劑、碳酸鈉、三氯乙酸、鹽酸、干酪素、葡萄糖、瓊脂粉、牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉、氫氧化鈉、酪氨酸等均為分析純，購于國藥試劑有限公司。

儀器設備：紫外分光光度計，上海菁華科技儀器有限公司；超純水儀（A2S-10-CE），美國艾科浦國際有限公司；水浴鍋，上海精宏實驗設備有限公司；恒溫搖床，上海新苗醫療器械制造有限公司；冰箱，海爾集團。

1.2 培養基

LB 培養基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g；用5 mol/L 氫氧化鈉調pH 值至7.0，用去離子水定容至1 L，115 ℃蒸汽滅菌20 min。

脫脂牛奶培養基：A 液：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，pH 值7.0。B 液：脫脂純牛奶。A 液和B 液單獨滅菌，115 ℃滅菌20 min，9∶1混合均勻后使用。

以上兩種固體培養基配制方法：在液體培養基中添加2%的瓊脂粉。

發酵培養基：葡萄糖30 g，酵母浸膏20 g，磷酸氫二鈉4 g，磷酸氫二鉀0.3 g，用5 mol/L 氫氧化鈉調pH 值至7.0，用去離子水定容至1 L，在115 ℃蒸汽滅菌20 min。

麩曲培養基：麩皮650 g，豆粕粉300 g，稻殼50 g，氫氧化鈉4 g，加水600 mL，115 ℃滅菌25 min。

1.3 試驗方法

1.3.1 高產中性蛋白酶功能菌株的分離與純化

稱取5 g 粉碎后的高溫大曲，加入裝有50 mL無菌水的250 mL三角瓶中，在三角瓶中加入一定量滅菌的玻璃珠，于37 ℃培養箱中振蕩培養30 min。將樣品懸浮液于80 ℃水浴10 min，殺死非芽孢桿菌營養細胞，得到芽孢桿菌懸浮液。吸取1 mL 上述懸浮液于裝有50 mL 營養肉湯培養基的250 mL三角瓶中，37 ℃、200 r/min 培養24 h。將培養好的菌液梯度稀釋6次至10-6，每個梯度菌液吸取100 μL涂布于固體營養肉湯培養基平板，37 ℃培養24 h。挑選不規則，菌落邊緣不整齊且表面粗糙的干燥型單菌落進行純化培養。

1.3.2 高產中性蛋白酶功能菌株的初篩

將單菌落先接種到營養肉湯培養基，37 ℃、200 r/min 培養24 h，之后在脫脂牛奶平板劃線，37 ℃培養24 h。根據菌株在脫脂牛奶培養基平板上產生的透明圈直徑和菌落直徑比值大小，初步評估菌株產蛋白酶能力的高低。

1.3.3 高產中性蛋白酶功能菌株的復篩

挑選脫脂牛奶培養基平板上透明圈直徑和菌落直徑比值較大的菌株接種于裝有10 mL LB 培養基的50 mL 三角瓶中，37℃、200 r/min 培養24 h。將培養的菌液作為種子液以2 %的接種量接種到裝有50 mL 發酵培養基的250 mL 三角瓶中，37 ℃、200 r/min 培養24 h。取1 g 發酵液于50 mL 試管中，加入磷酸鹽緩沖液定容到20 mL，稀釋20 倍，中性蛋白酶活力的測定按照GB/T 23527—2009 所述方法操作[7]。

1.4 高產中性蛋白酶功能菌株麩曲固態發酵

將菌株接種至裝有10 mL發酵培養基的50 mL搖瓶中，37 ℃、200 r/min 培養24 h。將上述培養液作為種子液以10%的接種量接入裝有70 g 麩皮培養基的500 mL 搖瓶中，37 ℃培養48 h。取一定量的培養物稱重并記錄，105 ℃烘干至恒重，然后稱重，計算其含水量。稱取5 g左右的固態培養物，加入200 mL的磷酸鹽緩沖液，稀釋20倍，過濾之后用福林酚法測定蛋白酶活力。

1.5 產物分析

培養物中酸性蛋白酶測定按GB/T 28715—2012所述進行[7]。

1.6 菌株鑒定

利用細菌DNA 提取試劑盒提取菌株染色體DNA，然后送上海生物工程有限公司進行16S rDNA 測序，得到測序結果并進行NCBI 比對分析，確定菌株的種屬類別。16S rDNA 正向引物5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，反向引物5’-TACGGCTACCTTGTTACGAC TT-3’。

2 結果與討論

2.1 高產中性蛋白酶功能菌株的初篩

芽孢桿菌作為產蛋白酶的代表性菌種，且在高溫條件下產生孢子抵御高溫脅迫，所以選擇高溫大曲作為篩選高產蛋白酶功能菌株的材料。高溫大曲中具有典型特征的單菌落接種到脫脂牛奶平板上，利用透明圈直徑和菌落直徑比值(圈徑比)為指標進行初篩，共篩選能夠在初篩脫脂牛奶培養基平板上生長并產生透明圈的菌株339株，其中圈徑比小于3的有141株，介于3～5.5的有192株，大于或等于5.5的有6株，選擇圈徑比大于5.5的菌株進行復篩，6株菌分別命名為XJXJ-001、XJXJ-002、XJXJ-003、XJXJ-004、XJXJ-005和XJXJ-006（表1）。

表1 高溫大曲高產中性蛋白酶菌株初篩

2.2 高產中性蛋白酶功能菌株的復篩

為了驗證初篩得到的6 株菌的產蛋白酶能力，將各個菌株進行發酵培養基發酵實驗。結果如表2所示，其中菌株XJXJ-002 的蛋白酶活力達到115.30 U/g，為所有菌株中最高值，該結果表明，菌株XJXJ-002 產蛋白酶能力在6 株菌中最強。但菌株XJXJ-002 的細胞濃度比其他5 株菌低，但蛋白酶活力最高，可能原因是該菌株利用氮源主要用于生產更多的蛋白酶，而不是用于自身生長繁殖。

表2 菌株搖瓶發酵產中性蛋白酶

表3 菌株搖瓶發酵產中性蛋白酶

用發酵培養基替換種子培養基可能會提高菌株蛋白酶活力，因此將菌株接種到發酵培養基這一方式進行后續發酵實驗。結果如表3 所示，菌株XJXJ-001，XJXJ-002 XJXJ-003，XJXJ-004，XJXJ-005 和XJXJ-006 蛋白酶活力都比更換種子培養基之前有提高，分別提高29.07%、95.91%、166.14%、140.38 %、30.91 %和17.74 %。因為芽孢桿菌生產蛋白酶是和生長偶聯的，所以種子培養基被替換為碳氮源豐富的發酵培養基，有利于菌株生產蛋白酶。由表2 和表3 結果可以得出：（1）在6 株復篩的菌株中，XJXJ-002 產蛋白酶能力最強；（2）更換種子培養基會影響各菌株蛋白酶的產量。

2.3 中性蛋白酶功能菌株麩曲固態發酵實驗

將復篩的6 株菌株分別接種到麩曲固態培養基，進行發酵實驗。結果見表4，固態麩曲發酵條件下蛋白酶產量最高的是XJXJ-002，為256.72 U/g。且測試的6 株菌固態發酵蛋白酶活力均比液態發酵條件下有所提高，表明不同的培養基成分能夠影響菌株產蛋白酶能力。

表5 XJXJ-002的16S rDNA鑒定

XJXJ-002 固態麩曲的顏色呈微黃色、有光澤；香味有濃郁的焦香味、略有氨味；形態上比較疏松柔軟。從感官角度XJXJ-002 固態麩曲達到優質細菌曲的標準。且理化指標正常：細菌總數9.13×108CFU/g，酸度2.58 mmol/100 g 曲。理化指標上，XJXJ-002 固態麩曲也達到優質細菌曲的標準。所以XJXJ-002 菌株應用于固態麩曲生產中具有非常大潛力，并可進一步促進芝麻香型白酒品質的提升。

2.4 菌株16S rDNA鑒定

為了以上篩選的6 株菌進行鑒定，分別提取6株菌株的染色體DNA，送上海生工進行16S rDNA測序，之后將結果進行NCBI 比對分析。菌株XJXJ-002 的比對結果如表5 所示，菌株XJXJ-002SD48 與貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）相似性最高。XJXJ-001、XJXJ-003、XJXJ-004、XJXJ-005 和XJXJ-006 菌株的鑒定結果分別為Bacillus velezensis，解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens），地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

3 結論

本研究以中性蛋白酶活力為篩選指標，以宣酒高溫大曲為目標分離材料，選育了宣酒釀造微生態系統中6 株高產蛋白酶功能菌株，通過分子生物學手段進行了種屬鑒定，并應用于固態麩曲的生產。解淀粉芽孢桿菌XJXJ-002 固態麩曲中蛋白酶活力達256.72 U/g，其他參數也達到優質麩曲標準。解淀粉芽孢桿菌XJXJ-002 在芝麻香型白酒細菌麩曲的生產，以及芝麻香白酒品質的提升方面具有非常大的潛力。